抗体标记(1) 2试剂配制:
1、pH5.6醋酸盐缓冲液:
0.2mol/L醋酸钠(甲液):无水醋酸钠8.20g,加蒸馏水至500ml;
0.2mol/L醋酸(乙液):无水醋酸5.73ml,加蒸馏水至500ml;
取甲液4.55ml,乙液0.45ml,混匀即可
2、0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液:
Na2CO3 0.32g
NaHCO3 0.586g
加蒸馏水至50ml
3、0.01M pH9.5的碳酸盐缓冲液:
将0.2MpH9.5碳酸盐缓冲液稀释20倍即可 ...
试剂配制:
1、pH5.6醋酸盐缓冲液:
0.2mol/L醋酸钠(甲液):无水醋酸钠8.20g,加蒸馏水至500ml;
0.2mol/L醋酸(乙液):无水醋酸5.73ml,加蒸馏水至500ml;
取甲液4.55ml,乙液0.45ml,混匀即可
2、0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液:
Na2CO3 0.32g
NaHCO3 0.586g
加蒸馏水至50ml
3、0.01M pH9.5的碳酸盐缓冲液:
将0.2MpH9.5碳酸盐缓冲液稀释20倍即可
4、0.1M高碘酸钠
取X(X≥10) mg的高碘酸钠溶解在47*X ul的蒸馏水中。
5、2.5%的乙二醇
取125ul乙二醇溶解在5ml 双蒸水中
6、5mg/ml的硼氢化钠(NaBH4)
1mg溶于0.2ml的蒸馏水中
抗体
编号
2#
6#
27#
37#
40#
71#
透析后浓度(mg/ml)
2.26
3.48
3.64
4.73
3.16
1.84
体积(ul)(0.2mg)
88.5
57.5
54.9
42.3
63.3
108.7
实验步骤:
HRP:RBP4=1:4 HRP:NaIO4=1:0.43
1 取3.5mg的HRP酶溶于0.2mol/L,pH5.6醋酸盐缓冲液3.5ml,至终浓度为1mg/ml;
2 加入70.3ul 0.1M的高碘酸钠(214g/mol),此时溶液由原棕色变为墨绿色,4℃避光反应20-30min;
3 加入2.5%乙二醇140ul, 4℃避光1h终止反应;
4 取适量体积加入相对应的抗体(0.2mg)中,用0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液调PH到9.0-9.5,然后用0.01M CBS透析,4℃过夜;
5 新配NaBH4 5mg/ml,每种抗体加2ul,吹打混匀,4℃,3h;
6 加等体积的饱和硫酸铵,4℃放置2h;
7 离心,7000rpm 4℃ 30min;
8 加少量PBS(200ul)溶解,用PBS透析,换液2-3次
9 取出透析袋中的溶液,离心8000rpm 5min ,去除沉淀,上清液即为酶结合物,测OD280和OD403,计算出酶的含量,最后加甘油保存,推算出终浓度;
2013-11-19
实验
项目:RBP4抗体配对(双抗夹心)
A-G包被抗体1ug/ml,抗原500ng/ml
H包被抗原1ug/ml,做阳性检测标记效果
2#
6#
16#
27#
A 2#
1:500
1:1000
1:2000
1:500
1:1000
1:2000
1:500
1:1000
1:2000
1:500
1:1000
1:2000
B 6#
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1:1000
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C 16#
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D 27#
1:500
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1:500
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E 37#
1:500
1:1000
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1:1000
1:2000
1:500
1:1000
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F 40#
1:500
1:1000
1:2000
1:500
1:1000
1:2000
1:500
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1:2000
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1:2000
G 71#
1:500
1:1000
1:2000
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1:1000
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1:500
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H 阳性
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1:3000
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1:1000
1:3000
37#
40#
71#
阴性
A 2#
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1ug/ml抗原
B 6#
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1ug/ml抗原
C 16#
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1:2000
1ug/ml抗原
D 27#
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1:2000
1ug/ml抗原
E 37#
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1:1000
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1ug/ml抗原
F 40#
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1:500
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1:500
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1ug/ml抗原
G 71#
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1ug/ml抗原
H 阳性
1:500
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1:3000
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1:1000
1:3000
1ug/ml抗原
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