HPLC法同时测定元胡止痛分散片中延胡索乙素和欧前胡素的含量

第 l5卷第 12期 2009年 12月 中国实验方剂学杂志 Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae Vo1．15，No．12 Dee．，2009 HPLC法同时测定元胡止痛分散片中延胡索乙素 和欧前胡素的含量 章 军，王跃生 ，李 慧，张保献，臧 琛，王国华，欧阳旭 (中国中医科学院中药研究所，北京 100700) [摘要] 目的：建立简便 、快速的同时测定元胡止痛分散片中延胡索乙素和欧前胡素的高效液相色谱。方法：甲 醇回流提取延胡索乙素和欧前胡素，以 Kromasil C， (5 m，4．6 mm×250 mm)为分析柱，以乙腈一甲醇一0．1％磷酸水溶液(三乙胺 调 pH：6．0)(41：13：46)为流动相；波长为280 nm；柱温 40℃；流速为0．8 mL·min一。结果：延胡索乙素峰和欧前胡素峰分 离良好 ，阴性无干扰，方法学考察合格。结论：该方法适用于元胡止痛分散片中延胡索乙素和欧前胡素的含量测定。 [关键词] 元胡止痛分散片；延胡索乙素；欧前胡素；含量测定；高效液相色谱法 [中图分类号] R284．1 [文献标识码] B [文章编号] 1005．9903(2009)12．0010—03 Determination of dl—tetrahydropalmatine and imperatorin in Yuanhuzhit0ng dispersible tablet by HPLC ZHANG Jun，WANG Yue—sheng ， Hui，ZHANG Bao-xian，ZANG Chen，WANG Guo-hua，OU Yang-xu (Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Bering 100700，China) [Abstract] objective：To develop a rapid HPLC method for determination of dl—tetrahydropalmatine and imperatofin in Yuanhuzhitong dispersible tablet．M ethod：dl—tetrahydropalmatine and imperatorin were extracted by refhlx extraction method with methano1．A kromasil C18(5 m，4．6 mm×250 mm)column was used with the mobile phase of acetonitrile-methanol一0．1％ phosphoric acid(pH was adjusted to 6．0 by triethylamine)(41：13：46)at the detection wavelength of 280 nm．The flow rate was 0．8 mL·min～ at the column temperature of 40 oC．Results：The d1． tetrahydropalmatine peak and imperatorln peak ean he separated perfectly． The negative samples were not found interfefence in this condition．The method is accurate．Conclusion：The method iS suitable for the determination of d1． tetrahydropalmatine and imperatorin in Yuanhuzhitong dispersible tablet． 1 Key wordsJ Yuanhuzhitong dispersible tablet；dl—tetmhydr0palmatine；imperatorin；determination；HPLC 元胡止痛分散片是由延胡索和白芷两味药材组 成，具有理气、活血、止痛之功效，用于治疗气滞血瘀 的胃痛 ，胁痛 ，头痛和痛经等。延胡索中的有效成分 延胡索乙素具有镇痛作用，白芷中的有效成分欧前 胡素具有抗菌、抗肿瘤等多种药理作用，与药品质量 [收稿 日期] 2009—05．31 [基金项目】 国家科技支撑计划项目(2006BA109B08．06) [通讯作者 】 *王跃 生，Te1：(010)64030267，E-mail：wylw915@ 163．COB。 · 10 · 密切相关。