猪链球菌对大环内酯类药物的耐药机制

硕士学位 猪链球菌对大环内酯类药物的耐药机制 及MefA-MsrD 基因的全序列 李 英 霞 指导教师 王丽平 副教授 专业名称 基础兽医学 研究方向 细菌耐药 答辩日期 二○○九年六月 STUDY ON MECHANISM OF STREPTOCOCCUS SUIS AGAINST MACROLIDES AND THE ANALYSIS OF MefA-MsrD GENE SEQUENCE By Li Yingxia Supervised by: Wang Liping Associate Prof. A THESIS Submitted to Nanjing Agriculture University In Partial fulfillment of the requirements For Master Degree Of Veterinary Medicine Completed in June, 2009 Commencement in June, 2009 原 创 性 声 明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者（需亲笔）签名： 年 月 日 学位论文版权使用授权 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。 保密□，在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密□。 （请在以上方框内打“√”） 学位论文作者（需亲笔）签名： 年 月 日 导师（需亲笔）签名： 年 月 日 目 录 I摘 要 IIIABSTRACT V缩略词表 VII引 言 1第一章 文献综述 11 国内外猪链球菌对大环内酯类药物耐药状况 32 猪链球菌对大环内酯类药物耐药机制的研究 32.1 甲基转移酶Erm家族催化的甲基化引起的耐药 42.2 主动外排系统介导的耐药 62.3 核蛋白变异 73 四环素耐药基因tetM、tetO与ermB、mefA关系的研究 94 大环内酯类药物研究进展 12参考文献 19第二章 临床分离猪链球菌对大环内酯类抗生素的耐药性和耐药表型 201 材料与方法 201.1 菌株 201.2 培养基 201.3 药物 211.4 试验方法 212 结果 212.1 临床分离猪链球菌对大环内酯类等10种药物的敏感性 232.2 猪链球菌对MLS类抗生素耐药表型 243 讨论 26参考文献 29第三章 临床分离猪链球菌中大环内酯类和四环素类耐药基因的分布 291 材料与方法 291.1 材料 301.2 方法 302 结果 302.1 大环内酯类、四环素类相关耐药基因的检测 332.2 猪链球菌对大环内酯类抗生素的基因表型和耐药表型的相关性 342.3 耐药基因序列比对及同源性分析 343 讨论 343.1 大环内酯类抗生素耐药基因检测 353.2 四环素耐药基因的检测 353.3 四环素耐药和大环内酯类抗生素耐药的关系 参考文献 36 40第四章 临床分离与体外诱导猪链球菌对大环内酯类药物耐药机制的差异 411 材料与方法 411.1 材料 411.2 方法 422 结果 422.1 体外人工诱导猪链球菌耐药菌株及对7种抗生素的敏感性 422.2 临床分离及体外诱导耐药菌株红霉素耐药基因的检测 432.3 临床分离与大环内酯类药物体外诱导猪链球菌耐药菌株突变基因的扩增 452.4 利血平对临床分离和体外诱导耐药菌株MIC的影响 453 讨论 48参考文献 52第五章 介导猪链球菌耐药的mefA基因在猪链球菌中的定位 531 材料与方法 531.1 试验材料 531.2 方法 552 结果 552.1 mefA基因测序 552.2 mefA基因上游序列的获得 562.3 mefA-msrD基因序列的获得 562.4 msrD基因下游序列的获得 60参考文献 62全文结论 63致 谢 攻读硕士期间论文发表情况……………………………………………………………65 猪链球菌对大环内酯类药物的耐药机制 及MefA-MsrD基因的全序列分析 摘 要 目的：对临床分离的48株猪链球菌进行耐药性筛选；检测临床分离48株猪链球菌中大环内酯类及四环素类抗生素耐药基因的分布；分析临床分离的耐药猪链球菌与体外诱导耐药菌株的耐药机制的差异；对临床分离的4株含有mefA基因的猪链球菌中的mefA 基因进行定位，并对其上下游未知序列进行分析。方法：采用微量稀释法测定10种药物对临床分离的48株猪链球菌的体外最小抑菌浓度（MIC）及改良双纸片法测定了48株菌对大环内酯类抗生素的耐药表型；建立PCR检测方法对分离菌株中大环内酯类耐药基因ermA/B/C、mefA、msrD、mphB、23S rRNA、L4、L22和四环素类耐药基因tetM、tetO、tetL、tetK及与Tn916转座子相关的int和xis基因进行检测；采用stepwise方法对敏感菌进行红霉素、泰乐菌素、阿奇霉素体外诱导耐药；建立PCR检测方法检测体外诱导耐药菌株耐药基因ermB、ermA、ermC、mefA、msrD、mphB的分布及扩增23S rRNA及核糖体蛋白L4及L22；测定利血平存在的条件下，大环内酯类药物对临床分离和体外诱导耐药菌株MIC的影响；采用DNA Walking (染色体步移技术)的方法获mefA基因的相邻未知序列并将所获得的序列进行拼接并在NCBI上进行分析。