黄曲霉毒素试剂盒说明书

黄 曲 霉 毒 素 B1 酶 联 免 疫 检 测 试 剂 盒 使 用 说 明 书 Ⅰ．样品处理方法 1、 食品 1、脂肪含量小的固体样品（如大米、玉米、小米等）称取5.0g样品（已粉碎）于100ml具塞三角瓶中，准确加入25.0ml甲醇水（1+1）溶液，振摇15min，过滤，弃去1/4初滤液，收集试样滤液，根据样品的国家允许量，用A试剂将滤液进行稀释（见表1：样品稀释表）。将样品稀释液进行定量或限量测定。 2、 酱油、醋 称取5.0g样品于25ml小烧杯中，用5ml蒸馏水将试样转移到125ml分液漏斗中， 加入20ml三氯甲烷，加塞轻轻振摇3min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的无水Na2SO4过滤器于100ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，65℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入25.0ml甲醇水（1+1），将蒸发皿中的凝结物充分溶解。根据样品的国家允许量标准，用A试剂将提取液进行稀释（见表1：样品稀释表）。 将样品稀释液进行定量或限量测定。 3、 食用油（如菜油、麻油、色拉油、花生油等） 称5.0g油样于25ml小烧杯中，用20ml石油醚或正乙烷分次将试样转移至125ml分液漏斗中，准确加入25.0ml甲醇水（1+1）溶液，加塞轻轻振摇5min，静置分层，放出下层甲醇水提取液。根据样品的国家允许量标准，用A试剂将提取液进行稀释 （见表1：样品稀释表）。将样品稀释液进行定量或限量测定。 4、葡萄酒 准备称取5.0g葡萄酒于125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷，加塞轻轻振摇3min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的的无水Na2SO4过滤器于100ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中， 65℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入25.0ml甲醇水（1+1），将蒸发皿中的凝结物充分溶解。根据样品的国家允许量标准，用A试剂将提取液进行稀释（见表1：样品稀释表）。将样品稀释液进行定量或限量测定。 5、啤酒、黄酒 准确吸取5.0ml样品于25ml容量瓶，准确加入12.5ml甲醇，再用蒸馏水定容至25ml。振摇10min，此即为待测样品液。将待测样品稀释液进行定量或限量测定。 若结果为阳性，则采用葡萄酒中AFB1的提取方法进行测定。 6、花生 样品去皮粉碎（刀切或剪切），称取5.0g于100ml具塞三角瓶中。加入25.0ml甲醇水（1+1）和20ml正乙烷（或石油醚），振摇10min，过滤于分液漏斗中，静置分层。放出下层提取液，根据样品的国家允许量标准，用A试剂将提取液进行稀释（见表1： 样品稀释表）。将样品稀释液进行定量过限量测定。 7、月饼、桃酥、花生酱等 称取10.0g试样于125ml具塞锥形瓶中，加入50.0ml甲醇水（1+1）提取液和20ml正乙烷（或石油醚）加塞震荡15min，过滤，收集滤液于分液漏斗中，静置分层。待下层甲醇水溶液澄清后，放出甲醇水溶液于另一锥形瓶中。准备吸取10.0ml甲醇水提取液（相当2.0g样品）于125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷，加塞轻轻振摇3min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的无水Na2SO4过滤器于100ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，65℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入10.0ml甲醇水（1+1），将蒸发皿中的凝结物充分溶解。根据样品的国家允许量标准，用A试剂将提取液进行稀释（见表1：样品稀释表）。将样品稀释液进行定量或限量测定。 8、面粉 称取10.0g面粉样于100ml具塞三角瓶中，准确加入50.0ml甲醇水（1+1）溶液，震荡15min ,过滤，收集试样滤液。