主动载药法制备硫酸长春新碱脂质体及其包封率的测定

主动载药法制备硫酸长春新碱脂质体及其包封率的测定 赵妍1，-，于彬1，邓意辉1*，肖利颖1(1．沈阳药科大学药学院，辽宁沈阳110016；2．中国医科大学基础医学院，辽宁沈阳110001) 摘要：目的制备硫酸长春新碱脂质体，建立包封率测定方法。方法采用pH梯度法制备硫酸长春新碱脂质体；以阳离子交 换树脂分离脂质体和游离药物；用RP-HPLC测定脂质体的包封率。结果硫酸长春新碱脂质体包封率大于85％；在所建立的 色谱条件下硫酸长春新碱与辅料及溶剂峰分离良好；硫酸长春新碱在1．0。12．5nag·L-1内线性关系良好(r=0．9999)；精密度 和回收率均合格。结论pH梯度法适于制备硫酸长春新碱脂质体，所建立的方法准确可靠，简单快速，可以用于硫酸长 春新碱脂质体包封率的测定。 关键词：pH梯度法；硫酸长春新碱；脂质体；高效液相色谱法；包封率 中图分类号：R943．41 文献码：A 文章编号：1001—2494(2005)20—1559—04 Preparationofliposomesentrappedvincrislinesulfatebyactiveloadinganddeterminationofitsentrapmenteffi- ciency ZHAOYahl，一，YUBinl，DENGYi—huiH，XIAO“．yil】91(1．School矿‰mw，ShenyangPtumnacaai甜University，Shenyang 110016，China；2．CollegeofBasicMedicalSciences，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，China) AK．qlliAcr：OBJECTIVETopreparevincristinesulfateliposomesandtodevelopamethodfordeterminingitsentrapmentefficien- cy．MEqMODSVineristinewasencapsulatedintheliposomesusingthepHgradient-dependentremoteloadingtechnique．Freevineristine andliposomeswereseparatedbycationexchangeresinandRP-HPLCWasappliedtodeterminetheentrapmentefficiency．蛐．SULTSTheen- trapmentefficiencyofvineristinesulfateliposemespreparedbypHgradientmethodexceeded85％．TheRP-HPLCmethodwasvalidatedand vincristinesulfateWaSwellseparated．Thestandardcu．uvewaslinearovertherangeof1．0～12．5mg·L一1withthecorrelationcoefficientof 0．9999．CO。NCLUSIONThepHgradienttechniqueissuitableforpIq面I唱vincristinesulfateliposomes．Thismethodestablishedinthis studyfordeterminationoftheentrapmentefficiencyofvincristinesulfateliposomesissimple，rapidandaccurate． KEYWORDS：pHgradients；vincristinesulfate；liposome；I-IPLC；entrapmentefficiency 长春新碱(vincristine，Vcr)是长春花生物碱类抗 肿瘤药物，对白血病、淋巴瘤等均有显著的抗肿瘤活 性。现有的Vcr注射剂存在着半衰期短，神经系统 和胃肠道系统毒性强的缺点。为了增强药物的靶向 性，延长体内滞留时间，增强疗效，降低毒性，加拿大 的INEX公司研究开发了硫酸长春新碱脂质体(vin— cristinesulfateliposomes，vcrL)，目前正在美国和加拿 大进行Ⅱ／Ⅲ期临床试验。其动物体内实验和临床 前的研究明，将长春新碱制成脂质体，可以改善药 物体内行为，降低毒性，提高疗效uJ。本实验采用 pH梯度法，以氢化大豆卵磷脂／胆固醇(HSPC／Ch01) 为脂质体膜成分，制备了vcrL，以自制的阳离子交 换树脂小柱分离脂质体和未包封的游离药物，同时 采用RP-HPLC测定VcrL的包封率，为制剂的质量评 价、质量控制提供了可靠的依据。 