结果：猪链球菌对红霉素、泰乐菌素、替米考星及阿奇霉素的耐药率分别达33.33 % (16/ 48) 、27.08% (13/ 48) 、27.08% (13/ 48)和33.33 % (16/ 48)；对青霉素、氨苄西林、阿莫西林、头孢曲松钠、头孢喹肟均敏感，对四环素均耐；16株红霉素耐药菌株中，以内在型耐药表型为主，占 75 % (12/16)，菌株MIC为≥128 mg·L-1；M型占 25 % (4/ 16)，大部分菌株MIC范围为1 mg·L-1；未检测到诱导型耐药表型；耐药基因主要以ermB为主，占75％（12/16），mefA和msrD占25％（4/16），16株耐药菌株中，tetM、tetO、int、xis的检出率分别为31.25％（5/16）、62.5％（10/16）、31.25％（5/16）和31.25％（5/16），没有检测到ermA/C、mphB、tetL、tetK。所有耐药菌株也均未检测到核糖体23Sr RNA，核糖体蛋白L4和L22突变；体外诱导的耐药菌株均未检测到大环内酯类药物耐药基因，耐药机制的产生主要是23S rRNA的位点A2061G、C2614A、A2062C及A2065C发生突变；核糖体蛋白L4的67-68之间插入S、Q及69-72位点插入W、P、Q、K和Q67R、K68T、R73G的突变；核糖体蛋白L22的84-86位点上发生3个氨基酸的缺失及K87Q突变引起的；在利血平存在的条件下，红霉素和阿奇霉素对具有mefA-msrD基因的耐药菌MIC会发生变化；泰乐菌素及替米考星对泰乐菌素诱导的具有L22氨基酸缺失的两株耐药菌株的MIC有明显变化；经DNA Walking测序，共得到5305 bp的基因片段，进一步分析显示mefA基因位于染色体DNA上，大小为1218 bp，下游为msrD基因，大小为1464 bp。在5305 bp的片段中，共包括7个开放阅读框。 关键词：猪链球菌；耐药性；耐药表型；耐药基因；临床分离菌株；体外诱导菌株mefA基因定位 STUDY ON MECHANISM OF STREPTOCOCCUS SUIS AGAINST MACROLIDES AND THE ANALYSIS OF MefA-MsrD GENE SEQUENCE ABSTRACT Objective: To select the resistant strains in 48 clinical Streptococcus Suis isolates and investigate the distribution of macrolide and tetracycline resistance genes of 16 clinical Streptococcus Suis isolates. Different mechanism was analyzed accounting for macrolide resistantance in Streptococcus suis resistant strains selected in vitro by macrolide passage and isolated from clinic. To locate the mefA gene of four Streptococcus suis resistant strains isolated from clinic and analyze the upstream and downstream sequence of this gene. Methods: A total of 48 clinical isolates of Streptococcus suis were examined for their susceptibility to 10 antibiotics by microdilution test and the phenotypes of strains resistance to erythromycin were also evaluated by the improved double disk test with erythromycin and clindamycin discs on MH plates. PCR was used to detect the macrolide resistance genes ermA, ermB, ermC, mefA, msrD, mphB, 23S rRNA, L4, L22, tetracycline resistance genes tetM, tetO, tetL, tetK as well as transposon related genes int, xis. Stepwise method was applied to induce sensitive strains resistant to erythromycin, tylosin and azithromycin resistance in vitro. PCR was used to detect the macrolide resistance genes ermB、ermA、ermC、mefA、msrD、mphB and to amplify 23S rRNA and ribosomal protein L4 and L22 of Streptococcus suis resistant strains selected in vitro by macrolide passage. The