目前测定元胡止痛方大多仅测定延胡索 乙素或欧前胡素一种成分 ¨，不能全面地控制药品 的质量”本实验在一个色谱条件下可同时测定延胡 索乙素和欧前胡素两种成分，且样品制备方法简单， 采用甲醇回流，提取液浓缩即可。目前仅有一篇文 献可在一个色谱条件下同时测定两种成分，但样品 制备方法复杂 。 1 仪器与试剂 HP1100高效 液相 色谱 系统，二极 管阵列 检测 器，HP ChemStation for LC 3D Rev．A．06．03工作站。 专业提供学术期刊、学位论文下载、外文文献检索下载服务 购买地址: http://krwl.taobao.com 第 15卷第 l2期 2009年 12月 中国实验方剂学杂志 Chinese Joatrial of Experimental Traditional Medical Formulae Vo1．15．No．12 Dec．，2009 元胡止痛分散片、延胡索阴性样品、白芷阴性样品由 中国中医科学院中药研究所制剂室提取制备 ；延胡 索乙素对照品(供含量测定用，批号：0726—9906)；欧 前胡素对照品(供含量测定用，批号：11826—200410) 均购于中国药品生物制品检定所；甲醇、乙腈为色谱 纯 ，水为超纯水 ，磷酸 、三乙胺为分析纯。 2 实验方法和结果 2．1 色谱条件 色谱柱：Kromasil C (5 m，4．6 mm ×250 mm)；流动相 ：乙腈．甲醇一0．1％磷酸水溶液(三 乙胺调 pH=6．0)(41：13：46)；检测波长 ：280 BITI；柱 温 ：40℃；流速 ：0．8 mL·rain～；进样量 ：10 。 2．2 对照品溶 液的制备 取经五氧化二磷减压干 燥 36 h的延胡索 乙素和欧前胡素对 照品适量 ，精密 称定，置量瓶中，加甲醇制成每 1 mL含延胡索乙素 0．04 mg；欧前胡素 0．05 mg的混合对照品溶液，摇 匀 ，即得。 2．3 供试品溶液的制备 取 10片供试品 ，研匀 ，取 粉末约 0．5 g，精密称定 ，置具塞锥形瓶 中，精密加入 甲醇 50 mL，称定重量 ，水浴 回流 1 h，放冷 ，再称定重 量 ，用 甲醇补足减失 的重量 ，滤过 ，精 密量取续 滤液 40 mL，挥干，用 甲醇溶解残渣 ，转移至 5 mL量瓶中 ， 定容 ，摇匀 ，用 0．45 m微孔滤膜滤过 ，取续滤液 ，即 得。 2．4 阴性对照溶液 的制备 按 制剂处 方组成 分别 除去白芷和延胡索后 ，制成 白芷 阴性样 品和延胡索 阴性样品 ，按供试 品溶液制备方 法制备 阴性对 照溶 液。 2．5 干扰试验 吸取对照品溶液 、供试品溶液和阴 性对照溶液各 l0肚L进样，记录色谱图。结果与供 试 品溶液色谱图比较 ，阴性对照溶液在延胡索乙素 、 欧前胡素色谱峰相应位置无干扰峰。见图 1。 2．6 线性关系考察 精密称取经五氧化二磷减压 干燥 36 h的延胡索乙素对照品 4．26 mg和欧前胡素 对照品5．06 mg，置 50 mL量瓶中，加甲醇制成每 1 mL含0．085 2 mg延胡索 乙素和0．101 2 mg欧前胡素 的混合对照品溶液，精密量取该溶液 2，4，6，8，10 mL，分别置 10 mL量瓶 中，加 甲醇定容 ，摇匀。按上 述色谱条件依序进样测定，进样量 10 。以对照品 进样量( g)为横坐标，色谱峰面积积分值(A)为纵坐 标，绘制标准曲线，建立回归方程：Y=852．3 一 3．330，r=0．999 9。明延胡索乙素在(0．17—0．85) g范围内与色谱峰面积有 良好 的线性关系；Y= 1 2 0 1 5 20 25 30 35 inin O 5 10 I5 2O 25 3O 35 mln A B l ， j 5 10 15 2O 25 3O 35 min D 图 I 对照品 【A)、兀胡止痛分散片 (B)、 延胡索阴性对照(c)、白芷阴性对照lD)的HPLC图谱 1 延胡索乙索；2 欧前胡素 1 511X一8．987，r=0．999 9。表 明欧前胡素在 (0．20 ～ 1．0) g范围内与色谱峰面积有 良好的线性关系。 2．7 精密度试验 取供试 品溶液连续进样 5次 ，计 算延胡索乙素峰面积的 RSD为 1．3％；欧前胡素峰 面积的 RSD为 1．0％，表 明精密度 良好 。 2．8 重复性试验 取同一批次元胡止痛分散片 ，按 照 2．3项下方法平行制备供试品溶液 5份，测定延 胡索乙素和欧前胡素含量。结果延胡索乙素平均含 量为0．040 8％，RSD为 2．5％；欧前胡素平均含量为 0．037 6％，RSD为 0．91％，表明重复性 良好 。 2．