香菇多糖的分离提取

香菇多糖的分离提取 一、实验目的 掌握水溶醇沉法分离多糖类化合物的原理和方法。 二、实验原理 在组织中，多糖多与蛋白质以共价相结合，所以在生化产品制备工艺中，往往第一步多用酶降解蛋白质部分或用碱使多糖—蛋白质间的键裂开，以促进多糖 在提取时的溶解。碱性提取可避免多糖中硫酸基团水解而破坏。现多采用碱性提取的同时用蛋白质水解酶处理组织。提取液中存在的蛋白质可用普通蛋白质沉 淀剂使之沉淀，也可用其他方法使变性沉淀，如适当调pH和加热等。 苯酚试剂可与香菇多糖中的已糖及其糖醛酸起显色反应，生成橙黄色化舍橱，于49Ohm处比色，定量。 三、实验 1.实验器材 循环水式真空泵；旋转蒸发仪； 粉碎机；恒温水浴锅；纱布；搪瓷缸；真空干燥器；721型分光光度计；15ml具塞试管。 2．实验试剂 （1）95%乙醇；甲醇（化学纯）；乙醚（化学纯）；木瓜蛋白酶（中性）；纤维素酶；0.2 mol/L十六烷基三甲基氢氧化铵水溶液；10 mol/L 氢氧化钠溶液；葡萄糖溶液(1mg/ml，10m/m])；苯酚试液。 （2）复合酶液：以PBS缓冲液做溶剂，其中蛋白水解酶浓度为8 %，纤维素酶浓度为4%； （3）苯酚溶液：称取苯酚(AR级)10 g加水190 g溶解后，置于棕色瓶，备用。 四、实验方法步骤 （一）香菇多糖的分离 1、预处理：取干香菇4 g，用粉碎机粉碎或捣碎。 2、提取：将捣碎的干香菇置于250 ml三角瓶中，在搅拌的条件下加7倍量水混匀, 加热至90℃，搅拌保温60 min，降温至40℃时转移到40℃水浴保温；并加入适量0.45 ml 复合酶（蛋白水解酶浓度为8 %，纤维素酶浓度为4%），pH值为自然(pH 6.4)，搅拌反应60 min，然后迅速升温到90-100 ℃，灭活1min，降温后纱布过滤，收集滤液。 3、浓缩：将以上滤液置于旋转蒸发仪中，然后减压浓缩至l/5体积时，停止浓缩。 4、沉淀：将浓缩液置于搪瓷缸中，在搅拌的条件下，加1 倍量乙醇，然后静置过夜。过滤得沉淀物，滤液再加3倍量乙醇，得沉淀物。 5、干燥：将沉淀置真空干燥器干燥，即为香菇多糖。 （二）葡萄糖标准曲线的制作和多糖含量的测定 以葡萄糖的浓度为纵坐标，吸光度为横坐标作图，得葡萄糖回归方程。多糖含量测定采用苯酚——硫酸法。 1、标准曲线的制备 准确吸取1mg/ml葡萄糖标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml置于50ml容量瓶定容。准确吸取该系列溶液各2 ml，分别置于具塞试管中，加入苯酚试液各lml， 摇匀，迅速加入浓硫酸各5 ml，放置5min后，置于沸水浴上加热60 min．冷却后在490 nm处比色，绘制标准曲线。 2、香菇多糖的含量测定取样液2 ml，加8 ml无水乙醇，3000 r/min离心10 min后，倾去上清液，再加10 ml 80％乙醇，同样条件离心5 min。重复2次，将沉淀用水溶解并转移至100ml 容量瓶中定容。吸取l ml稀释10倍，取稀释液2 ml，接标准曲线制备方法测定吸光度，计算含量。 四、思考 1、有没有其他方法除蛋白质，如果有，应如何操作？ 2、加入纤维素酶液的目的是什么？