MIC changes of macrolides with or without reserpine were detected in parent strains and induced-resistant strains. The methods of DNA walking was used to obtain the unknown sequence adjacent to mefA gene and all sequences was connected and analyzed on NCBI. Results: The rate of resistance to erythromycin, tylosin, tilmicosin and azithromycin were 33.33 % (16/ 48), 27.08% (13/48), 27.08% (13/ 48) and 33.33 % (16/ 48), respectively. All clinical isolates of Streptococcus suis were sensitive to penicillin, ampicillin, ceftriaxone sodium, amoxicillin, and cefquinome, resistance to tetracycline. MLSB, M phenotypes were detected in 75 % (12/16), 25% (4/16) in erythromycin resistant strains，and the MIC was ≥128 mg·L-1 and 1 or 64 mg·L-1, respectively. None of inducible resistance phenotype was detected. In 48 S. suis strains, 16 strains were resistant to macrolides. 12 of 16 resistant strains were positive to ermB gene with the rate of 75% (12/16), which is responsible for macrolide resistance. In four strains both mefA and msrD genes were detected. Of sixteen macrolide resistant strains, the detection rates of tetM, tetO, int, xis were 31.25%（5/16）, 62.5%（10/16）, 31.25%（5/16）and 31.25%（5/16）respectively. All of the macrolide resistant strains were negative to ermA/C, mphB, tetL, tetK and didn’t find the mutation of 23S rRNA, L4 and L22. The macrolides resistant genes were not detected in all induced-resistant strains, the resistant mechanism in all induced-resistant strains were mainly due to the mutations of A2061G、C2614A、A2062C and A2065C of 23S rRNA, the ribosomal protein L4 was inserted two amino acids(S、Q) between 67and 68, four amino acids between 69 and 72, and mutated at Q67R、K68T、R73G, and the position of 84-86 of ribosomal protein L22 were deleted three amino acids, meanwhile mutated at position of K68T. The MICs of tylosin and tilmicosin were changed evidently with reserpine in tylosin induced-resistant strains with L22 amino acids deletion, while the MICs of erythromycin and azithromycin could be decreased by reserpine in mefA-msrD positive strains. The amplified sequence was 5305bp with method of DNA walking including seven ORF, the analysis of this sequence suggest that mefA gene with the total length of 1218 bp was located on chromatosome DNA. The downsream of mefA gene was msrD gene with the total