流式细胞仪入门

null流式细胞术简介流式细胞术简介For FCM Training流式细胞术流式细胞术流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量 流式细胞仪系统流式细胞仪系统简介 通过流式细胞仪我们可以得到以下信息 - 相对细胞大小 - 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 - 染色过细胞的相对荧光强度null流式细胞仪的光信号流式细胞仪的光信号散射光信号 荧光信号null1. 散射光信号 前向角散射光（FSC,Forward Scatter） 入射激光的同向散射光信号 细胞相 对大小及其面积。 侧向角散射（SSC, Side Scatter） 入射激光90角的散射光信号 细胞粒度及细胞内相对复杂性。前向角散射光 ——FSC前向角散射光 ——FSCForward Angle Light Scatter侧向角散射光——SSC侧向角散射光——SSC散射光散射光散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异 - 通常使用“散点图”来看散射光信号 - 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据散点图——Dot Plot散点图——Dot Plotlysed whole bloodReview QuestionReview QuestionDead cells are known to be smaller and to exhibit more internal complexity than live cells. Which of the populations on this plot would you expect to be dead?2. 荧光信号2. 荧光信号荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放，转换为 振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子 荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强 荧光检测器荧光检测器Two-Color Cell AnalysisTwo-Color Cell AnalysisWhich of the three populations has the most Ab A binding sites? Ab AAb B双色荧光散点图双色荧光散点图现代流式细胞仪包括现代流式细胞仪包括液流系统 聚焦细胞以供检测 光学系统 激发和收集光信号 电子系统 将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分析 液流系统液流系统液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处Sample Flow in Optical CuvetteSample Flow in Optical CuvetteSampleLaminar FlowLow Sample Flow Rate 12 mL/minSheathSheathSampleLaminar FlowSheathSheathOptical CuvetteHigh Sample Flow Rate 60 mL/minReview QuestionReview QuestionWhich of the following would cause disturbance in the laminar flow of the optical cuvette? bubbles cellular concentration sample flow rate Optics Optics Excitation optics consist of: Lasers Lenses and mirrors that route the laser light to the fluidic stream Collection optics consist of: Filters that direct the signals to the appropriate optical detectorsOptical FiltersOptical Filters460 500 540460 500 540460 500 540SP 500LP 500BP500/50 Longpass Shortpass BandpassFACSCalibur光路图FACSCalibur光路图OpticsOptics488 nm635 nmElectronicsElectronicsConverts analog signals to proportional digital signals Computes Height for each pulse Calculates width and area Interfaces with the computer for data transfer Creation of a Voltage Pulse - Analog SignalCreation of a Voltage Pulse - Analog SignalQuantification of a Voltage PulseQuantification of a Voltage PulseHeight is a measurement for all parameters. Width = Area/Height Effect of the Instrument Controls on the DataEffect of the Instrument Controls on the DataInstrument Controls DetectorFSC detector 250 gainFSC detector 350 gainReviewReview Data ProcessingReview QuestionsReview QuestionsWhich of the following fluorochromes cannot be used with the FACSCalibur? DAPI (ex. 345 nm, emits 455 nm) Propidium Iodide (ex. 536 nm, emits 617 nm) Alexa Fluor 647 (ex. 650 nm, emits 668 nm) What are the three measurements of a particle that can be determined by FACSCalibur? Briefly describe the functions of the fluidics, optics, and electronics systems. Review QuestionsReview QuestionsWhat would happen to the population below if you increased the Red parameter value in the Instrument controls? Review QuestionsReview QuestionsWhich instrument components ensure that the fluorescence signal of a specific fluorochrome is only measured by a designated detector? For example, APC is only measured by the FL4 detector. 