1仪器与试药 1．1仪器 756MC型紫外一可见分光光度计(上海第三分析 仪器厂)；DAD230高效液相色谱仪(大连依利特公 司)；FC204分析天平(上海精科仪器厂)；JY92—2D 超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所)；PHS一 25型pH计(上海精科雷磁)；DF一101S集热式恒温 加热磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂)； NICOMpTM380粒度测定仪(PSSSantaBarbaraUSA)。 1．2试药与试剂 硫酸长春新碱(广州环叶制药有限公司)；硫酸 长春新碱对照品(中国药品生物制品检定所)；氢化 大豆卵磷)J旨(i4sPc，德国)；胆固醇(Chol，药用，温州 市瓯海食品生化厂)；阳离子交换树脂(上海树脂 厂)；其他试剂均为分析纯。 2方法与结果 2．1 pH梯度法制备硫酸长春新碱脂质体 作者简介：赵妍，女，硕士研究生，助教 。通讯作者：邓意辉，男，博士，副教授 Tel／Fax：(024)23986316E-mail：dds-666@163．Ⅻn ChinPharmJ，2005October，V01．40No．20·1559· 万方数据万方数据 2．1．1空白脂质体的制备将HSPC，Chol按2：1 混合，加适量无水乙醇，于65℃水浴加热溶解，挥除 乙醇，加枸橼酸缓冲液(300mmol·L～；pH4．30)，水 化(脂质质量浓度50g·L-1)，在65℃水浴中磁力搅 拌30min，探头超声8min后依次通过0．8和O．45 姗的微孔滤膜，即得空白脂质体混悬液。 2．1．2空白脂质体的载药取“2．1．1”项下的空白 脂质体0．2mL，加1．0mL硫酸长春新碱溶液(1g· L．1)及Na2HI的4溶液(500mmol·L。1；pH9．05)0．6 mL，加注射用水0．2mL使外水相pH为7．30，在60 ℃水浴保温10min，即得硫酸长春新碱脂质体。 用粒度测定仪分别测定空白脂质体和含药脂质 体的粒度。实验结果见表1。 表1脂质体粒径的高斯分布 Tab1 Gaussinadistributionanalysisofliposome 载药前后脂质体粒径均约为200砌，载药后粒 径略有减小，但变化不大。 2．2硫酸长春新碱色谱条件的选择 2．2．1色谱柱KromasilC18(4．6nlIn×200I砌，5 ／an)；流动相：1．0mL二乙胺溶于60rllL水中，用磷 酸调pH至7．0，加甲醇140mL混匀，过滤，脱气即 得；柱温：35oC；进样量：20ktL；流速1．2mL·min～。 2．2．2检测波长的确定由二极管阵列(DAD)检 测器得出硫酸长春新碱的三维图谱(图略)，光谱图 见图1。 图1硫酸长春新碱的光谱图 隐1 Spectrumchartofvincrisfinesulfate 由图可知，硫酸长春新碱在本流动相中于 297．8nln处有最大吸收，故而确定298Bin为检测波 长。 2．3色谱行为 取空白脂质体破乳溶液、硫酸长春新碱对照品 溶液、硫酸长春新碱脂质体破乳溶液各20皿进样 分析，得色谱图2(A，B，C)，由图2可知空白脂质体 ·1560·Ch／nPharmJ，2005October，Ⅲ．40No．20 对药物测定无干扰。硫酸长春新碱色谱峰保留时间 约为6min。 图2硫酸长春新碱的HPLC图 A一空白脂质体；B一硫酸长春新碱溶液；c一硫酸长春新碱脂质体；1一硫酸长 春新碱 №2 HPLCchromatogramsofvincristinesulfate A—blankliposomes；B—vinctistinesulfatesolution；C—vincristinesulfateliposomes；1 ．．vincristinesulfate 2．4曲线 2．4．1对照品储备液的配制精密称取硫酸长春 新碱对照品10．0mg，以去离子水溶解，得质量浓度 为1g·L-1的对照品储备液，置4℃冰箱中保存。 2．4．2 标准曲线的绘制 取上述对照品储备液 1．0mL，用去离子水稀释成0．1g·L。1的溶液，将其 用75％的甲醇稀释成质量浓度分别为1．00，2．50， 5．00，7．50，10．0，12．5mg·Lo的系列溶液，过0．45 tan的微孔滤膜，分别进样20皿，以峰面积A为纵 坐标，质量浓度ID为横坐标，进行线性回归，得回归 方程：A=14．48p+3．12，r=0．9999，线性范围 1．00—12．5nag·L一1o 2．5精密度 取2．50，5．00，10．0nag·L。