氧化苦参碱大鼠肠道吸收机理及吸收部位的研究

� 研究原著 � 中国临床药理学与治疗学中国药理学会主办 CN 34�1206�R, ISSN 1009�2501 E�mail: ccpt96@ 21cn. com 2005 Dec; 10( 12) : 1326- 1329 2005�09�24收稿 � 2005�11�01修回 国家 863计划( 2003AA2Z347A; 2003AA2Z347B) 王素军,男,博士后,研究方向:中药药代动力学。 Tel: 010�66930633 � E�mail : wsj7272@ sina. com 王广基,通讯作者,男,博士生导师,教授,研究方向:药代动力学。 Tel: 025�83271544 � E�mail : gjwang@ cpu. edu. cn 氧化苦参碱大鼠肠道吸收机理及吸收部位的研究 王素军,王广基1 ,李晓天1 ,杨 敏1 ,阮金秀,张振清 军事医学科学院毒物药物研究所药物代谢重点实验室,北京 100850; 1中国药科大学药物代谢研究中心, 南京 210038,江苏 摘要 � 目的:探明氧化苦参碱在大鼠肠道各区段的 吸收动力学特征、吸收部位及吸收机制,以期对药物 长效缓释制剂的提供重要依据。方法: 采用大 鼠在体肠灌流吸收实验, 研究了氧化苦参碱的吸收 部位和吸收动力学特征。结果: 氧化苦参碱在肠道 的吸收呈现一级吸收动力学特征且吸收机制为被动 转运。药物在小肠部位吸收良好, 吸收速度按空肠、 回肠、十二指肠、结肠的顺序依次下降, 吸收速率常 数依次为 0. 237、0. 225、0. 200 和 0. 062 h- 1。结论: 氧化苦参碱的吸收窗比较长, 适于制备缓释给药系 统。 关键词 � 氧化苦参碱;大鼠;吸收部位; 吸收机理; 被 动转运 中图分类号: R965. 1 文献标识码: A 文 章 编 号: 1009�2501( 2005) 12�1326�04 氧化苦参碱是从豆科植物苦参的干燥根中提取 的一种苦参型生物碱。基础药理与临床研究明主 要有抗癌、抗病毒及明显升高白细胞作用,具有广阔 的开发前景 [ 1] 。目前氧化苦参碱在临床上主要用于 治疗慢性乙型病毒性肝炎[ 2,3] , 需长期服药, 很有必 要开发成缓释制剂用于临床。而探明药物在肠道各 段的吸收特性和有效吸收部位对合理选择处方, 控 制药物的释放部位,延长药物在吸收部位的滞留时 间,制备长效缓释制剂具有一定指导意义。鉴于氧 化苦参碱在肠道的吸收特性尚未见报道, 本文采用 大鼠在体肠灌流的方法对氧化苦参碱的肠道吸收动 力学进行了实验研究, 希望为其长效口服缓释制剂 的研究提供一定的生物药剂学依据。 1 � 材料与方法 1. 1 � 仪器、试剂和动物 � Agilent 1100 LC�MSD液相 色谱�质谱联用仪;HL�2恒流泵(上海沪西仪器厂) ; 752C型分光光度计 (上海分析仪器三厂) ; Milli�Q Gradient A10超纯水器(Millipore Inc,美国) ; 501型超 级恒温水浴锅(上海市实验仪器厂) ; SUPERT21高速 冷冻离心机( SOR�VALL公司, 美国)。酚红(上海试 剂三厂) ; 甲醇(色谱纯, 美国 Tedia 公司) ; 醋酸胺 (分析纯,南京化学试剂厂) ;内标物非那雄胺 (南京 圣和科技有限公司) ; 氧化苦参碱(黑龙江医药工业 研究所提供)。雄性 SD大鼠, 体重 200 ! 20 g, 中国 药科大学实验动物中心提供, 动物合格证号: SCXK (苏) 2002�0016。 1. 2 � 肠循环液中酚红的曲线 � 精密吸取酚红 标准储备液 ( 0. 5 mg∀ml- 1 ) 0. 1、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、 1. 0、1. 2、1. 