length of 1464bp. KEY WORDS: Streptococcus Suis; resistance; phenotypes of resistance; resistant gene; strains isolated from clinic; strains selected in vitro; mefA gene location 缩略词表 英文缩写 英文全称 中文全称 ERM Erythromycin ribosome methylation 红霉素核糖体甲基化 MLSB Macrolide-lincosamide-streptogramin B 大环内酯-林可霉素-链阳菌素B MEF Macrolide efflux 大环内酯类药物外排基因 MEGA Macrolide efflux genetic assembly 大环内酯外排基因集合体 ORF Open reading frame 开放读码框 ERY Erythromycin 红霉素 TET Tetracycline 四环素 TYL Tylosin 泰乐菌素 TIL Tilmicosin 替米考星 AZI Azithromycin 阿奇霉素 cMLSB Constitutive macrolide-lincosamide-streptogramin 内在型耐药 iMLSB Inducible macrolide-lincosamide-streptogramin 诱导性耐药 bp Base pair 碱基对 CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute 临床检验标准委员会 MIC Minimal inhibitory concentration 最小抑菌浓度 ATCC American type culture collection 美国标准菌株收藏中心 S. suis Streptococcus suis 猪链球菌 引 言 猪链球菌2型是新发的人兽共患病病原，可致猪败血症、肺炎、脑膜炎、关节炎及心内膜炎，由该菌引起的猪链球菌病在所有养猪业发达的国家均有报道，并引起广泛流行。该病还可通过特定的传播途径感染人类引发严重的链球菌中毒性休克综合征，病程凶险，病死率高。1998年在江苏和2005年在四川大范围暴发引致猪和人死亡的急性传染病，经诊断均是猪链球菌2型(SS2)感染所致。现今关于猪链球菌的研究多集中在对其毒力因子的探讨，以期阐明猪链球菌的感染机制并从相关的毒力因子入手，开发新型有效疫苗控制该病的发生。 但是猪链球菌临床发病的现状表明，迄今控制猪链球菌病仍缺乏有效的疫苗和敏感的诊断方法，一旦发病仍靠化疗药物进行治疗。青霉素、大环内酯类抗生素、喹诺酮类抗菌药是猪链球菌感染的有效治疗药物。尤其大环内酯类药物，除对革兰氏阳性菌有较强的抗菌活性外，毒副作用和不良反应比氨基甙类、四环素类和多肽类等抗生素低，又无青霉素类抗生素的严重的过敏反应，因此极受临床重视。而且大环内酯类免疫抑制剂的开发，更为大环内酯类药物增添了新亮点。但随着抗菌药物的广泛使用，尤其是畜牧业养殖中，大量的抗菌药被用于治疗感染疾病、促进动物生长而添加于饲料中，使得猪链球菌的耐药现象也日趋严重。近年来，很多国家及地区相继报道了对上述药物耐药的猪链球菌株，更为严峻的是多药耐药菌株的出现，对猪链球菌病的治疗造成很大威胁。故深入系统地了解猪链球菌的耐药机制及如何解决多重耐药性问题己成为目前猪链球菌的主要研究热点之一，而目前对猪链球菌耐药机制的研究仍处于初级阶段。 大环内酯类药物是治疗革兰氏阳性菌感染非常有效的药物，在人医、兽医临床中应用都非常广泛，但近年来报道很多细菌诸如肺炎球菌，金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、弯曲杆菌、猪链球菌等对其都产生了耐药性。肺炎球菌、金黄色葡萄球菌对大环内酯类抗生素耐药机制的研究比较深入，耐药机制除了靶位改变（由甲基转移酶Erm介导和23S rRNA及核糖体蛋白L4、L22突变）以外，近年来发现革兰氏阳性菌对大环内酯类抗生素耐药性的迅速传播和蔓延与主动外排泵相关，主要是属于易化子超家族的Mef或ABC型转运子超家族的Msr。 基于国内外目前对猪链球菌耐药机制的研究现状，借鉴其它细菌的研究成果，周密分析该工作假说的可行性，本试验拟对2005-2007年从江苏、四川等地猪场和医院分离的48株临床分离的猪链球菌进行耐药性检测，采用逐步递增药物浓度的方法人工诱导大环内酯类抗生素耐药菌株，比较临床分离耐药菌株和体外诱导耐药菌株的耐药机制差异，阐明主动外排泵在猪链球菌对大环内酯类抗生素耐药中的作用及主动外排泵基因在猪链球菌中的定位，为进一步研究主动外排泵在猪链球菌中的表达、调控和功能的研究提供基础，并为临床合理用药、耐药性控制及新药物开发提供理论依据。 第一章 文献综述 1国内外猪链球菌对大环内酯类药物耐药状况 猪链球菌病是由猪链球菌引起的一种重要人畜共患病，该病呈世界性分布。自1945年Bryante报道在母猪和仔猪发生的一种由链球菌引起的败血症传染病流行，1952年荷兰Jansen和1954年英格兰Field等报道了仔猪链球菌病后，欧洲各国、澳大利亚、巴西及亚洲东部地区相继报道猪链球菌病的发生。我国吴显硕（1949年）最早于上海市郊发现了猪败血型链球菌病的散发病例，而猪链球病较大面积的流行始于1963年广西部分地区，随后广东、福建、四川、安徽等省的部分地区都有发生本病的报道。