1(低、中、高)3个浓度 的硫酸长春新碱溶液，于不同时间进样，计算日内精 密度，日内RSD分别为O．96％，0．81％，1．01％；于第 1，2，3，4，5天测定，计算日间RSD分别为1．12％， 1．08％，1．33％。 2．6回收率的测定 精密量取1g·L。1的硫酸长春新碱溶液O．2， 0．4，0．6，0．8，1．0，1．2mL各一份，分别加入“2．1．1” 中的空白脂质体0．2mL，加水至2mL，混匀。取上 述溶液各0．3mL于5mL量瓶中以去离子水定容， 摇匀，再各取1．5mL于5mL量瓶中，以甲醇定容， 摇匀，过滤。HPLC测定回收率，结果见表2。 表2硫酸长春新碱的回收率．n=3 Tab2 Recoveryofvincristinesulfate．／1=3 万方数据万方数据 由表2可知，硫酸长春新碱脂质体的回收率在 97．2％～99．9％之间，符合要求。 2．7 阳离子交换树脂对脂质体和游离药物的分 剐2] 2．7．1 阳离子交换树脂柱的制备将国产732型 阳离子交换树脂按常规方法经酸碱处理后，用去离 子水洗至中性，装于2．5mL注射器中，制成阳离子 交换树脂柱。 2．7．2阳离子交换树脂对水溶液中硫酸长春新碱 的吸附①硫酸长春新碱溶液的配制：取“2．4．1”中 对照品储备液，用去离子水稀释成质量浓度分别为 0．2，0．3，0．4，0．5，0．6g·L。1的硫酸长春新碱溶液。 ②阳离子交换树脂对游离药物的吸附：各取“①”中 溶液0．3mL2份，一份于5mL量瓶中，去离子水定 容，摇匀后取1．5mL于5mL的量瓶中，甲醇定容， 摇匀；另一份加于阳离子交换柱顶端，预吸附5min， 去离子水洗树脂柱，收集滴出液于5mL量瓶中，去 离子水加至刻度，摇匀后取1．5mL于5mL的量瓶 中，甲醇定容，摇匀，过滤，HPLC测定。未过柱硫酸 长春新碱溶液峰面积分别为53．66，83．96，110．09， 145．81，164．81；过柱吸附后峰面积均为0。说明阳 离子交换树脂可以完全吸附溶液中游离的硫酸长春 新碱。、 2．7．3 阳离子交换树脂对脂质体与药物物理混合 溶液中硫酸长春新碱的吸附①药物与脂质体物理 混合溶液的制备：取5支试管，分别加入1g·L。1的 硫酸长春新碱溶液O．4，0．6，0．8，1．0，1．2mL，再各 加入“2．1．1”中的空白脂质体0．2mL，加去离子水至 2mL，混匀，即得。②阳离子交换树脂对混合溶液中 药物的吸附：各取“①”中的溶液0．3mL2份，其中 一份过阳离子交换树脂柱分离。结果，未过柱的硫 酸长春新碱溶液峰面积分别为54．36，82．34， 110．91，143．28，165．95；过柱后峰面积均为0。表明 阳离子交换树№1；1台I：t邑完全吸附物理混合溶液中的药 物。 2．7．4阳离子交换树脂对空白脂质体的吸附采 用浊度法考察阳离子交换树脂对空白脂质体的吸附 情况13“J。取“2．1．1”项下的空白脂质体，用去离子 水稀释至5g·L～，取0．2，0．3，0．4rIlL该空白脂质体 各2份，一份置5mL量瓶中，去离子水定容，摇匀； 再取1．5mL于5mL的量瓶中，加水定容。另一份 加于阳离子交换柱顶端，预吸附5min，去离子水洗， 并收集滴出液于5mL量瓶中，再取1．5mL置于5 mL量瓶中，去离子水定容，摇匀。用紫外．可见分光 光度计在450Bin下测定过柱前后脂质体的吸光度， 计算回收率，结果分别为97．9％，97．7％，99．4％。 2．7．5 阳离子交换树脂吸附能力的考查 取 0．5g·L。1的硫酸长春新碱溶液0．3IllL上柱，预吸附 5min，去离子水洗，收集滴出液于5mL量瓶中，去 离子水加至刻度，摇匀。同法操作5，lo，15，20，25， 30，4；0，50次，过滤，用HPLC测定。结果表明，该阳 离子交换柱可以完全吸附药物，并可以重复使用50 次。 2．8包封率的测定 精密量取“2．1。2”中的脂质体，过柱分离后按 下式计算包封率：E％=10过柱／P未过柱×100％，式中 lD过柱表示脂质体包封的硫酸长春新碱浓度；ID未过柱 表示总的硫酸长春新碱浓度。结果3批样品的包封 率分别为85．3％，86．5％，86．9％。 3讨论 3．1实验中选择蛋黄卵磷脂，采用被动载药法，通 过调节胆固醇和磷脂的比例，考察了药物在脂质体 中的包封情况，结果表明，用被动载药法制备的硫酸 长春新碱脂质体包封率随胆固醇比例的增加而增 加，当磷脂和胆固醇的比例为1：1时，长春新碱的包 封率最高为14．4％。参考Baman等【5J报道的方法， 本实验选用HSPC／Chol为脂质成分，以主动载药法 之一的pH梯度法制备硫酸长春新碱脂质体，其包 封率大于85％，远远高于被动载药法的包封率，具 有实际应用价值。