6 ml,用Krebs�Ringer缓冲液(每 1 000 ml 内含 NaCl 7. 8 g、KCl 0. 35 g、CaCl20. 37 g、MgCl2 0. 22 g、NaH2PO40. 22 g、葡萄糖 1. 4 g、NaHCO31. 37 g, pH 为 7. 4)分别稀释至 10 ml, 配成 5、10、20、30、40、50、 60、80 �g∀ml- 1的标准液。分别吸取配好的标准液 0. 5 ml, 加入1 mol∀L- 1 NaOH 0. 5 ml显色,用 752紫 外分光光度计,在 550 nm测定吸光度,以吸光度( A ) - 浓度( C )作图, 得酚红在小肠液中的标准曲线方 程为: A = 0. 0126C+ 0. 0178( r= 0. 9987, n = 5)。 1. 3 � 大鼠肠吸收的测定 � 供试液的配制: 取 Krebs� Ringer 缓冲液,加酚红标准储备液( 0. 5 mg∀ml- 1 ) ,配 成酚红浓度 20 �g∀ml- 1 ,取 50 ml加入规定剂量的氧 化苦参碱使成4、20、100、500 �g∀ml- 1。 ∀1326∀ 大鼠在体肠管灌流[ 4, 5] :取禁食 12 h(自由饮水) 的大鼠, 20%乌拉坦溶液腹腔注射( 0. 6 ml∀100 g- 1 ) 麻醉并加以固定, 沿腹中线打开腹腔, 结扎胆总管, 在需考察部位的两端剪开小口, 插管, 结扎。以 3 ml∀min- 1的流速用37 # 生理盐水循环冲洗 20 min, 换成 Krebs�Ringer液循环 10 min之后, 改用 50 ml供 试液, 通氧气搅拌, 以 3 ml∀min- 1的流速循环 10 min, 取样 1 ml, 作为 0时间点, 然后将流速调至 2. 5 ml∀min- 1 ,分别在 0. 5、1、1. 5、2、2. 5和 3 h取样 1 ml (其中 0. 5 ml用于酚红含量的测定) ,同时补加 2 ml 的酚红溶液( 20 �g∀ml- 1 )。以 LC�MS 测定灌流液中 氧化苦参碱的含量变化。以紫外分光光度计测定灌 流液中酚红浓度的变化, 校正灌流液体积的变化。 小肠在体灌流区间如下: 自十二指肠上部至回肠下 部。分段肠灌流观察的肠段区间均取10 cm, 各肠段 区间如下:十二指肠段自幽门 1 cm 处开始; 空肠段 离幽门 15 cm 开始; 回肠段自盲肠上行 20 cm 处开 始;结肠段自盲肠后段开始。小肠循环液的处理: 小 肠循环液离心后取 0. 2 ml,加入 8 �g∀ml- 1非那雄胺 内标溶液 25 �l, 加氯仿 3 ml, 涡旋 3 min, 4 000 r∀min- 1离心 10 min, 取下层有机层 2. 5 ml于另一离 心管, 氮气流吹干, 加入流动相 200 �l, 涡旋溶解。 15 000 r∀min- 1离心 10 min,取 20 �l上清行LC�MS分 析[ 6]。另取 0. 5 ml小肠循环液加 5 ml NaOH 溶液( 1 mol∀L- 1 )显色,用 752型分光光度计在 550 nm处测 定吸光度,用于校正循环液体积。 小肠循环液 LC�MS 分析法: 液相色谱条件: 色 谱柱采用 Lichrospher C18柱, 250 mm ∃ 4. 6 mm( ID) , 5 �m(汉帮科技有限公司) ; 柱温 25 # 。流动相为 10 mmol∀L- 1 醋酸胺水溶液 �甲醇 ( 25 �75) , 流速 1 ml∀min- 1。质谱检测条件: 电喷雾离子化 ( ESI )方 式,检测离子为正离子, 氧化苦参碱( m�z + H) + 265. 1,内标非那雄胺 ( m�z+ H ) + 373. 3; 裂解电压 为 120 V, 干燥气体( N2 )流速 11 L∀min- 1 , 喷雾压力 40 psi,干燥气体温度 350 # ,毛细管电压 4 000 V。 1. 