牛心肌细胞色素C的制备和测定

实验一 细胞色素C的制备和测定 一、目的 1、 通过细胞色素C的制备，了解制备蛋白质品的一般原理和步骤。 2、 掌握制备细胞色素C的操作技术及含量测定方法。 二、原理 细胞色素C（cytochrome c，CytC）是多种能够传递电子的含铁蛋白质的总称。广泛存在于各种动植物组织和微生物中。它是呼吸链中极重要的电子传递体，细胞色素C只是细胞色素的一种。它在呼吸链上位于细胞色素还原酶和细胞色素氧化酶之间。线粒体中的细胞色素绝大部分与内膜紧密结合，仅有细胞色素C结合轻松，较易被分离纯化。 细胞色素C是以一种铁卟啉为辅基的呼吸酶为含铁卟啉的结合蛋白质，每个细胞色素C分子含有一个血红素和一条多肽链。分子质量约为13000，蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成，其中赖氨酸（19个）含量较高，为一碱性蛋白，等电点10.2-10.8，含铁量0.37-0.43%。它易溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可用酸性水溶液提取。细胞色素C的传递电子作用是由于细胞色素C中的铁原子可以进行可逆的氧化和还原反应，故可分为氧化性和还原性，前者水溶液呈深红色，后者水溶液呈桃红色。细胞色素C对热、酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起某些失活。 一般说来，组织的细胞色素C的含量与它们的呼吸活性大致成平行关系，在心肌与其它作剧烈运动的肌肉中含量最为丰富。 线粒体是否破裂和分解决定于酸性强弱，由于牛心肌的线粒体膜较难破裂，所以在用牛心肌提取时，将pH值从3.8降到3.4，才能使牛心线粒体膜裂解的数量多，提取完全，得到较高的收率。细胞色素c提取液含有多种等电点的杂蛋白，一般先调节pH除去等电点为6.0~6.5的杂蛋白，再调pH除去等电点为7.5 –8.0的杂蛋白，提取的过程实质是去杂的过程。 人造沸石为铝酸钠，它是一种阳离子交换剂，细胞色素C分子刚好进入它的面空隙。在pH7.5时细胞色素C呈正电荷，它可与沸石分子上的钠离子发生交换，从而被沸石吸附。而血红蛋白和肌红蛋白的等电点分别为6.9和7.0，在pH7.5时应带微弱负电荷，不能以静电引力交换吸附于沸石上，用蒸馏水、0.2％NaCI洗涤可去除。装入层析柱后，用25％硫酸铵洗脱，又可将细胞色素C交换下来，硫酸铵主要是降低沸石对细胞色素C的亲和力。 硫酸铵盐析可明显提高细胞色素C纯度，一般盐析l～2次。第一次盐析加固体硫酸铵至溶液比重为1.22，然后过滤去除杂蛋白，再加硫酸铵使溶液比重至1.24，第二次盐析后还能除去少量杂蛋白。另外，低温盐析和延长盐析时间，均有利于除去杂蛋白，同时高浓度硫酸铵有防腐作用，细胞色素C盐析液可较长时间存放。 三氯乙酸可引起细胞色素C变性和聚合。必须严格控制三氯乙酸用量、沉淀温度和时间，提取时三氯乙酸与细胞色素C溶液都应预先冷却至4℃左右，加入时要防止局部过浓，立即离心，迅速加蒸馏水稀释。用去离子水透析，不时搅拌，过一定时间应更换去离子水，有利于提高收率。 三、试验材料、试剂和仪器 1、材料：新鲜（冷冻）牛心样品。 2、试剂 （1）25% （NH4）2SO4， 12%BaCl2， 联二亚硫酸钠。 （2）人造沸石：白色颗粒，不溶于水，溶于酸。选用60-80目。 （3）20% 三氯乙酸（TCA）、1mol/L H2SO4（55.5ml/L）、2mol/L NH4OH（67.6ml/L）溶液、0.2% NaCl、细胞色素C液（1mg/ml）。 3、仪器：绞肉机、电磁搅拌器、离心机、分光光度计、透析袋等 四、实验方法 1、 材料处理 取健康新鲜或冷冻牛心，除去脂肪及韧带等结缔组织，用生理盐水漂洗除去血污，称取200g，剪碎，加300ml pH3.4的酸化水（水预先用6~8ml，1mol/L的硫酸酸化），放入绞肉机中绞碎成匀浆状(泛白色)（两遍）。 2、 细胞色素C粗品制备 （1）提取： 用电磁搅拌器搅拌提取2h，搅拌过程中保持PH=3.4（土灰色，需要不断调整）。然后用2mol/L的氨水调PH=6.0，静置30min，使一部分杂蛋白和肉渣等杂质易于沉淀。四层纱布挤压过滤，收集滤液(呈橙红色)。再将肉渣提取1次，合并提取液。 （2）中和： 用1mol/L的氨水调滤液PH=7.2-7.5，利用等电点沉淀杂蛋白，静置20~30分钟，使沉淀沉下。吸取上层澄清液，过滤下部稠液，收集滤液与上层清液合并。或下部浑浊液离心（3000rpm,15min）。合并得到的红色清液，测量体积。 （3）吸附： 每人称取人造沸石4g，加水搅拌，除去12s内不下沉的细颗粒。向柱内加去离子水至1/2体积，然后边搅拌边连续、均匀地将预处理好的人造沸石水溶液装填入柱，避免柱内出现气泡。装柱完毕，打开柱下端夹子，使柱内沸石面上剩下一薄层水。 