与Baman等所采用的二棕榈酰磷 脂酰胆碱(DSPC)相比，HSPC具有价格便宜等优点， 国外未见采用HSPC为膜材包封硫酸长春新碱的研 究报道。 3．2本实验采用阳离子交换树脂法测定脂质体的 包封率，具有样品用量少、耗时短、操作简单、成本低 等优点。我们曾采用SephadexG一50微柱离心法， 于1000。4000r·min。1的条件下分离脂质体和未包 封的游离药物[6J6，结果总存在少量游离药物与脂质 体不能完全而有效分离的问题，难以获得包封率的 准确数据。另外，SephadexG一50价格昂贵、处理和 贮存均较困难，而阳离子交换树脂价廉易得、处理简 单、可重复多次使用，利于为更多的，特别是经费不 充足的基层科研人员所采用。 3．3 实验曾选用紫外分光光度法和一阶导数法用 于测定硫酸长春新碱的包封率。但用紫外分光光度 法测定时，磷脂在298nnl处有吸收，干扰硫酸长春 新碱含量测定；而采用一阶导数法时，由于脂质体经 过柱分离、破坏定容后，溶液中药物的含量较低，其 ChbzPharmJ，2005October，V01．40No．20·1561· 万方数据万方数据 肝靶向丝裂霉素磁性前体药物的研制 阎玺庆1，陈建海1，蒋青锋1，刘炜1，西娜1，吴志申2(1．南方医科大学南方医院药学部，广东广州510515；2．河南大学特种功能材 料重点实验室，河南开封475001) 摘要：目的对葡聚糖丝裂霉素磁性纳米粒的制备及其含量进行研究。方法通过制备葡聚糖表面修饰的磁流体，用6_溴己 酸与葡聚糖链接，所得产物与丝裂霉素经1．乙基．3．(3．二甲基氨丙基)．碳二亚胺(EDC)催化缩合，即得所需的磁性前体药物。 产物经葡聚糖凝胶柱分离紫外分光光度法和原子吸收分光光度法分另4测定其丝裂霉素含量和磁流体含量。结果 所制备制 剂的接枝率为91．8％，载药量为8．57％，磁流体含量为27％。结论利用该方法，得到了外观稳定、再分散性好、包载量高的 磁性前体药物制剂。 关键词：葡聚糖；丝裂霉素；Zd流体；纳米粒 中图分类号：R943．42 文献标识码：A 文章编号：1001—2494(2(x】5)20一1562—03 studyOilpreparationoflivertargetedmagneticmitomycinnanoparfides YANXi—qin91，CHENJian—hail，BANGQing-fen91，LIUWeil，XINaI，WUZhi—shen2(1．伪删ofp胁mo叼：，NanFang Hospital，SouthernMedicalUniversity，Guangzhou510515，Ch／na；2．KeyLaboratoryofSpecialFunawnalMaterials，HenanUniversity， Kaifeng475001，Ch／na) ABsrRACT：OBJECTIVETostudythepreparationofmagneticdextran-mitomycinnanoparticles．METHOi)sDextranmodifiedmagnet— icfluidwasprq,蒯bylinkingwith6-bromohexanoicacid．ThendextranandmitomycinCwereconjugatedtradertheexistenceofEDC．Con- tentsofMMCandmagneticfluidinthemagneticpD_drugwerem既园】redbygelfiltrationchromatographyandatomicabsorptionspectropho- tometry．respectively．RESULTSThegraftingTatioandloadingcapabilityoftheproductpreparedbythismethodreachedto91．8％and 8．57％，respectively．CONCLUSIONThemagneticpro-druspIelm捌bychemicalmethodshowedhighstabilityandgoodredispersionand alsoownedhighdriftingcoefficientandloadingcapability． KEYWORDS：dextran；mitomycin；magneticfluids；nanoparticles 丝裂霉素c(MMc)广泛应用于肿瘤化疗，但全 身用药所产生严重的不良反应如骨髓抑制和胃肠道 反应等极大地限制其应用。一种有效的方法就是将 化疗药物和磁性材料一起包封于载体材料中，给药 一阶导数值很小，造成实验结果的准确性和重现性 较差。