鼠尾胶原的提取步骤

鼠尾胶原的提取步骤： 1. 配置含4.5mmol/l Nacl 和0.05mol/l Tris-base 的Tris-Hcl溶液（用盐酸将其PH值调至7.5） 2. 于－20度冰箱中取出鼠尾，75%或70％酒精浸泡，解冻 3. 在一小培养皿中放置少量生理盐水，并置于电子称上，调零 4. 取鼠尾，去皮，由尖部向前分段抽取肌腱，置于生理盐水中，称重，再倒掉生理盐水，酒 精中浸泡20分钟 5. 去除酒精，三蒸水清洗肌腱，剪断，放入Tris-Hcl中，4度过夜 6. 去除Tris-Hcl，浸入0.1％L/L的醋酸溶液中，4度放置数天，（5克肌腱约2升醋酸） 7. 离心胶原溶液，（1200rpm 10min) 取上清 8. 放300目滤网于滤器中，消毒，抽滤上清液，第7和8步尽量在冰上操作 9. 每600上述粗提液加100ml 0.14mol/l NaOH溶液离心，（8000rpm 5min) 其上清，留絮状沉淀物 10. 将絮状沉淀物置于三蒸水中，用0.1mol/l(1000:6) 醋酸溶解絮状沉淀物，加入消毒过的搅拌子，冷房搅拌数天，得絮状胶原。 注意所有和胶原有关的操作都在冰上进行\ Rat tail collagen type I 提取工艺: 1. 配置含4.5 mmol/L NaCl 和0.05mol/l Tris-base 的Tris-HCl溶液（用盐酸将其pH值调至7.5）； 于-20℃冰箱中取出鼠尾，浸泡75%或70%酒精，解冻； 在一小培养皿中放置少量生理盐水，置于电子秤上，调零； 取鼠尾，去皮，由尖部向前分段抽取肌腱，置于生理盐水中，称重，倒掉生理盐水，酒精浸泡20 min； 去除酒精，三蒸水清洗肌腱，剪断，放入Tris-HCl溶液中，4℃过夜。 2. 去除Tris-HCl，浸入0.1 mol/L的醋酸溶液中，4℃放置数天（5g肌腱约2L醋酸）。 3. 离心胶原溶液(1600 rpm，15 min)，取上清；置300目筛网于滤器（高压灭菌）中，抽滤上清液。 4. 每600 mL上述粗提液中加100 mL 0.14 mol/L NaOH溶液，离心(18000 rpm，12 min)，弃上清，留絮状沉淀；将絮状沉淀转移至锥形瓶中，用0.1 mol/L的醋酸溶液(200 mL)振摇促其重新溶解。 5. 透析袋预处理 6. 将溶解的胶原醋酸液装入透析袋中，浸没于蒸馏水中透析一周，并每12 h换液一次。 7. 胶原醋酸液在 -70℃超低温冰冻两天。 8. 用一次性注射器戳洞封盖冰冻好的含胶原培养皿保鲜膜，真空冷冻干燥呈干棉花样外观（至少24 h）。 9. 准确称取配置3 mg/mL 的胶原醋酸液，加入消毒过的搅拌子，冷房搅拌数日得絮状胶原。 10. 胶原蛋白凝胶制备预试- ①胶原液：5*DMEM：血清：10*HEPES液=6：2：1：1，充分混匀； ②0.5 M NaOH 调定pH值至7.2（综合DMEM颜色变化和pH试纸判断）； ③置于37℃烘箱2 h待其凝结。