4 � 数据处理 � 酚红用以定量肠循环液的体积,从 而将肠循环液中实测氧化苦参碱浓度经过体积校正 (因肠循环液中有部分循环水被吸收造成体积变化) 后,求得循环液中氧化苦参碱的实际浓度,计算出氧 化苦参碱在肠中的吸收量,最后以剩余量的对数对 取样时间作图, 求出表观吸收速率常数 K a, 两组间 数据的比较采用双侧 t 检验。 2 � 结果 2. 1 � 色谱行为 � 大鼠小肠循环液处理后经 LC�MS 测定(图 1) , 在上述色谱系统中, 分离效果良好, 色 谱行为较佳, 氧化苦参碱和内标非那雄胺的保留时 间分别约为 2. 4 min和 7. 1 min。 图 1� LC�MS测定大鼠小肠循环液中氧化苦参碱色谱图 A:大鼠空白小肠循环液; B:大鼠空白小肠循环液加氧化苦参碱( 1 �g∀ml- 1)和内标非那雄胺( 1 �g∀ml- 1 ) ; C: 4 �g∀ml- 1氧化苦参碱于大鼠小肠 循环灌流 2 h时肠循环液; 1:氧化苦参碱; 2:非那雄胺 2. 2 � 肠壁物理吸附的排除 � 剪取清洗后的大鼠肠 段约 10 cm,用玻璃棒将粘膜层翻出, 置于 50 ml的 氧化苦参碱药液( 4 �g∀ml- 1 )中, 于 37 ! 0. 5 # 孵育 3 h, 取出肠段, 测定孵育液的药物浓度, 得浓度为 原药物浓度的( 99. 5 ! 0. 4) % ( n= 5) , 可认为大鼠肠 壁对药物基本无物理吸附。 2. 3 � 空白回流液对氧化苦参碱化学降解的排除 � 将大鼠做全肠道插管,用K�R液 150 ml回流3 h, 用 回流液配制 3份药液( 4 �g∀ml- 1 ) , 置 37 ! 0. 5 # 孵 育 3 h, 测定孵育前后药物浓度,计算孵育后剩余百 分比为( 99. 3 ! 0. 5) % ( n= 5) ,表明氧化苦参碱在缓 冲液中无化学降解。 ∀1327∀中国临床药理学与治疗学 2005 Dec; 10( 12) 2. 4 � 不同浓度的氧化苦参碱在大鼠小肠的吸收 � 氧化苦参碱在 4、20、100、500 �g∀ml- 1的浓度下对大 鼠小肠段进行循环灌流 3 h,药物的吸收量和吸收速 率常数 Ka 见表 1。氧化苦参碱在不同浓度条件下 的吸收量随药物浓度的增大而增大,表观吸收速率 常数K a 无统计学差异, 药物吸收无浓度饱和现象, 符合 Ficks扩散原理,说明氧化苦参碱在小肠吸收主 要表现为被动扩散吸收机制。 2. 5 � 氧化苦参碱在大鼠不同肠段吸收 � 氧化苦参 碱在 100 �g∀ml- 1的浓度下对大鼠不同肠段灌流 3 h,各肠段的剩余量和吸收速率常数 Ka分别见表 2, 图2。由图 2可知, 吸收速率常数按空肠、回肠、十 二指肠和结肠的顺序依次下降, 空肠、回肠、十二指 肠的吸收速率常数两两比较无显著性差异 ( P > 0. 05) ,结肠段与其它区段的吸收速率常数相比, 具 有有明显差异( P< 0. 01)。结果表明氧化苦参碱在 结肠以上小肠部位皆有良好的吸收, 在结肠也有一 定量的吸收,该药吸收窗较长,适于制备缓释给药系 统。 表 1� 不同浓度的氧化苦参碱在大鼠小肠循环灌流 3 h后的 吸收量和吸收速率常数( x ! s , n= 6) 氧化苦参碱浓度 ��g∀ml- 1 吸收量 �mg∀10 cm- 1 Ka�h - 1 4 0. 068! 0. 007 0. 427! 0. 031 20 0. 247! 0. 027 0. 419! 0. 022 100 1. 193! 0. 126 0. 428! 0. 053 500 6. 361! 0. 704 0. 441! 0. 028 表 2� 100 �g∀ml- 1氧化苦参碱在大鼠不同肠段循环灌流不同时间后的剩余量( x ! s, n= 6, mg) 时间�h 十二指肠 空肠 回肠 结肠 0 4. 86 ! 0. 07 4. 76! 0. 11 4. 78! 0. 09 4. 