将中和好的澄清滤液小心加到沸石上面，勿冲动沸石，使之流入柱内进行吸附，控制流出液的速度不超过10ml/min。随着细胞色素C被吸附，人造沸石由白色变为红色，流出液应为淡黄色或微红色。 （4）洗涤 吸附完毕，可在柱内洗涤：依次用30ml自来水、去离子水、0.2%氯化钠溶液、去离子水洗柱。 （5）洗脱 用25%硫酸铵溶液洗脱（流速小于2ml/min），收集红色洗脱液（洗脱液一旦变白，立即停止收集），测量体积（控制在15ml左右）。洗脱完毕，人造沸石回收，可再生使用。 （6）盐析 为了进一步提纯细胞色素C，向洗脱液中缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌，使硫酸铵溶液浓度为45%（约相当于67%的饱和度，即100ml洗脱液加17g硫酸铵），置4℃冰箱过夜，杂蛋白沉淀析出，过滤，收集红色透亮的细胞色素C滤液或离心取清液，测量体积。 （7）TCA 沉淀 按8%体积滴加预冷的（4℃）20%TCA，边加边搅拌，加时要快，防止局部蛋白质变性。此时细胞色素带正电荷，与其结合生成可逆沉淀析出，立即离心（3000rpm，15min）,收集沉淀（若上清液仍为红色，倒出后再补加5%体积的TCA，再次离心，收集沉淀）。沉淀用少量去离子水溶解（体积不超过10mL）。 （8）透析 溶解液装入透析袋对自来水（30min）、去离子水（10~20min）透析（用磁力搅拌器搅拌），用BaCl2 检测袋周围水的SO42-（用试管收集透析液约1ml，滴加1-2滴BaCl2试剂至试管中。摇匀若无白色沉淀，表示透析完全）。过滤除去不溶物质，得到细胞色素C的粗品液，量体积，测定其含量。 3、 细胞色素C粗品液浓度定量测定（标准管法） 细胞色素c粗品是还原型和氧化型两种产品的混合物，在测定含量时，要加入联二亚硫酸钠，使混合物中的氧化型转变为还原型。在520nm 处，用光度计测定样品与标准的吸光值，可算出粗品含量。 取5支试管按表加入试剂测定： 试管编号 1 2 3 4 5 标准液/ml 0 0.5 0.5 0 0 样品液/ml 0 0 0 0.5 0.5 dH2O 3.0 2.5 2.5 2.5 2.5 还原粉 少许（约3mg） 少许（约3mg） 少许（约3mg） 少许（约3mg） 少许（约3mg） A520nm 粗品A520nm×C标准×V标准 细胞色素C粗品质量浓度（mg/ml）=_______________________________ 标准溶液A520nm×V粗品 4、细胞色素C样品定性鉴别 取样品液lml，滴加20％-氯乙酸溶液，若生成棕红色凝乳状沉淀，溶液的红色消失，且该沉淀能在水中溶解，溶液呈红色，即可定性说明细胞色素c正常。 5、精制过程 (1)将透析毕的溶液上Sephadex G一200柱→用0.1 mol/L NaC1—60 m mol／L Na2HPO4洗脱，收集出峰时的洗出液。 (2)将流出液装透析袋对水透析至无Cl-(AgNO3检测)。 (3)透析后置表面皿，冰箱冷冻，经冰冻干燥器可得纯品 (平均收率为146．3mg／kg)。 6、Cyt C纯度鉴定 （1）采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行杂蛋白的检测。 分离胶浓度为l0%，浓缩胶浓度3%，染色采用常规固定染色法。精制后Cyt C的电泳谱带仅一条纯度较高．粗品溶液谱带有3条，所含杂蛋白较多，说明所用提纯方法有效。 （2）凝胶层析法检测 检测波长280 nm时，用Sephadex G一200凝胶柱层析法分离Cyt C，若只出现一个峰，说明纯度较高。 注意事项 1. 酸水提取时，由于组织液的释出使pH上升，因此需不断调整pH直至稳定在pH3.4-3.8。 2. 为使细胞色素C充分被沸石柱吸附，吸附时流速应该慢些。洗脱时同样控制流速慢些，使细胞色素C在比较少体积内被充分洗脱出来。 3. 盐析时需加入粉末状硫酸铵，并且边加边搅拌，切忌一下子到进去，造成局部浓度过大使细胞色素C被盐析。 4. 三氯乙酸是一种蛋白变性剂，可使蛋白质变性沉淀。要通过控制三氯乙酸的浓度和作用时间，使其产生的是可逆沉淀，达到进一步纯化作用。因此必须要逐滴加入三氯乙酸，搅匀后尽快离心，避免局部酸浓度过大和接触时间过长，产生细胞色素C不可逆变性沉淀造成损失。 5. 透析脱盐是利用细胞色素C分子较大，不能通过一定截留值的半透膜，而其中的盐分由于分子较小，浓度很高，容易透过半透膜从高浓度向低浓度的水相移动，达到去除效果。并且在透析前一定要检查透析袋有无渗漏。 6. 为尽量减少损失，在每个操作过程都要细心，例如过滤用的纱布、滤纸事先一定要用少量水润湿。 7. 加入过多还原粉（联二亚硫酸钠）会使测定溶液迅速变混浊而无法比色，因此加入量应严格控制，并迅速比色。 思考题：1、还有那些方法可以进行蛋白质脱盐处理？ 2、了解酶活力测定原理及方法。