因此本实验选用HPLC对硫酸长春新碱进行 包封率的测定。 3．4在波长的选择上，中国药典2000年版中规定 297Bin作为硫酸长春新碱的检测波长，而本实验采 用二极管阵列(DAD)检测器，测定硫酸长春新碱在 该流动相中的检测波长为298Bin，DAD检测器可以 随时检查色谱峰纯度，有利于实验进行。 3．5实验中发现脂质体载药后粒径略有减小，其原 因可能是多种因素共同作用的结果。如：外水相碱 性溶液的加入引起脂质体膜电荷的改变及载药时孵 化条件的影响。本实验室正致力于寻找多种模型药 物，并对药物包封后脂质体粒径改变的机制进一步 研究、探讨。 参考文献 [1] Kantea"PM，Klai&GM，BullardGA，dag．Hposomeencapsulated vincristine：preclinicaltoxicologicandpharmacologicconlparisonwith freevincristineandemptyliposomesinmice，ratsanddogs[J]．Anti Cancer肪瞪，1994，5：579． [2] 邓意辉，李焕秋，王绍宁，等．主动载药与被动载药制备盐酸 左氧氟沙星脂质体[J]．中国抗生素杂志，2001，26(4)：258． [3] 牛国琴，潘俊，陆伟跃．脂质体粒径的分光光度法检测[J]．药 学学报，2003，38(7)：547． [4] 王绍宁，邓意辉，毕殿洲，等．阳离子交换树脂．一阶导数分光 光度法测定盐酸环丙沙星脂质体包封率[J]．沈阳药科大学学 报，2002，19(3)：192． [5] BomanNL，MayerLD，CullisPR．Ootimi枷onoftheretentionprop— erties0fvincristineinliposomalsyst口as[J]．成∞铀，觑B／ophys／ca Acta，1993，1152：253． [6] 平其能主编．现代药剂学[M]．北京：中国医药科技出版社， 1998：608． (收稿日期：2004-10-25) 基金项目：国家863项目(2002AA214121)；国家自然科学基金资助项目(30270400) 作者简介：阎玺庆，男，博士研究生，讲师 ’通讯作者：陈建海，教授，博士生导师 ·1562·Ch／nPhannJ，2005October，V01．40No．20 Te]／ZF￡tx：(020)61642173E-mail：jhchen@finmau．com 万方数据万方数据 主动载药法制备硫酸长春新碱脂质体及其包封率的测定 作者： 赵妍， 于彬， 邓意辉， 肖利颖， ZHAO Yan， YU Bin， DENG Yi-hui， XIAO Li-ying 作者单位： 赵妍,ZHAO Yan(沈阳药科大学药学院,辽宁,沈阳,110016;中国医科大学基础医学院,辽宁,沈 阳,110001)， 于彬,邓意辉,肖利颖,YU Bin,DENG Yi-hui,XIAO Li-ying(沈阳药科大学药学 院,辽宁,沈阳,110016) 刊名： 中国药学杂志 英文刊名： CHINESE PHARMACEUTICAL JOURNAL 年，卷(期)： 2005,40(20) 被引用次数： 10次 参考文献(6条) 1.Kanter PM;Klaich GM;Bullard GA Liposome encapsulated vincristine:preclinical toxicologic and pharmacologic comparison with free vincristine and empty liposomes in mice,rats and dogs 1994 2.邓意辉;李焕秋;王绍宁 主动载药与被动载药制备盐酸左氧氟沙星脂质体[期刊论文]-中国抗生素杂志 2001(04) 3.牛国琴;潘俊;陆伟跃 脂质体粒径的分光光度法检测[期刊论文]-药学学报 2003(07) 4.王绍宁;邓意辉;毕殿洲 阳离子交换树脂-一阶导数分光光度法测定盐酸环丙沙星脂质体包封率[期刊论文]-沈阳 药科大学学报 2002(03) 5.Boman NL;Mayer LD;Cullis PR Optimization of the retention properties of vincristine in liposomal systems 1993 6.平其能 现代药剂学 1998 本文读者也读过(10条) 1. 赵春晖.王东凯.李翔.Zhao Chun-hui.Wang Dong-kai.Li Xiang 主动载药法制备硫酸卷曲霉素脂质体及其质量 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