90! 0. 04 0. 5 4. 48 ! 0. 11 4. 25! 0. 15 4. 36! 0. 09 4. 74! 0. 10 1. 0 4. 11 ! 0. 17 3. 80! 0. 12 3. 97! 0. 16 4. 59! 0. 11 1. 5 3. 76 ! 0. 15 3. 46! 0. 14 3. 47! 0. 13 4. 46! 0. 14 2. 0 3. 37 ! 0. 30 3. 04! 0. 12 3. 15! 0. 14 4. 32! 0. 12 2. 5 3. 00 ! 0. 33 2. 65! 0. 22 2. 80! 0. 15 4. 20! 0. 11 3. 0 2. 69 ! 0. 29 2. 33! 0. 19 2. 43! 0. 16 4. 07! 0. 13 图 2� 氧化苦参碱在大鼠不同肠段的吸收速率常数( Ka ) 与结肠段相比较cP < 0. 01 3 � 讨论 已有文献报道 [7] , 胆汁排泄是氧化苦参碱的主 要排泄途径之一,且其在肠道存在肠肝循环, 本文依 据药物在肠道中的消失量来确定药物的吸收, 因而 在试验时对大鼠进行了胆管结扎。药物吸收主要分 为被动转运和转运酶参与的主动转运两种机理, 目 前确定吸收机理的依据主要有: 主动转运方式吸收 的药物, 在高浓度时主动转运化合物的吸收能被饱 和;主动转运化合物的吸收能被酶抑制剂抑制; 主动 转运化合物的吸收具有能量依耐性; 转运速度受温 度的影响。被动转运方式吸收的药物, 在很大浓度 范围内按 Ficks方程吸收, 在吸收面积不变时,随着 浓度增加,吸收量线性增大, 而通透系数为一常数。 主动转运所需的转运酶的数量不一定, 在较低浓度 时,随着药物浓度增加, 参与转运的酶数量增多, 吸 收量增大,在较高浓度时, 所有的酶均已参与转运, 而达饱和,此时增加药物浓度,吸收量不再增大。主 动转运药物吸收符合米氏方程。在 4~ 500 �g∀ml- 1 的较宽浓度范围内氧化苦参碱吸收量与浓度呈线性 关系,无高浓度饱和现象, 吸收速率常数基本不变, 表明氧化苦参碱在大鼠肠道主要以被动转运方式吸 收。 吸收部位的实验结果对氧化苦参碱剂型设计具 有重要的意义。对于集中在胃或肠道上中部吸收的 ∀1328∀ Chin J Clin Pharmacol Ther 2005 Dec; 10( 12) 中短吸收的药物,释药系统应以延长制剂在胃肠道 上部的滞留为设计的主方向; 对于主要在胃肠道上 中部吸收,但在下部仍有一定吸收的药物,释药系统 则应尽量以延长制剂在胃肠道上中部的滞留时间以 及促进下段对药物的吸收为设计方向; 而对于以全 肠道为吸收窗, 乃至结肠、直肠仍有良好吸收的药 物,释药系统的设计,应主要着眼于使制剂中的药物 在所规定时间内尽可能均匀释放即可。上面的吸收 实验已经证实氧化苦参碱在结肠以上小肠部位皆有 良好的吸收,吸收窗较长,适于制备日服一次的缓释 给药系统。另外氧化苦参碱在结肠的吸收速度明显 下降,故设计氧化苦参碱日服一次的缓释制剂时, 最 好能延长制剂在胃肠道上中部的滞留时间, 并保证 药物的有效吸收,同时控制制剂在胃肠道中有合适 的释药速度。延长药物在胃肠道的总滞留时间目前 常采用3种方法:一是应用膨胀骨架片,二是应用水 动力学平衡原理(HBS)制备片剂或胶囊,三是基于 黏膜黏附原理的释药系统。今后拟采用膨胀(亲水 凝胶骨架)和黏膜黏附原理相结合的方法制备氧化 苦参碱缓释片。亲水凝胶具有一定的膨胀和黏附性 能,能够一定程度延长药物在胃肠道上中部的停留 时间。但是氧化苦参碱在我们以前的实验研究中发 现在犬体内存在明显的代谢[ 8, 9] ,且代谢物苦参碱更 易吸收 [ 10, 11] ,这是否影响氧化苦参碱的剂型设计和 疗效尚需进一步试验证实。 参 考 文 献 1 � 刘铮,王莉. 苦参素注射液的临床应用[ J] . 