9 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于制备 后 0，2，4，6，8，24 h进样 (8 h进样后置冰箱冷藏 保存，进样前放至室温)，测得延胡索乙素和欧前胡 素峰面积 的 RSD分别为 2．0％和 1．7％。结果表 明 供试 品溶液至少稳定 24 h。 2．10 加样回收率试验 取同一批次已知含量的元 胡止痛分散片约 0．25 g，精密称定 ，准确加入一定量 的延胡索乙素和欧前胡素对照品，按上述供试品溶 液制备方法和色谱条件进行测定并计算回收率，结 果见表 1、表 2。 2．11 含量测定 精密称取 3批元胡止痛分散 片， 按照 2．3项下方法制成供试品溶液，分别精密吸取 对照品溶液 5 与供试品溶液 10 ，注入液相色 谱仪，测定 ，按外标一点法 ，计算延胡索 乙素和欧前 胡素含量 ，结果见表 3。 · 1 1 · =二j ⋯ 第 l5卷第 12期 2009年 12月 中国实验方剂学杂志 Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae Vo1．15。No．12 Dec．，2009 表 1 元胡止痛分散片中延胡索乙素加样回收率试验结果 样品 称样量 中 加入量 测得量 回收率 均回收 R D (g) 含量(II1g) (mg) (mg) (％) 率(％) (％) 表 2 元胡止痛分散片中欧前胡素加样回收率试验结果 样品 称样量 样品中 加入量 测得量 回收率 平均回收 RsD 。 (g) 含量(IIlg) (mg) (mg) (％) 率(％) (％) 表3 元胡止痛分散片中延胡索乙素和欧前胡素含量 3 讨 论 3．1 分离条件 的选择 本试验 考察 了 Diamonsil、 Kromasil、Zorbax 3种类型色谱柱 ，均为反相 C 填料 ； 5 ttm；4．6 rain×250 mm，结果使用 Kromasil色谱柱可 使延胡索乙素和欧前胡素色谱峰具有良好的对称 性 。理论塔板数较大 ，故选用。又考察了各种流动 相系统，如 ：甲醇．水系统 ；甲醇一酸水溶液系统；甲醇一 缓冲盐溶液系统等，最后采用乙腈一甲醇一0．1％磷酸 溶液(三乙胺调 pH=6．0)系统时 ，分离良好 。 · 12 · 3．2 供试品溶液制备方法的选择 参考 2005版药 典 延胡索中延胡索乙素采用浓氨．甲醇(1：20)回 流提取 ；白芷中欧前胡素采用甲醇超声提取 ，因此考 察了甲醇和浓氨一甲醇(1：20)两种提取溶剂；超声和 回流两种提取方法 ，结果显示 ，采用 甲醇回流提取 时 ，两成分含量均达到最高。再对提取时间和溶剂 用量进行了考察 ，最终确定了 2．3项下 的提取方法。 本试验在同一色谱条件下，同时检测元胡止痛 分散片中延胡索乙素和欧前胡素两种不同类型的成 分，经系统适应性试验和方法学考察，证明本条件分 离度好，阴性无干扰，达到定量要求。文献[6]报导 的制备方法复杂，为酸水提取，乙醚萃取 3次，母液 加入氨水，再用乙醚萃取 3次，极为繁琐。本实验供 试品制备方法采用甲醇回流、提取液浓缩，即可。可 节省时间，简化操作，并提高精度。 [参考文献] [1] 汪 玲，程 贝，罗 兰，等 ．元胡止痛分散片中延胡索 乙素的含量测定[J]．医药导报，2009，28(01)：114—115． [2] 朱才庆，吴 迪，李 艳，等．高效液相色谱法测定复方 元胡止痛胶囊 中延胡索 乙素的含量[J]．时珍 国医国 药 ，2008，19(07)：1727．1729． [3] 卢红文，秦 畸，徐 佳．液相色谱／质谱联用测定元胡 止痛软胶囊中延胡索乙素的含量[J]．中国药师，2007， 10(12)：1199．1201． [4] 王洪志，李惠芬，周 静，等．HPLC法测定元胡止痛片 中欧前胡素和异欧前胡素[J]．中草药，2007，38(Or7)： 1018 1019． [5] 韩建伟，李琼娅，魏元锋 ，等．高效液相色谱法测定元胡 止痛贴中延胡索 乙素 的含量 [J]．中国 医院药 学杂志 ， 2007，27(06)：822—823． [6] 朱央央，余伯阳．RP—HPLC测定元胡止痛方中延胡索乙 素和欧前胡素的含量 [J]．中成药，2004，26(06)：455． 458． [7] 国家药典委员会．中华人民共和国药典[S]．一部，北 京：化学工业出版社，2005：97，79． 专业提供学术期刊、学位论文下载、外文文献检索下载服务 购买地址: http://krwl.taobao.com ★资源介绍★ 【中文资源】 中国知网、万方数据、维普、超星、读秀、国研、新东方、阿帕比、书生图书、博看、人大复印、北大法宝、法意、环球英语等等. 【英文资源】 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