猪链球菌按其荚膜多糖抗原特性可将其分成35个荚膜血清型，即1~34和1/2型。毒力最强的依次是2型、1型、9型和7型，对猪和人致病性较强的猪链球菌主要是1型、2型、1/2型、7型和9型。猪链球菌2型是流行最广、致病性最强的血清型[1,2]。20世纪90年代以来猪链球菌2型已成为我国引起人畜共患病的重要新病原菌[3]。 猪链球菌可以通过特定的传播途径感染人，引起人的败血症、心内膜炎、脑膜炎[4,5]。自1968年，丹麦学者首次报道了人感染猪链球菌导致脑膜炎的病例后，香港、英国、加拿大、德国、法国和瑞典也陆续报道了人感染猪链球菌的病例。1998年，猪链球菌病在我国江苏省部分地区引起大面积暴发流行，致使25人感染，并有14人死亡。2005年6月至8月在四川省资阳、内江等部分地区相继发生人感染猪链球菌病疫情，发病人数204例，死亡38人[6]。从病人中分离出来的菌株主要为2型猪链球菌。人感染猪链球菌病引起的疾病虽为感染性疾病，但尚未发现人传人的现象[7,8]。 目前猪链球菌病可以使用疫苗预防，发病时可以采用抗生素治疗。但近年来，由于抗生素的普遍滥用，如在动物饲料中长期添加抗生素用于促进生长及预防和治疗疾病、发生疾病后未经兽医诊断就盲目大量使用多种抗生素等，使细菌获得了耐药性，从而对原有的抗生素失去作用，导致动物细菌病难以控制。猪链球菌的血清型较多，其间的交叉免疫保护作用也不确定，再加上猪链球菌具有较强的地域性，即使同一地区的不同菌株也有明显的差异，因此本病很难彻底根除。临床中猪链球菌病的治疗主要采用青霉素、大环内酯类抗生素和氟喹诺酮类抗菌药。由于治疗链球菌的首选药物青霉素的耐药性及其过敏性问题，做为替代品的的大环内酯类药物被广泛用于人医和兽医临床。使得猪链球菌的耐药现象也日趋严重。 王丽平等[9]的研究结果表明，1998-2003年从上海、江苏、广东等地分离的65株猪源链球菌以耐药菌为主，且96.6%的菌株呈多重耐药，对大环内酯类药物的耐药率在53.8%-67.7%之间。李晓云等[10]测定了大环内酯类药物对东北地区分离的28 株猪链球菌的最小抑菌浓度，结果显示猪链球菌对红霉素、阿奇霉素和泰乐菌素的耐药率分别为92.8%、92.8%和89.3%；姜成刚[11]对河南、黑龙江、辽宁、广州、上海、湖北、湖南、山东及吉林等地分离的52株猪链球菌，采用微量稀释法测定猪链球菌对大环内酯类抗生素的敏感性，共分离到耐药猪链球菌27株，红霉素、泰乐菌素、阿奇霉素和螺旋霉素的耐药率分别达53.8%、50.0%、51.9%和53.8%。2000-2001年杨建江等[12]从长春地区不同猪场分离的22株猪链球菌对红霉素和阿奇霉素耐药率均为86%。许力干等[13]采用药敏纸片扩散法对32 株猪链球菌广西分离株进行了12 种临床常用抗生素敏感性测定，结果表明广西地区猪链菌分离株耐药性非常普遍，而且耐药谱广，所有分离株对阿莫西林均具有耐药性，耐药率为100%，对强力霉素、壮观霉素、林可霉素、罗红霉素具有高度耐药性，耐药率分别为96%、89%、89%和84%，分离株对3 种以上抗生素都具有耐药性，其中有3 株对试验的12种抗生素都具有耐药性，表现为多重耐药性。金卉[14]对2004-2005年从湖南、湖北、广西等全国13个省分离的122株猪链球菌的药敏试验结果表明红霉素的耐药率为93.5%。沈萍[15]对25株猪链球菌2型湖南分离株进行药敏试验，其中23 株对红霉素和四环素存耐药，对红霉素耐药率92%，对四环素素耐药率79.7%，万古霉素耐药性100%，克林霉素耐药性86.9%。Zhang [16]等对2005-2007年从广东、广西、江西、安徽、山东、辽宁、北京、河南和河北分离的421株猪链球菌的药敏试验结果表明，克林霉素、红霉素和替米考星的耐药率分别为68.4%、67.2%、66.7%，耐药情况比较严重。 国外，Marie [17]等1996-2002年对法国分离的110株猪源链球菌和25株人源猪链球菌的药敏试验结果，几乎所有的细菌对青霉素G、氨苄西林、头孢噻呋、氟苯尼考、庆大霉素和杆菌肽敏感，大部分的猪链球菌对大环内酯和林克酰胺类抗生素耐药。Vela等[18]151株分离自西班牙的猪链球菌进行药敏试验，发现超过87%的分离株对大环内酯类、林可酰胺类、磺胺类和氯林可霉素耐药。而且87%以上的菌株对至少4种抗生素具有多重耐药性，6%的菌株对6种以上的抗生素具有多重耐药性。Martel等[19]对1999 -2000年分离的87株猪链球菌进行耐药性检测发现71 %的菌株对多种大环内酯类药物表现高耐药性。在日本，Chang[20]等对1994-2006年从病人中分离的7株2型猪链球菌的药物敏感性试验结果表明，所有的菌株对青霉素G、氨苄西林、头孢噻肟和环丙沙星敏感，6株对红霉素和克林霉素耐药。 以上数据表明国内外猪链球菌对大环内酯类耐药已十分严重，且耐药性可通过食物链传递给人群，导致耐药性在人畜之间的传递，产生交叉耐药性。因此，抗菌药物的耐药性问题已经成为全球关注的热点，解决这个问题对人类历史具有重要的意义。 2猪链球菌对大环内酯类药物耐药机制的研究 大环内酯类药物作为治疗猪链球菌感染的主要有效药物之一，被广泛的用于畜牧养殖中，使得猪链球菌的耐药现象也日趋严重。猪链球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制主要有三种：①靶位改变：耐药猪链球菌可合成Erm酶(erm基因编码)，促使核糖体23S rRNA的腺嘌呤发生甲基化，使得靶位发生改变，阻碍大环内酯类与之结合。