准确吸取10.0ml滤液（相当于2.0g样品）125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷层，加塞轻轻振摇3min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的无水Na2SO4过滤器于100ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中， 65℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入10.0ml甲醇水（1+1），将蒸发皿中的凝结物充分溶解。根据样品的国家允许量标准，用A试剂将提取液进行稀释（见表1：样品稀释表）。 将样品稀释液进行定量或限量测定。 二、 饲料 1、一般饲料及原料 称取5.0g样品于100ml具塞三角瓶中，准确加入25.0ml甲醇水（1+1）溶液，振荡15min，过滤，弃去初滤液。收集滤液。根据样品的国家允许量标准，用A试剂将滤液进行稀释（见表1：样品稀释表）。 将样品稀释液进行定量或限量测定。 2、饲料浓缩料 称取10.0g样品于100ml具塞三角瓶中，准确加入50.0ml甲醇水（1+1）溶液，振荡15min,过滤，收集试样过滤。 准备吸取10.0ml甲醇水提取液（相当2.0g样品）于125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷，加塞轻轻振摇3min，静置分层。 放出下层三氯甲烷层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的无水Na2SO4过滤器于100ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，65℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入10.0ml甲醇水（1+1），将蒸发皿中的凝结物充分溶解。根据样品的国家允许量标准，用A试剂将提取液进行稀释（见表1：样品稀释表）。 将样品稀释液进行定量或限量测定。 2、 样品稀释表 表1 样品稀释表 样品允许量（µg/kg） 样品提取液（ml） A试剂（ml） 样品稀释倍数（D） ≤5 直接量取 0 1 ≤10 0.1 0.1 2 ≤15 0.05 0.2 3 ≤20 0.05 0.15 4 ≤30 0.05 0.25 6 ≤50 0.05 0.45 10 Ⅱ.黄曲霉毒素B1测试盒使用说明书 （定量） 本测试盒利用固相酶联免疫吸附（ELISE）原理，通过抗黄曲霉毒素B1抗体与酶标抗原、待测抗原的竞争免疫反应以及酶的催化显色反应相结合来检测AFB1，适用于食品、饲料及相关原料中AFB1的定量检测，特点是灵敏度高，特异性好，操作简便，结果易判读。 1、 测试盒组成 1、包被抗体的反应板： 48/24/12孔 2、A试剂：样品稀释液 1瓶 3、B试剂：AFB1标准溶液 1套（0.1，0.5，1.5，10ng/ml） 4、C试剂：酶标抗原 2/1瓶 5、D试剂：酶标抗原稀释液 1瓶 6、E试剂：浓缩洗涤液 1瓶 7、F试剂：显色底物液a 1瓶 8、G试剂：显色底物液b 1瓶 9、H试剂：终止液 1瓶 10、反应板支架： 1块 2、 实验准备 1、 样品处理：详见“Ⅰ.样品处理方法” 2、 试剂的配制 ⑴每瓶C试剂中准确加入1.5ml D试剂，充分溶解，配成实验用酶标抗原溶液，2-8℃保存。 ⑵E试剂用300ml蒸馏水配制成洗涤液。 3、 实验步骤 1、 试剂平衡：将测试盒取出，放置15min以上，平衡至室温。 2、 小孔编号：根据需要截取相当孔数放置反应板支架上。设定1号孔为仪器调零孔，2号孔为阴性孔，3-7号孔为AFB1标准对照孔，其余孔为样品孔。 3、 洗涤：每孔加入250µl左右洗涤液，洗液不得溢出，放置1min后 甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板一次。 4、反应物组成：按下列步骤所示，依次加入配制好的溶液及待测样品稀释液。 第一步：1号孔和2号孔分别加入50µl A试剂，3-7号控分别加入系列浓度的B试剂（0.1，0.5，1，5，10ng/ml）50µl,其余孔分别加入相应的样品稀释液。 第二步：1号孔加入50µlD试剂，其余各孔均加入50µlC试剂。 第三步：轻轻地振摇，使各孔的反应物混匀。 表2 反应物组成表 操作次序 加入量 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 50µl 50µl A A 0.1 0.5 1 5 10 样 品 稀 释 液 D C C C C C C C C C C C 摇匀 5、反应：将反应板放入37℃ 恒温培养箱中孵育30min。 6、洗涤：取出反应板，用力甩掉反应液，拍手。