样本处理样本处理细胞悬液的制备细胞悬液的制备细胞悬液： 分离PBMC、PRP等：操作复杂，分离、离心步骤导致细胞特定群体丢失，并可能引入某些误差 直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本用血量小 灌洗液、体腔积液 培养细胞、细胞系 实体组织： 病理组织：新鲜样本/石蜡包埋样本 针吸组织：新鲜样本 鞘液、洗液等：清洁无颗粒杂质步骤一： 选择合适的荧光染料步骤一： 选择合适的荧光染料 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内 荧光素光谱的重叠应当尽量减少荧光产生过程荧光产生过程Propidium IodidePropidium Iodide400 nm500 nm600 nm700 nmPIDNAExcitationEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nmFluorescein (FITC)Fluorescein (FITC)400 nm500 nm600 nm700 nmWavelengthProteinExcitationEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nmPhycoerytherin (PE)Phycoerytherin (PE)ExcitationEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nmProteinAllophycocyanin (APC)Allophycocyanin (APC)Protein632.5 nm (HeNe)ExcitationEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm FITC和PE荧光光谱 FITC和PE荧光光谱 补偿模型图 补偿模型图 null补偿调节前后对比FL1FL2步骤二： 染色步骤二： 染色 体积 温度 孵育时间 对照直接染色直接染色Fluorescent probe attached to antibody Specific signal: weak Nonspecific binding: low间接染色间接染色Fluorescent probe attached to a 2nd antibody Specific signal: strong, 5-6 2nd Ab/each 1st Ab; Nonspecific binding: highAvidin-Biotin method IAvidin-Biotin method Ibiotinylated primary Abbiotinavidinbiotinylated dye示意图示意图步骤三： 数据收集和分析步骤三： 数据收集和分析 画图 寻找目标细胞 调整仪器设置到合适的状态 我们可以得到怎样的结果？它们意味着什么？null仪器设置调节1. 用未染色细胞调整仪器PMT电压2. 用单染色的细胞调节仪器补偿关于同型对照关于同型对照例：一个双色染色的实验 抗体A FITC，抗体B PE 对应的同型对照是IgG1 FITC,IgG1 PE 那么需要准备的是 阴性对照：细胞加上IgG1 FITC,IgG1 PE 单阳性对照： FITC: 细胞加上Ab A FITC, IgG1 PE PE: 细胞加上Ab B PE, IgG1 FITC 数据分析数据分析设门 设定阴性与阳性群体的界限 确定阳性与阴性细胞群体 统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数null如何设定阴性与阳性的界限nullnull直方图直方图散点图散点图null细胞结构 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 染色体分析细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 细胞凋亡在上述信号基础上的细胞分选流式细胞术的细胞学应用流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病流式细胞仪的科研应用流式细胞仪的科研应用免疫功能研究 癌症病人的多药耐药性 细胞动力学功能研究 动物性别筛选 海洋与环境微生物分析 染色体分选null流式细胞仪的遗传学应用细胞DNA, RNA 含量的测定 染色体倍体分析 染色体分离 基因表达产物的生物活性研究 基因转染表达的生物效应 基因表达调控研究 细胞内基因定位 酵母转基因株的筛选 基因的定性定量检测 植物遗传学研究 •••••• Flow Cytometry Flow Cytometry in clinics and researchWhat can Flow Cytometer tell us about a cell?What can Flow Cytometer tell us about a cell?细胞增殖（细胞周期）细胞增殖（细胞周期）细胞内DNA含量 增殖相关基因的表达 BrdU的结合 示踪染料nullDNA 探针DNA探针最主要的特点是，它们与DNA含量是成化学正比关系的——这样，带有的探针荧光分子的数目就和DNA分子的含量相当，从而检测DNA含量null Nucleic acid Probes菲啶基 Propidium Iodide Ethidium Bromide 苯甲亚胺 Hoechst 33342 抗生素 Mithramycin, Chromamycin A3 Acridine Orange - AO Pyronyn Y Normal Cell Cycle Normal Cell Cycle G2MG0G1s0 200 400 600 8001000sDNA AnalysisDNA contentCountnullA typical DNA HistogramG0-G1SG2-MFluorescence Intensity# of Events红色为正常二倍体细胞；黄色为异倍体细胞红色为正常二倍体细胞；黄色为异倍体细胞nullnull 增殖相关基因PCNA(Proliferating cell nuclear antigen) 一种蛋白质，在DNA复制和核苷酸的切除修复中起到作用 Ki-67 - proliferation related antigen Ki-S1 - proliferation related antigen Phospho-histone Cyclin D1, E, A, B1 BrdUrd Incorporation BrdUrd IncorporationBromodeoxyuridine (BrdU) 是一个胸腺核苷的类似物 能够在细胞增殖和细胞周期状态分析中起作用 BrdU能与正在复制周期内的细胞相结合 使用BrdU抗体能够检测到BrdU BrdUrd Incorporation BrdUrd Incorporation 细胞分裂的分析 细胞分裂的分析 哺乳动物的免疫系统需要有大量的增殖，能够确保抗原特异性的T细胞和B细胞具有足够的增殖速度，能够对付治病生物造成的感染 CFSE是一种示踪染料，能够均等地在两个子代细胞中分布，其结果可以区分出8-10代的子细胞。 