肺炎链球菌甲基化酶由耐药基因ermB编码，通常位于结合转座子Tn1545上，其表型为对大环内酯类-林可霉素-链阳菌素B高度耐药。MLSB耐药可以是内在型或诱导性表达。②主动外排系统：最近报道肺炎链球菌一种新的耐药表型对14、15元环大环内酯类低水平耐药，而对16元环大环内酯类、克林霉素和链阳菌素B敏感，即M型，这种耐药模式由编码主动外排泵的mefA 基因介导[21]。Mef 基因编码一个能量依赖性的蛋白质，可将进入细菌体内的红霉素等14，15元环的大环内酯类抗生素泵出菌体外，使之无法作用于细菌[22-25]。③ 23S rRNA和核糖体蛋白L4、L22突变：由于23S rRNA核糖体在2059位上存在基因突变(A-G)或核糖体蛋白L4中一段高度保守序列的突变，可导致组成型核糖体发生变化，造成红霉素对核糖体亲和力下降，从而出现了对红霉素耐药。目前临床分离的猪链球菌尚未发现23S rRNA碱基突变，其对大环内酯类药物的耐药基因主要以ermB介导为主。 2.1甲基转移酶Erm家族催化的甲基化引起的耐药 目前至少已发现8类erm基因，常见的有ermB(又可称为ermAM)、ermA和ermC。 erm基因编码的蛋白质Erm是一系列相似的甲基化酶，Erm家族成员的序列具有24.6%-85% 的同源性，erm基因编码的核糖体甲基化酶可使肺炎链球菌23S rRNA的2058位的腺嘌呤残基 N-6位甲基化。A2058核苷酸是红霉素结合于细菌核糖体的关键位点，此位点的修饰可明显降低细菌与红霉素的结合能力，介导对所有大环内酯类、林可酰胺类和链阳菌素B高水平耐药[26,27]。erm介导的细菌耐药可分为组成型和诱导型，组成型耐药是由于翻译弱化系统的碱基发生缺失、重复和点突变造成，耐药菌株表型称为内在型(cMLS)耐药，这些耐药菌株无论在诱导剂存在或不存在的情况下，对大环内酯类抗生素、林可胺类抗生素及链阳菌素类抗生素都表现出高度耐药[28]。诱导型耐药的形成需要合适的诱导物存在，由于14和15元环大环内酯类抗生素在碳3位存在中性糖基，因此能诱导细菌产生耐药，而16元大环内酯类抗生素不存在这种结构，所以没有诱导耐药性。 ermB决定子最初称为ermAM，1978年时从牙噬菌斑分离的血链球菌的质粒pAM77中检测到的。该基因分布广泛，ermB决定子通常定位在细菌染色体上，其转座也发生在染色体与染色体之间，可在不同种属微生物中传播。肺炎链球菌erm基因绝大多数为ermB 基因，通常位于接合转座子Tn1545或Tn917上，可导致红霉素耐药性的快速播散[29,30]。ermB的克隆传播和水平传播导致了一些国家的耐红霉素肺炎链球菌株的高度流行[31] 。 目前，国内临床分离的猪链球菌对大环内酯类抗生素的耐药主要由ermB介导，呈红霉素高度耐药。王丽平等[32]对国内分离的111株动物源链球菌进行红霉素耐药基因的检测结果显示，ermB基因检出率为85.5%；姜成刚等[11]对临床分离的27株大环内酯类药物耐药猪链球菌进行耐药基因的检测，结果显示1株检测到ermC基因，21株检测到ermB基因，未检测到mefA/E基因。杨建江等[12]对长春地区22株猪链球菌临床分离株均扩增出ermB基因，而未扩增出mefA/E基因。沈萍[15]对23株猪链球菌湖南分离株的红霉素耐药基因检测结果表明，ermB基因检出率为78.3%，是主要抗性决定基因。 Martel[19]等1999-2000年从猪场分离的87株猪链球菌中，71%的菌株对大环内酯类和林可霉素耐药即为内在型耐药，对耐药菌PCR检测结果表明，所有的菌株均检测到ermB基因，未检测到mefA/E基因。Martel[33]等对从猪体内分离33株及猪肉中分离99株的大环内酯类及林可霉素类耐药猪链球菌的PCR检测结果表明，所有耐药菌株均携带ermB或mefA，有的菌株同时携带两种耐药基因。因此，不同地区或国家分离的猪链球菌对大环内酯和林可酰胺的耐药机制不尽相同，这可能与其所处的环境、不同种类的链球菌以及药物使用频率等复杂因素有关。 猪链球菌与人源及其它动物源性细菌的ermB基因可能存在广泛的交换。杨建江等[12]检测到6株猪链球菌ermB基因与GenBank中的肺炎链球菌Tn1545转座子、屎肠球菌的质粒pRUM786等序列同源性为98 %-100 %。Martel等[34]通过体外试验证明，ermB耐药基因位Tn1545上，在猪链球菌、人肺炎链球菌和化脓链球菌等之间可以较低的频率进行交换。 2.2主动外排系统介导的耐药 细菌的细胞膜成分改变可形成一种依赖ATP质子泵的膜蛋白，通过耗能过程将药物排出细菌细胞外，从而阻止药物作用于靶部位。自Leyvt[35]等提出主动外排是细菌耐药的一个基本机制后，主动外排在临床重要病原菌耐药中的重要作用不断被揭示和认同，也是目前细菌耐药机制研究中的新热点[36]。革兰氏阴性菌的外排泵主要由膜通道蛋白、融合蛋白和胞质膜外排蛋白3部分组成，是介导细菌多药耐药的主要原因[37]。而在革兰氏阳性菌的外排泵较为简单，仅为单一成分，例如肺炎链球菌、化脓性链球菌的外排泵MefA/E；大肠杆菌的外排泵MacAB[38]等；葡萄球菌、粪肠球菌的外排泵MsrA和Msr C [39]。 mef基因可分为来源于肺炎链球菌的mefE[21]、来源于化脓性链球菌的mefA及来源于肺炎链球菌mefI。mefE与mefA在核酸水平具有约90%的相同序列，在蛋白质水平也具有88%的同源性，但它们在血清型分布、耐药谱型和转移方式均有所不同，且存在地区差异[40]。