每孔加入250µl左右洗涤液，洗液不得溢出，放置2min后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板4次。 7、显色：每孔分别加入显色低物液a（F试剂）和显色底物液b(G试剂)各50µl,摇匀，将反应板放入37℃ 恒温培养箱中显色15min。 8、终止与仪器测定：每孔分别加入终止液（H试剂）50µl，然后用酶测定仪（或黄曲霉毒素B1专用测定仪）在450nm波长处测定各孔的吸光度A值。 9、定量测定： 将浓度为0，0.1，1，5，10ng/ml的AFB1系列标准工作溶液，按上述实验步骤测定相应的吸光度A值，并绘制成标准曲线（见图一）。 横坐标为标准液浓度的常用对数值（1gC），纵坐标为各标准液孔A值与标准液为0ng/ml的A值的比值（A标准液/A（0ng/ml））。 计算样品孔A值与A(0ng/ml)(A样品/A(0ng/ml))，查标准线，可得到相应样品稀释浓度（C）的常用对数值lgC，对其求反对数，可求得样品稀释液的AFB1浓度C。按下列公式计算出样品中AFB1的含量： AFB1含量（ng/g）=C×(V/M)×D 式中：C:稀释后样品提取液中AFB1含量（ng/ml） V:样品提取液体积（ml） M:样品质量（g） D:样品稀释倍数 四、测试盒贮存 1、2-8℃贮存，忌0℃以下冻存。 2、有效期6个月。 五、样品允许量标准请参阅（GB2671-81，GB8381-87） 六、批号：见测试盒 Ⅲ. 黄曲霉毒素B1测试盒使用说明书 （限量检测） 1、 测试盒组成 1、 包被抗体的反应板： 48/24/12孔 2、 A试剂：样品稀释液 1瓶 3、 B试剂：AFB1标准溶液 1瓶 4、 C试剂：酶标抗原 2/1瓶 5、 D试剂：酶标抗原稀释液 1瓶 6、 E试剂：浓缩洗涤液 1瓶 7、 F试剂：显色底物液a 1瓶 8、 G试剂：显色底物液b 1瓶 9、 H试剂：终止液 1瓶 10、 反应板支架： 1块 2、 实验准备 1、 样品处理：祥见“Ⅰ.样品处理方法” 2、 试剂的配制 （1） 每瓶C试剂中准确加入1.5ml试剂，充分溶解，配成实验用酶标抗原溶液，2-8℃保存。 （2） E试剂用300ml蒸馏水配制成洗涤液。 3、 实验步骤 1、 试剂平衡：将测试盒取出，放置15min以上，平衡至室温。 2、 小孔编号：根据需要截取相当孔数放置反应板支架上。设定1号孔为仪器调零孔，2号孔为阴性对照孔，3号孔为阳性对照孔，其余孔为样品孔。 3、 洗涤：每孔加入250µl左右洗涤液，洗液不得溢出，放置1min 后，甩掉洗液，在吸水纸上拍干，重复洗板一次。 4、反应物组成：按下列步骤所示，依次加入配制好的溶液及 待测样品稀释液。 第1步：1号孔和2号孔分别加入50µl A试剂，3号孔加入50µl B 试剂，其余孔加入相应的样品稀释液。 第2步：1号孔加入50µl D试剂，其余各孔均加入50µl C试剂。 第3步：轻轻地振摇，使各孔中的反应物混匀。 表3 反应物组成表 操作次序 加入量 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 50µl 50µl l A A B….………样品稀释液…………………….. D C C C C C C C C C C C 摇匀 5、反应：将反应板放入37℃ 恒温培养箱中孵育30min。 6、洗涤：取出反应板，用力甩掉反应液，拍干。每孔加入250µl左右洗涤液，洗液不得溢出，放置2min后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板4次。 7、显色：每孔分别加入显色低物液a（F试剂）和显色底物液b(G试剂)各50µl,摇匀，将反应板放入37℃ 恒温培养箱中显色15min，目视法测定。（注：可适当延长显色时间，使颜色加深，以利目视。） 8、限量判断 1） 目视法测定：先比较1-3号孔颜色。若2号孔（阴性孔）颜色最深，3号孔（阳性孔）次之，1号孔（空白孔）接近无色， 说明试剂有效及操作无误。比较样品孔与3号孔（阳性孔）颜色，若浅者，则为阳性，若深者，则为阴性，若颜色接近，则用仪器法或国标法验证。 2） 仪器法测定：每孔分别加入终止液（H试剂）50µl,然后用酶测定仪（或黄曲霉素B1专用测定仪）在450nm波长处测定各孔的吸光度A值，若A样品孔〈A阳性孔为阳性，若A样品孔≥A阳性孔为阴性. 若样品显阳性,则其AFB1含量可判断为: AFB1含量(ng/g)＞l.0 ng/ml×(V/M×D) V:样品提取液体积（ml） M:样品质量（g） D:样品稀释倍数 四、测试盒贮存 1、2-8℃贮存，忌0℃以下冻存。 2、有效期6个月。 五、样品允许量标准请参阅（GB2671-81，GB8381-87） 六、批号：见测试盒 Ⅳ.