Tracing Dye(CFSE)Tracing Dye(CFSE) Apoptotic Cell Death -- a genetically encoded cell death program, which is morphologically, biochemically and molecularly distinct from necrosis Apoptotic Cell Death -- a genetically encoded cell death program, which is morphologically, biochemically and molecularly distinct from necrosisFlow cytometry of apoptotic cell deathFlow cytometry of apoptotic cell death细胞散射光 在细胞调亡中，细胞收缩，从而FSC下降，SSC上升或是没有明显变化nullFlow cytometry of apoptotic cell deathFlow cytometry of apoptotic cell death 荧光吸收 细胞的胞膜对于DNA染料的通透性和细胞的活性、死亡和凋亡相关，像PI、EB、Hoechst-33342等，可以用来区分活细胞、死细胞和凋亡细胞Flow cytometry of apoptotic cell deathFlow cytometry of apoptotic cell deathFCM of Caspases 通过抗体和活化的caspase-3片断相结合来检测 使用特异性的caspase-3荧光底物 新的抗原决定基CK18 nullFlow cytometry of apoptotic cell deathFlow cytometry of apoptotic cell death线粒体功能的变化 TMP会在调亡中产生，可以通过一些标记用流式细胞仪检测。使用有膜穿透性的亲脂性阳离子荧光染料，如Rh123, DiOC6, JC-1,CMXRos等，可作为流式检测的探针。 当细胞发生调亡时，一个线粒体膜表面蛋白——7A6抗原会出现 Bcl-2/bax family of proteins. nullnullFlow cytometry of apoptotic cell deathFlow cytometry of apoptotic cell death 钙离子流和 pH值变化 胞浆内Ca2+ 水平的上升和由于细胞内环境酸化造成的选择性的pH值的调节降低是伴随着细胞凋亡产生的后果之一。 使用Ca2+ 选择性荧光探针，如 Quin-2, Fluo-3, Indo-1 通过流式检测是测定细胞内Ca2+浓度的最佳 酸化的检测同样可以用对pH敏感的荧光探针，如 DCH, BCECF, BCECF-AM, SNAFLs, SNARFs等进行检测 nullFlow cytometry of apoptotic cell death Phospholipid redistributionnullFlow cytometry of apoptotic cell deathFlow cytometry of apoptotic cell death DNA 链的断裂 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些Caspase的底物）在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。 断裂的末端可以通过末端转脱氧核苷酰酶(TdT)连接上dUTP。nullnullnullFlow cytometry of apoptotic cell deathFlow cytometry of apoptotic cell death 细胞DNA含量 在凋亡细胞中，用PI染色，通过流式检测DNA含量，可以发现一种亚群的细胞，其染色荧光强度下降。这是由于随着调亡的进行，核酸内切酶活化，随后一部分DNA泄漏出去，造成细胞内DNA含量下降造成的。nullFlow Cytometry of Apoptotic Cells An Integrated Approach to Cell Immunology An Integrated Approach to Cell ImmunologyImmune Function assay Immune Function assay 免疫细胞亚群检测 Antigen-peptide specific T cells 检测 T-cells 活化 Treg Cells 细胞内细胞因子/趋化因子检测 磷酸化淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析根据功能，淋巴细胞主要分为 B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关 T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关 总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NK细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能， 能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。 淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析根据CD4、CD8表达，T淋巴细胞又分为 T辅助/诱导细胞（CD3+CD4+） T抑制/细胞毒性细胞（CD3+CD8+） Th/Ts 那些自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态，此外，这一比值还可用来监测骨髓移植病人以免受到急性GVHD的攻击 Th/Ts升高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、SLE） Th/Ts降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血 nullTraditional Analysis -- Percent positiveTraditional Analysis -- Percent positivePositive cellNegative Cell CD4 PECD4 PEAbsolute Counts -- Cells per mLAbsolute Counts -- Cells per mLPositive CellAbsolute Count BeadsNegative CellCD4 PECD4 PE抗原特异性T细胞抗原特异性T细胞提供检测者一个强有力的工具用于研究对病毒抗原的免疫应答和疫苗的开发MHC: Class I and Class II Gene ProductsMHC: Class I and Class II Gene ProductsT cell受体不直接和可溶性抗原相连 抗原必须通过MHC由抗原呈递细胞传递给T细胞 (Macrophages, Dendritic cells, B cells) MHC Class I Gene Products 呈递抗原给 CD8+ T cells 诱导细胞毒应答 MHC Class II Gene Products 呈递抗原给 CD4+ T cells 诱导细胞因子产生，免疫球蛋白的分泌 MHC/TCR Signaling MHC/TCR Signaling二聚体可溶性MHC类似物与四聚体的比较二聚体可溶性MHC类似物与四聚体的比较Quantitation of antigen-specific T lymphocytes in peripheral bloodQuantitation of antigen-specific T lymphocytes in peripheral blood HAMControlHIVCD8Tax-A2/IgGag-A2/IgTreg细胞的检测Treg细胞的检测Treg细胞与自身免疫耐受相关，通常的检测方法用CD4阳性细胞中CD25高表达，同时结合胞内FoxP3含量来判断 最新发现人的Treg细胞低表达CD127。CD127的表达模式与Foxp3很接近，说明低表达CD127，高/中表达CD25的CD4阳性的T淋巴细胞就是Treg细胞（调节性T细胞）。该方法比胞内检测Foxp3的优点在于，检测后的细胞可用于后续的培养及其他的体外试验。另外的优点是用这种检测方案分选的Treg细胞得率更高。 nullImmune Function Assays -- A Powerful Research Tool for Answering Basic Biological Questions in...Immune Function Assays -- A Powerful Research Tool for Answering Basic Biological Questions in...AIDS或癌症机理的研究 T cell亚群对于病毒和细菌抗原的反应 细胞介导的对机会感染的免疫反应 药物/疫苗的效果评价 免疫调节 移植监控 毒理研究 nullnullnullnullTraditional Cytokine Flow CytometryIL-2 PhycoerythrinCD4 FITC细胞因子检测细胞因子检测细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞免疫功能调节方面发挥重要作用。细胞因子可以调节多种细胞的生长、分化和功能，调节正常与病理状态下的免疫应答，研究生理或病理免疫调节因素所致细胞因子合成的应答与改变是研究疾病病因与免疫状态的重要工具。 T细胞的细胞因子分型T细胞的细胞因子分型Ⅰ型细胞介导免疫反应 引起迟发过敏反应、巨噬细胞活化、2型反应下调 刺激来源：病毒、某些细菌 Ⅱ型体液介导免疫反应 引起B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、1型反应下调 刺激来源：多细胞寄生虫、过敏源 细胞因子细胞因子Biological Variation Among CMV-seropositive Donors in Response to CMVBiological Variation Among CMV-seropositive Donors in Response to CMVCFC & ProliferationCFC & Proliferation 使用温和的方法进行细胞破膜和固定，在中性pH值条件下，使细胞和BrdU结合，可以同时检测到： S期 细胞周期 表型 活化状态 核型决定基 胞浆内决定基 细胞因子/趋化因子 其他………….. CFC & ProliferationCFC & ProliferationAllows the correlation of: Phenotype Cytokine expression Cell Cycle ProliferationBD Phosflow磷酸化检测系统BD Phosflow磷酸化检测系统更好的特异性的抗体 建立在单个细胞基础上的检测 可以同时检测多个参数 快速、灵敏、样本量更少 磷酸化特异性和非磷酸化特异性抗体的差异PPYYYY非磷酸化特异性抗体 •检测全部的相关蛋白 unphosphorylated + phosphorylated亚型 • 抗原：重组的蛋白质片断 磷酸化特异性抗体 • 仅仅检测磷酸化亚型 • 抗原：合成的 4-10mer磷酸化肽段Y磷酸化特异性和非磷酸化特异性抗体的差异BD PhosFLOW和Western blot 的比较BD PhosFLOW和Western blot 的比较A theoretical experiment comparing Western blot and flow cytometry with three samples and a protein of interest at 1, 10, or 50 copies per cell. Sample 2 and 3 look the same via Western blot, but when stained with fluorescently labeled antibodies, the differences between the samples become more relevant. (Source: P.O. Krutzik et al. / Clinical Immunology 110 (2004) 206–221)BD PhosFlowBD PhosFlowGenomics & Proteomics -- Single Cells Have Big Proteomics Story to Tell. BD PhosFlow not only tells you activation of a single cell for one particular phospho protein and pathway, but allows you to study multiple phosphorylation events and pathways simultaniously.nullCD20 PerCP-Cy5.5CD3 PE Zap70 (Y319)/Syk (Y352) Alexa 647 CD3 PE CD3-/CD20+ CD3+/CD20- CD3-/CD20-CD20 PerCP-Cy5.5Whole Blood CD3 CrossLink Multi-Color PhosFlow in CD3/CD28 or CD3 crosslinked human PBMCs or Whole BloodCD3/CD28 CrosslinkUntreated cells (unshaded) vs treated cells (shaded)BD CBABD CBA 一种“三明治”免疫测定法—— 使用结合有高亲和性抗体的小球，用来特异性地捕获可溶性的抗原. 