Daly等[41]分析了不同地区的mefA/E基因的分布特点，发现mefA介导的耐药主要在西欧地区流行，而在美国、加拿大、南非和亚洲则主要流mefE介导的耐药，地中海地区mefA/E都有，但mefE的流行率较高。Cochetti 等[42]在耐大环内酯类肺炎链球菌中发现了一个新的耐药基因，测序分析结果表明，此基因与mefE和mefA基因的同源性分别为93.6%和91.4%，且氨基酸序列同源性分别为96.5%和94.3%，认为是mef基因的一个新亚型，命名为mefI。 在肺炎链球菌中，mefA和mefE位于类似结合性转座子的遗传成分上[43-44]。mefE 基因位于一个长度为5.4/5.5kb的大环内酯外排基因集合体上(macrolide efflux genetic assembly，mega)，介导肺炎链球菌对大环内酯类药物的低度耐药[43]，Del Grosso等[45]研究发现，mefE 基因可插入到一个长23.5kb的Tn916样遗传成分中——即转座子Tn2009。且在不同的菌株中，mefE 插入Tn2009的部位完全一致，此部位为与Tn916第6个ORF同源的序列。Tn2009整合时可导致9.5 kb细菌染色体序列的缺失，其整合作用是通过转化作用实现的。而mefA基因是转座子Tn1207.1[44]或Tn1207.3[46]的部分序列。Tn1207.1该转座子全长约7.2 kb，含有8个开放阅读框(ORF)。其中ORF2编码产物与部位特异性重组酶/整合酶具有同源性；ORF4即为mefA基因；ORF5(即 mel基因)是大环内酯、链阳性菌素A耐药基因(msr)的同源基因，其编码产物与MefA外排泵功能的发挥密切相关，两者缺一不可[47]。Santagati等[46]在酿脓链球菌临床分离株上发现一个全长 52 kb 的可以携带mefA 基因的染色体遗传成分，因该成分具有典型的转座子特征，作者将之命名为转座子Tn1207.3。测序分析发现，其左端7244bp序列与Tn1207.1完全相同，提示Tn1207.1可能就是Tn1207.3的缺陷型。 mefA和mefE基因是mega操纵子的一部分，其下游是一个类似于msrA基因的mel基因。在葡萄球菌中，msrA编码大小为488个氨基酸的ATP能量依赖转运蛋白，对红霉素有外排作用，属于ABC 转运蛋白家族[48]。ABC转运蛋白超家族(ATP binding cassette transporter superfamily)与多药耐药密切相关，它通过ATP水解供能，逆浓度梯度将药物泵出细胞外，导致细胞内药物浓度降低而产生耐药[49]。ABC转运蛋白的核心结构通常由4个结构域组成，包括2个高度疏水的跨膜结构域(transmembrane domain，TMD)和2个核苷酸结合域(nucleotide-binding domain，NBD)。每一个跨膜结构域一般由6个α螺旋构成，也存在10个、17个、19个α螺旋组成的跨膜结构域[50]。他们形成一个跨膜通道以实现底物分子的跨膜运输，同时还参与底物的识别过程。核苷酸结合域位于细胞质，结合和分解ATP。两个疏水区域在细胞质内相互影响[51]。MsrA 和mel都包含ABC结合区域，具有ABC转运体的特性。但是，它们缺乏能够携带跨膜区域的疏水片段。Ross J I 等预测MsrA影响染色体上跨膜合成物的编码，介导对大环内酯类药物和链阳霉素B的耐药（MS型）[48]。 在肺炎链球菌中，mefE 和mel 基因作为操纵子共同转录，并推测是一个双重外排泵[43]。而Melissa M[52]等研究表明msrD基因功能表达不依赖mef基因，即单独表达。因此，对mef与msr基因的研究还有待更进一步深化。 2.3 核蛋白变异 大环内酯类抗生素的抗菌机制是大环内酯类抗生素能进入细胞内结合于50S大亚基，抑制肽酰基转移酶，影响核蛋白体移位过程，抑制细菌蛋白合成和肽链延伸。对肺炎链球菌的研究结果表明，23S rRNA的结构域Ⅴ区和Ⅱ区与大环内酯类抗生素直接结合的碱基点位点发生突变，导致核糖体的构象改变，使大环内酯类抗生素与细菌与大环内酯类亲合力下降，不能有效地阻止细菌蛋白质的合成，最终产生耐药。其主要突变位点在23S rRNA的V区2058、2059、2062及2611位碱基，泰利霉素可以作用于结构域Ⅱ区发卡结构35的A752位点[53]。肺炎链球菌菌体为4个拷贝核糖体，若出现耐药表型，至少需要2个拷贝发生突变。突变的核糖体拷贝数越多，耐药水平也越高[54]。 核糖体蛋白L4、L22是核糖体大亚基早期组装过程中的蛋白质，在核糖体的组装中起“脚手架”的作用，L4、L22的部分结构突出向通道内壁形成狭窄，该部分的突变会阻塞通道而影响大环内酯的结合，产生耐药[55,56]。核糖体蛋白L22和L4并不与红霉素等大环内酯类药物直接作用，而是结合于23S rRNA的Ⅰ区，维持23S rRNA的立体构象，这些蛋白质的突变将扰乱Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ区的构象，因而影响主要与Ⅴ区肽转移酶中心附近位点结合的药物的抗菌活性[57]。研究显示，仅有L22 突变时可以使肺炎链球菌针对MLSB 类抗生素的MIC 值升高，但不能产生高水平耐药，L22突变基因被导入野生型肺炎链球菌后可以使其MIC 值大幅度升高，但并不能产生耐药[58]。目前尚无L22突变所致高水平耐药的报道。 Depardieu等[57]发现肺炎链球菌临床分离株BM4455对16元环的大环内酯类药物和链阳菌素耐药，是由于23S rRNA 结构域Ⅴ区的4个拷贝的A2062C的突变引起的。