实验操作流程图及注意事项 · 实验操作流程图 适当稀释 加样 37℃，30min 样品提取———→试剂准备———→免疫反应————→ 37℃，15min 目测、仪器测量 显色反应————→结果判定—————→计算含量 · 注意事项 1、 洗涤时要迅速，洗涤液不可溢出，以防交叉污染； 2、 加样时要准确，直接加到小孔底部，不可有气泡，不要加到孔壁上； 3、 试剂使用前摇匀； 4、 整个加样过程要快，保证前后反应时间一致； 5、 加样后要轻请震摇整板，使反应液混匀； 6、 每次洗涤要先用力甩干后再拍干，最后要擦干板底，以利于仪器检测； 7、 不同批次测试盒的试剂不能混用； 8、 每次测试时应尽量使用新配制的洗涤液； 9、 虽AFB1标准浓度很低，但是严格的实验操作不可忽视，凡接触到标样的器皿都要用5%NaCIO浸泡半天后再清洗备用。 Ⅴ. 主要技术指标及参数 测试盒分三种规格：12孔、24孔、48孔。反应孔可拆卸，可测单份样品，亦可测多份样品，定量测定每次需要6个标准孔，若半定量测定只需3个标准孔。 测试盒的主要技术指标及参数： 1、 最低检出浓度：0.1ng/ml; 2、 回收率：87%-95%； 3、 交叉反应系数：0-0.21； 4、 检测范围：0.1-10ng/ml; 5、 重复性：条内＜10%，条间＜15%。 Ⅵ.实验室基本配置 1、 酶标仪（内置450nm滤光片）或黄曲霉素B1专用测定仪 2、 50ul微量移液器及配套吸头 3、 恒温培养箱（0℃-50℃） 4、 冰箱（4℃-8℃） 5、 感量0.01g的天平 6、 玻璃器皿：锥形瓶，烧杯，分液漏斗，蒸发皿。量筒，具塞试管，滴管，移液管等 7、 小型粉碎机或碾钵 8、 其他：滤纸，吸水纸等 Ⅶ.相关文献 （1） 饲料中黄曲霉毒素B1的测定方法（GB/T17480-1998） （2） 食品中黄曲霉毒素B1的测定方法（GB/T5009.22-1996），食品卫生标准使用手册理化检验方法[M]，1998（第一辑）；137-161。 （3） 国家质量监督检验检疫总局。关于印发小麦粉等5类食品生产许可证实施细则的通知。国质检监[2002]192号.2002.7.21 （4） 晓黎等.黄曲霉毒素方法研究进展[J].粮食与饲料工业，1994，10：41-43. （5） 赵晓联等.酶联免疫吸附法测定饲料中AFB1[J].中国饲料，1997，23-28. （6） 符金华.饲料中黄曲霉毒素B1的酶联免疫测试法[J].中国饲料，1998，14：20-21. （7） 赵晓联等.酶联免疫吸附分析法在食品卫生分析中的应用[J].卫生研究，1998，27：137-137. （8） 晓黎，赵晓联等.酶联免疫吸附法快速检测黄曲霉毒素B1[J].卫生研究，27：139-141. （9） 顾鸣等.出口农产品中黄曲霉毒素B1的快速检测法-竞争酶联免疫吸附法[J].上海检验检疫科技，1999，4：23-28. （10） 陈福生等.黄曲霉毒素B1的免疫检测I，抗原的制备.菌物系统，1999，18（3）：316 （11） 熊剑娟.酶联免疫吸附方法测定酱油中黄曲霉毒素B1[J].中国调味品，1999，4：27 （12） 郑妹凤.ELISE法快速检测黄曲霉毒素B1[J].安徽预防医学杂志，1999，5（3）：283 （13） 赵晓联，赵春城等，酶联免疫吸附法在饲料毒素检测中的应用[J]。中国饲料，2000，6：21-22 （14） 陈晓玲，等酶联免疫吸附法（ELISE）检测使用油中黄曲霉毒素B1[J].中国卫生检验杂志，2000，10（1）：59-60 （15） 刘兆霖.ELISE法快速检测食品、饲料中AFB1[J] .中国卫生检验杂志，2001，11（3）：335-365. （16） 赵晓联，赵春城等，酶联免疫吸附法测定AFB1误差分析[J].中国卫生检查杂志，2001，11（4）：473-475. （17） 陆茂林等.标记免疫分析技术在食品分析中的应用[J].中国卫生检验杂志，2002，12（1）：60-62. （18） 赵春城，赵晓联等.有机相萃取法消除ELISE检测AFB1假阳性的研究[J].饲料工业，200324（3）：40-43. （19） 上海第一医学院中国医学科学卫生研究所主编.食品毒理[M].北京，任命卫生出版社，1978：378-382. （20） 张旭译.蛋白质的定量法（第二版）[M].农业出版社，1981. （21） 成恒蒿，晓黎，赵晓联等.饲料分析实用手册[M].江苏科学技术出版社，1993 （22） 严杰等.现代微生物实验技术及其应用[M].人民卫生出版社，1997. （23） 朱立平，等.免疫学常用实验方法[M].人民军医出版社，2000. （24） 陈炳卿，刘志城，王茂起主编。现代食品卫生学[M].北京，人民卫生出版社，2001：185-194.