TΑ1对食管癌细胞RNA转染的脐血树突状细胞功能的影响0000000000

山东医药2008年第 48卷第 32 ToLl对食管癌细胞 RNA转染的脐血 树突状细胞功能的影响 王 健 ，苏安英 ，柴锡庆 ，门金娥 ，郑海萍 ，张向阳 ，田 珂 (1河北工程大学，河北邯郸056038；2河北工程大学附属医院) [摘要] 目的 探讨食管癌T．Tn细胞RNA转染脐血树突状细胞(DCs)对T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细 胞(CTL)特异性抗肿瘤作用的影响，以及胸腺肽 1(Tcd)对脐血DCs疫苗的免疫佐剂作用。方法 分离脐血单个 核细胞，经重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM·CSF)、重组人干细胞因子(~SCF)、重组人IL一4(rhlL-4)诱 导和T．Tn细胞 RNA转染形成成熟 DCs，加入Tal制备肿瘤疫苗。检测RNA转染后 DCs型变化；MTT法检测各 组脐血DCs诱导T细胞增殖和 CTL细胞毒活性。结果 与转染前比较，T．Tn细胞 RNA转染后脐血 DCs表面 MHC．I,MHC一Ⅱ和CD5 、CD80和cD86分子水平明显升高(P均<0．05)；可显著促进T细胞增殖，有效诱导CTL的特 异性杀瘤活性(P<0．05)。而Tal能显著促进RNA致敏脐血DCs的表面分子表达和T细胞功能(P<0．05)。结论 Tcd联合食管癌细胞RNA转染脐血DCs可制备高效、特异的肿瘤疫苗，有望成为食管癌生物治疗的新途径。 [关键词] 树突细胞；胎血；食管肿瘤；T淋巴细胞；胸腺肽 [中图分类号] R735．1 [文献标识码] A [文章编号]1002-266X(2008)32-0007-03 The effect of 1 On human cord blood dendritic cells transfected with RNA of esophageal carcinoma cells WANG fian ，SU An一 ng，CHAI Xi—qing，MEN Jin—e，ZHENG Hai-ping， ZHANG Xiang一 ，TIAN ke (1 Hebei University ofEngineering，Handan 056038，P_R．China) Abstract：OMeetive To investigate the proliferation of T lymphocyte and antitumor activity of CTL induced by hu— mall cord blood dendritic cells(DCs)transfected with RNA of esophageal carcinoma，and immuno-adjuvant effect ofTcd on DCs．Metllotis The RNA of T．Tn cells were prepared by Trizol reagent．Th e cord blood monocytes were cultured to produce DCs with rhSCF．rhGM．CSF and rhlL-4．Th e：DCs were coBected and transfected witll tumor cell total RNA．Tal was added in culture system to enhance the DCs vaccine．MHC—I，MHC—lI and CO．stimulatory molecules，CD54．CD80 and CD86 On the surface of DCs were analyzed by FCM．The Mixed lymphocyte reation(MLR)and cytotoxicity of CTLs to T．Tn cells were assayed by MTT calorimetry．Results DCs transfeeted with RNA—of esophageal carcinoma cells expressed more MHC—I，MHC一Ⅱ，CD54，CD80 and CD86 than that without transfection(P<0．05)．Mature transfected DCs could promote the proliferation of T lymphocyte and induce specific activity of CTL．Tcd caIl enhan ce the expression of the mole． cules on surface and the activity of T lymphocyte significantly．Conclusion Th e vaccine call be prepared by cord blood DCs transfected with Tal and RNA of esophageal carcinoma cells，and it may provide effective and specific way for immu． nO—therapy of esophageal carcinoma． Key words：dendritic cells；fetal blood；esophageal neoplasms；T—lym phocytes；thymosin 脐血来源的树突状细胞(DCs)可提供足量的不 受主要组织相容性复合物(MHC)限制的抗原提呈 细胞(APCs)⋯ ，而胸腺肽 仅1( 1)作为一种功能 强大的免疫调节剂，将其加人 DCs疫苗联合应用被 认为是增强其抗肿瘤效应的较好方法 。