David等[59]研究发现，对7株没有检测到大环内酯类耐药基因的化脓链球菌株，检测到23S rRNAⅤ区的A2058G 和U2166C发生突变。Todd等检测322株中的19株红霉素耐药的肺炎链球菌株的23S rRNA、L4、和L22基因的突变。发现2株具有mefA 基因的2058或2059发生突变。2株核糖体蛋白L4 69-71位上的氨基酸GTG替换TPS。Tait-Kamradt[60]等通过大环内酯类药物体外试验，发现2株23S rRNA没有突变的耐药菌株，核糖体蛋白L4的一段高度保守区中的63-74 (KPWRQKGTGRAR) 位上的氨基酸发生改变。其中一株G69C发生突变，另外一株有6个碱基的插入，导致两个氨基酸（S和Q）在Q67和 K68之间插入。另有研究发现大肠杆菌核糖体蛋白L4的第63位Lys→Glu和L22第82 83、84位Met、Lys、Arg 的缺失会导致其对红霉素耐药[61,62]。 16元环的大环内酯类药物泰乐菌素和泰乐霉素都含有6-脱氧-D-阿洛糖（mycinose），而乙酰螺旋霉素、碳霉素、交沙霉素缺乏这个糖。在结构上，泰乐菌素结合到D50S和H. marismortui 的核糖体大亚基50S上，泰乐菌素的6-脱氧-D-阿洛糖可以与23S rRNA结构域Ⅱ区、核糖体蛋白L22相互作用。这两种结合方式使L22上的 Ile85-Arg99 缺失。缺乏6-脱氧-D-阿洛糖相比有6-脱氧-D-阿洛糖的16元环的大环内酯类药物，容易发生A2058C的突变。Ile85-Arg99 缺失的菌株没有对乙酰螺旋霉素、碳霉素、交沙霉素产生耐药。L22的缺失是在 A2058G发生突变的情况下产生的[63]。 3四环素耐药基因tetM、tetO与ermB、mefA/E关系的研究 四环素类药物为广谱抗生素，发现于20世纪40年代，是通过阻止氨酰tRNA与核糖体结合位点(A)的结合来阻止菌体蛋白合成的一类抗生素，具有广泛的抗菌活性。因其价格低廉、毒性低等优点，曾广泛地应用于畜禽促生长剂，导致许多细菌都对其产生严重的耐药性。杨建江等测定22株从长春地区分离的猪链球菌对四环素的耐药率为95﹪[12]。金卉[14]对2004-2005年从湖南、湖北、广西等全国13个省分离的122株猪链球菌的药敏试验结果表明四环素的耐药率为93.5%。沈萍[15]研究发现25株湖南地区分离的猪链球菌中有23株对红霉素和四环素存在抗性。毕聪明[64]等对从上海、沈阳、吉林、长春4地分离的36株猪源性链球菌的药物敏感性实验结果表明，四环素的耐药率为100﹪；Zhang [16]等对2005-2007年从广东、广西、江西、安徽、山东、辽宁、北京、河南和河北分离的421株猪链球菌对四环素的耐药率为91.7%。 细菌（包括革兰氏阳性菌和阴性菌）产生四环素耐药性的机制有多种，包括核糖体保护机制、药物外排泵机制、酶钝化机制等，由不同的四环素耐药基因(tet)决定[65-66]。tet种类很多，目前已鉴定出三十多种，其中革兰氏阴性菌32种，革兰氏阳性菌22种，且常见于多重耐药菌株[67]。 核糖体保护机制通过耐药基因编码的核糖体保护蛋白(ribosomal protection protein，RPP ) 发挥作用。核糖体保护蛋白将四环素从核糖体上释放出来，氨基酰-tRNA 可以与核糖体A位置结合，蛋白质翻译得以正常进行[66]。与核糖体保护机制相关的耐药基因有：tetM 、tetO、tetS、tetW 、tetQ、tetT 、otrA、tetPB 等[65]。TetM和TeO蛋白是研究得最多的核糖体保护蛋白，它们具有核糖体依赖的GTP水解酶活性。无论是TetM 还是TetO 蛋白，当有GTP而不是GDP存在时就会使四环素与核糖体的结合能力减弱[68,69] 。 四环素外排泵蛋白属于主要易化超家族(MFS)，是目前Tet蛋白中研究最清楚的。所有tet外排泵基因都编码膜相关蛋白可将四环素泵出胞外，降低了细胞内药物浓度保护了胞内的核糖体，从而产生耐药性[70]。 。7]eec acyclineresistanceingram 四环素耐药基因的分布存在多样性，不同细菌、宿主种类及地理位置等都表现出四环素耐药基因的差异[71]。大肠杆菌临床分离株中最流行的是tetA、tetB和tetG基因[72]。代敏[67]对耐四环素的猪源致病性沙门氏菌进行tetC基因的PCR检测，结果tetC的检出率为75﹪。肺炎链球菌的四环素耐药主要由于tet基因编码的蛋白质的核糖体保护作用，即此类蛋白能与核糖体相互影响使细菌对四环素抑菌作用不敏感。主要以tetM 最常见，其次是tetO[73,74]。在猪链球菌，tetM 和tetO基因编码的tetM 和tetO核糖体保护蛋白导致猪链球菌的耐药最为常见[75]。TetM 基因表达对四环素的耐药常为高水平的，而TetO基因编码的耐药为低水平的。该基因可以位于质粒或染色体上，四环素耐药多与MLSB 耐药偶联在一块，在肺炎链球菌主要由Tn1545携带，而在猪链球菌tet基因可能是由与 Tn9l6同源的接合性转座子携带。 转座子是革兰阳性菌抗生素耐药的重要因子。它们从一个DNA分子转座到另一个DNA分子上，可在革兰阳性菌不同种、属间进行接合转座，使抗生素的耐药得以扩散。红霉素耐药基因ermB和mefA均为获得性耐药基因，可能位于转座子内，或由质粒携带，在细菌间广泛传播。Stuart 等[76]在大环内酯类耐药猪链球菌中检测到类似转座子Tn916的非依赖质粒的接合型转座子，其携带红霉素和四环素抗性以一定的频率在猪源和人源链球菌间传递。Tian等[77]经过