中国新医药, 2003; 2: 66- 7 2� 陆伦根,曾民德,茅益民, 李继强, 万谟彬, 李成忠, 等. 氧 化苦参碱胶囊治疗慢性乙型病毒性肝炎的随机、双盲、安 慰剂对照多中心临床研究(� ) [ J] . 肝脏, 2002; 7: 218- 21 3� 茅益民,曾民德,陆伦根, 李继强, 万谟彬, 李成忠, 等. 氧 化苦参碱胶囊治疗慢性病毒性肝炎肝纤维化的随机、双 盲、安慰剂对照多中心临床研究( % ) [ J] . 肝脏, 2002; 7: 222- 4 4 � Barthe L, Woodley J, Houin G. 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Determination of matrine in beagle dog plasma by liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry and its application to pharmacokinetic studies[ J] . Clin Pharmacol Exp Ther Asia, 2005; 2: 64- 7 Absorption mechanism and absorption site of oxymatrine in rats WANG Su�jun, WANG Guang� ji1, LI Xiao�tian1, YANG Min1 , RUAN Jin�xiu, ZHANG Zhen�qing Institute of Pharmacology and Toxicology , Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850 , China; 1 Key Lab of Drug Metabolism and Pharmacokinetics, China Pharmaceutical University , Nanjing 210038 , Jiangsu, China ABSTRACT � AIM: To study the absorption mechanism and absorption site of oxymatrine in rats. METHODS: The absorption kinetics and absorption site of oxymatrine were invest igated using in situ perfusion method in rats. RESULTS: The absorption mechanism of oxymatrine complied with the passive diffusion and first order kinet� ics. The absorption rate decreased according to the turn of jejunum, ileum, duodenum and colon. The absorption rate constants were 0. 237, 0. 225, 0. 200 and 0. 062 h - 1 at jejunum, ileum, duodenum and colon, respectively. CONCLUSION: Oxymatrine can be prepared and pro� cessed into sustained�release dosages forms. KEY WORDS � oxymatrine; rats; absorption site; ab� sorpt ion mechanism; passive diffusion. ∀1329∀中国临床药理学与治疗学 2005 Dec; 10( 12)