用荧光检测抗体来检测被捕获的抗原 使用流式细胞仪进行检测分析 nullMultiplexed BeadsMultiplexed BeadsShades of a colorAntibody coupled beads, emitting at distinct FL3 intensitiesVarious analytesAntibody coupled PE label, emitting at FL2 intensity proportional to analyte conc.Multiplexed BeadsMultiplexed Beads0 pg/mL80 pg/mL1250 pg/mL5000 pg/mLFL3 Beads FL2 (PE)使用 BD™ Cytometric Bead Array (CBA) 系统你可以: 使用 BD™ Cytometric Bead Array (CBA) 系统你可以: • 从单一小体积样本中得到多项检测结果 • 对所有的检测项目，只需要制备一个混合物来绘制标准曲线 • 避免人为造成的酶联放大的假阳性信号产生 • 用更少的时间和精力，却得到大量的结果 • 如果是用488nm和635nm两根激光器来实验，实验条件更容易建立 • 使用配有HTS选件的BD流式细胞仪可以做到自动平板上样和高通量检测目前CBA主要提供的检测内容目前CBA主要提供的检测内容可溶性细胞因子 细胞凋亡相关蛋白 磷酸化蛋白BD CBA Flex SetBD CBA Flex SetOld Format BD CBA BeadsBD CBA Flex Set Beads更为灵活强大的CBA Flex Set更为灵活强大的CBA Flex Set最多可同时检测72个项目 可自由选择搭配检测项目 检测项目范围更广泛 需要488nm和635nm两种波长的激光器 9个指标同时检测活化T细胞9个指标同时检测活化T细胞1234567891. Itk (Y511) 2. ERK (T202/Y204) 3. JNK (T183/Y185) 4. P38 (T180/Y182) 5. PLCg (Y783) 6. ZAP70 (Y319) 7. LAT (Y171) 8. c-Jun (S63) 9. RSK (S380)Kinetics of Jurkat Cell Activation With Anti-CD3/CD28Kinetics of Jurkat Cell Activation With Anti-CD3/CD28110100FOLD INCREASE IN UNITS/ML05101520TIME (MINUTES)RSK (S380)Jun (S63)LAT (Y171)Itk (Y511)ZAP-70 (Y319)PLCg (Y783)P38 (T180/Y182)JNK (T183/Y185)ERK (T202/Y204)P-Specific AntibodiesMonitoring the T Cell Activation Pathway by CBA (Control)Monitoring the T Cell Activation Pathway by CBA (Control)RSKCells were activated with anti-CD3/CD28 for 2 minutes. SDS was added to a final concentration of 1% and the material was placed in a boiling water bath for 5 minutes.Monitoring the T Cell Activation Pathway by CBA (PD-98059)Monitoring the T Cell Activation Pathway by CBA (PD-98059)Jurkat cells were pre-incubated with 200 mM PD-98059 (MEK inhibitor) for 20 minutes before being activated activated with anti-CD3/CD28 for 2 minutes. SDS was added to a final concentration of 1% and the material was placed in a boiling water bath for 5 minutes.Monitoring the T Cell Activation Pathway by CBA (PP2)Monitoring the T Cell Activation Pathway by CBA (PP2)Jurkat cells were pre-incubated with 10 mM PP2 (Src family kinase inhibitor) for 20 minutes before being activated activated with anti-CD3/CD28 for 2 minutes. SDS was added to a final concentration of 1% and the material was placed in a boiling water bath for 5 minutes.FCM in Molecular BiologyFCM in Molecular Biology流式检测分子表型 特异的核酸序列 SNP 端粒长度 荧光报告蛋白检测基因表达情况Fluorescent ProteinsFluorescent ProteinsDsRed ZsYellow HcRed AmCyan端粒长度的检测端粒长度的检测端粒的长度和端粒酶的活性是现在研究的重点。因为它们被发现和细胞复制以及一些疾病的变化相关。 可以通过FISH，用带有荧光的核酸探针标记上端粒序列，通过流式细胞仪检测端粒的长度流式分选应用举例流式分选应用举例自然杀伤细胞分选自然杀伤细胞分选基因转染细胞的分选基因转染细胞的分选绿色萤光蛋白分析（GFP）：左图显示Hela细胞转染了减毒Mengo病毒vM16，其中含转染后8小时与病毒L肽链融合的GFP。直方图显示59％细胞表达该肽链，并显示不同的表达水平。重叠的红线表示阴性对照。 AND…….AND…….肿瘤细胞分选 特异性T淋巴细胞分选 白血病细胞分选