本研究 [基金项 目]河北省科技研究与发展资助项 目(064072225D)。 观察了ToLl对人食管癌 T．Tn细胞 RNA转染的脐 血DCs诱导 T细胞增殖和细胞毒性 T淋巴细胞 (CTL)杀伤活性的影响。 1 与方法 1．1 材料 人食管癌T．Tn细胞株购自上海市肿 瘤研究所 ，脐血来 自河北工程大学附属医院产科。 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM—CSF)、 7 重组人干细胞因子(rhSCF)、重组人 IL4(rhIL_4)和 重组人 IL-2(rhIL-2)为美国 PeproTech公司产品。 鼠抗人 MHC—I、MHC—lI、CD80、CD。6、CD 分子的单 克隆抗体(mAb)和 FITC一羊抗鼠IgG，均为美国 An— cell公 司产 品。TRIzol试 剂 和 转 染 试 剂 Lipo— fectamine 2000脂质体购自Invitrogen公司。 1．2 方法 1．2．1 肿瘤RNA的提取 将冻存 T．Tn食管癌细 胞常规复苏、培养、消化、传代，取对数生长期细胞消 化、离心，PBS洗涤3次，台盼蓝染色计数活细胞 > 95％。按 TRIzol试剂说 明书提取 T．Tn细胞总 RNA，一20℃冻存。 1．2．2 脐血 DCs的制备和转染 选择健康、足月 的孕妇，在胎儿娩出后立即采集脐血 50～100 ml／ 份。采用密度梯度离心法分离出单个核细胞以2× 1O 个细胞／孔接种于培养板。用含150 ml／L胎牛 血清的RPMI 1640培养液培养 2 h后，在贴壁细胞 中加入终浓度为 50 L rhSCF、100 g／L rhGM- CSF及 5 g／L rhIL-4，置于37 cIC、5％CO2的饱和湿 度培养箱中培养。隔天半量换液，同时补充上述细 胞因子，诱导 DCs生成。培养至第10天，用500 Ixl 无血清RPMI 1640培养基稀释l0 txg RNA，再用500 l无血 清 RPMI 1640培养 基稀 释 lO txl Lipo— fectamine 2000试剂，与稀释的 RNA混匀，加至 DCs 培养孔，置 37℃、5％CO2培养箱孵育 4 h。在实验 组培养孑L中加入 1，使其终浓度为50 L，继续 培养至第 11天。 1．2．3 脐血 DCs表面标志的鉴定 分别收集转 染前后各组的 DCs，PBS液洗 3次，用 PBS调整细 胞浓度为 1 X 10。／ml，加入 1：100稀释的小鼠抗人 MHC—I、MHC—II、CD80、CD86及 CD5 的单克 隆抗 体，室温孵育30 mm，PBS洗两次，弃上清。再加入 FITC一羊抗小鼠IgG(二抗)工作液 100 l，避光室 温孵育 30 min，PBS洗涤 细胞两次。加入 1 ml PBS，以同种型荧光染色的Ig作为对照调节电压， 以PBS代替一抗和二抗作为阴性对照，用流式细 胞术(FCM)进行检测 ，Expo32ADC进行免疫荧光 山东医药2008年第48卷第32期 数据分析。 1．2．4 RNA致敏 DCs对 T细胞增殖能力的影响 从脐带血中常规分离单个核细胞，贴壁细胞用于 DCs诱导。收集悬浮细胞 ，加入含 150 ml／L胎牛血 清的RPMI 1640培养液调整细胞密度为 1×10”／L， 通过尼龙毛柱分离 T细胞，调整细胞的密度为 2 X lO ／L。将 T细胞悬液加入到 96孔平底培养板中， 每孑L 100 l。每孔按 DCs与 T细胞 比例分别为 1：100、1：50、1：10加入 DCs，设 3个复孔，培养68 h。 每孔加入 M1Tr(5 L)10 I继续培养4 h。弃去上 清，每TLN人二甲亚砜 100 txl，震荡溶解颗粒，于波 长570 nm用酶标检测仪测定吸光度(A)值，计算刺 激指数(sI)。SI=实验组的A值／对照组的A值。 1．2．5 RNA致敏 DCs对 CTL杀伤活性的影响 将 2×10 ／L的T细胞悬液加入到 24孔培养板中，每 孔 1 ml。以DCs与T淋巴细胞 1：10比例加入 DCs， 每孔均加入 100 U／ml的rhIL-2，置37℃、5％CO2培 养 3 d。取传代 l2～24 h的T．Tn细胞为靶细胞，调 整细胞密度至 1×10 ／L，各取 100 l加入到96孔 平底培养板中。以活化的各实验组的 T细胞为效 应细胞，按效靶比为 10：1、20：1、50：1加入到 96孔 板中，每组设3个复孔，并设效应细胞对照组和靶细 胞对照组。37℃、5％CO 培养箱中孵育48 h。加 入MTr溶液15 l／，孑L，继续培养4 h后弃上清，每孔 加入二甲亚砜 100}xl，震荡溶解颗粒，用酶标检测仪 波长570 nm测定A值。杀伤活性 =[靶细胞对照 组A一(实验组A一效应细胞对照组A)]／靶细胞对 照组 A×100％。 1．2．6 统计学方法 采用 SPSS 13．0软件行 LSD 检验，所得结果采用x±s表示。以P≤O．05为有统 计学差异。 2 结果 2．1 DCs表面标志的表达 经食管癌 T．Tn细胞 RNA转染 +Tcd刺激组的脐血 DCs表面 MHC．I、 MHC—I1分子及协同刺激分子(CD 。、CDs6)、黏附分 子(CD )表达均明显高于 RNA单独转染组(P均 <0．05)。见表 1。 表1 肿瘤RNA转染前后脐血DCs表面标志的表达( 4-$) 注：与RNA转染前比较， P