从2009 甲型H1N1 流行性感冒暴发看流行性感冒病毒的演化

从 2009 甲型 H1N1 流行性感冒暴发看流行性感冒病毒的演化 龙进学, 袁世山 中国农业科学院上海兽医研究所 猪传染病防治研究室, 上海 200241 基金项目 : “十一·五”国家科技支撑重点项目 ( 2006BAD06A01) 通信作者 : 龙进学 , E-mail: longjx@ shvri. ac. cn Corresponding author: LONG Jin-Xue, E-mail: longjx@ shvri. ac. cn 流行性感冒( 简称流感) 病毒已经与人类“相 处”了 400 多年, 可在各年龄段的人群中流行和引 起发病,每年在全球引起 25 万 ～50 万人发病[ 1 ] 。 2009 年 3 月在北美地区暴发了新型 H1N1 流感, 截 至2009 年6 月8 日,已有73 个国家和地区的25 288 人被感染, 其中 139 人死亡 ( http: / /www. who. int/ csr/don/2009_06_08/en/index. html) 。世界卫生组 织( World Health Organization, WHO) 曾称其为猪流 感,原因是其多数基因片段来源于猪流感病毒。猪 流感这一名称直接导致了埃及 4 月 30 日为预防流 感蔓延而扑杀了 30 万头生猪。随后, WHO 将其改 名为甲型 H1N1 流感( 下称 2009 甲型 H1N1 流感) 。 因此,甲型 H1N1 流感病毒的起源毫无疑问成为世 界各国关注的热点, 本文就 2009 甲型 H1N1 流感、 1997 年人际传播的 H5N1 禽流感以及人类历史上 的几次人流感大流行, 对甲型流感病毒的基因组结 构特点及其特有的进化作一简单介绍。 1 甲型流感病毒的基因结构 流感病毒属正黏病毒科, 是负链分节段的 RNA 病毒。根据核蛋白( nucleoprotein, NP) 和基质蛋白 ( matrix protein, MP) 的不同可将其分为 A、B、C 型。 我国将 A 型流感称为甲型流感。流感病毒是多形 性的包膜病毒,典型的甲型流感病毒呈球形, 直径为 80 ～120 nm;某些毒株在初次分离时常呈丝状。病 毒结构分为 3 层, 最外层是双层类脂包膜,来自病毒 复制的宿主细胞,面有许多放射状排列的突起, 即 纤突或刺突。这种表面纤突分为两类:一类呈棒状, 因其能凝集红细胞而被称为血凝素( hemagglutinin, HA) ;另一类为呈蘑菇状的四聚体, 能使病毒从吸附 的 红 细 胞 表 面 释 放, 称 为 神 经 氨 酸 酶 ( neuraminidase, NA) 。目前, 依据甲型流感病毒这 2 个重要的表面蛋白( HA 和 NA) 基因,将甲型流感 病毒分为 16 个 HA 亚型( H1 ～H16) 和 9 个 NA 亚 型( N1 ～N9) 。甲型流感病毒能自然感染多种哺乳 动物和禽类,历史上的几次人流感流行和 1997 年人际传播的禽流感均由其引起[ 1, 3 ] 。 2 甲型流感病毒的进化机制 目前研究认可的甲型流感病毒主要的进化机制 有基因点突变( 抗原漂移, antigen drift) 和基因重排 ( 抗原转变, antigen shift) [ 1 , 4 ] 。近年来,有研究者根 据美国国立生物技术信息中心 ( National Center for Biotechnology Information, NCBI) 公布的大量流感病 毒的基因序列分析发现, 流感病毒基因也存在基因 同源重组现象[ 11] ,由于 RNA 重组的现象非常罕见, 所以, 目前此观点尚未被普遍接受。但作为研究方 向,笔者认为是值得去探索和思考的。 2.1 基因突变 流感病毒常通过各基因片段在复制过程中发生 点突变来改变抗原性。甲型流感病毒作为 RNA 病 毒,其 RNA 聚合酶由于缺少校对功能而导致病毒 RNA 在复制过程中易发生突变, 这是流感病毒发生 点突变的分子基础。流感病毒的点突变多发于 HA 和 NA基因, 两者编码流感病毒颗粒表面最主要的2 个蛋白,参与流感病毒与宿主细胞的结合、融合与感 染性子代病毒的释放。HA( 约 550 个氨基酸) 以同 源三聚体的形式存在于病毒包膜表面, 是被宿主中 和抗体识别的主要抗原。因此, HA 在抗体免疫压 力作用下经常发生突变, 引起流感病毒的抗原性改 变以逃避免疫系统的识别, 如 1 株中国深圳 H1N1 流感病毒分离株的 HA 基因在 134 位缺失 1 个赖氨 酸( K) 引起其抗原性改变。HA 的突变速率是最高 的,差不多是非结构基因点突变的 3 倍。HA 在抗 体压下的进化突变也符合达尔文理论。另外, HA 的点突变也可导致其受体结合位点改变, 而使其宿 主亲嗜性发生变化[ 7] 。 2.2 基因重排 ·86· 微生物与感染 2009 年 6 月第 4 卷第 2 期 Journal of Microbes and Infection, June 2009, Vol. 4, No. 2 甲型流感病毒的基因组由 8 条单股负链 RNA 组成,按大小分别为: PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、MP 和 NS。每一条 RNA 都以不同的核糖核蛋白复合体 ( ribonucleoprotein complex, RNP) 形式〔由 3 种 RNA 依赖性聚合酶蛋白( PB1、PB2、PA) 、单链 RNA 结合 蛋白( NP) 和病毒单链 RNA 组成〕存在。水禽是甲 型流感的病毒库, 几乎含有所有亚型流感病毒。流 感病毒基因重排( reassortment) 的生物学基础: 当 2 种不同的流感病毒颗粒同时感染并在 1 个宿主细胞 内复制、转录、装配,最后病毒颗粒出芽, 这个过程很 容易产生许多具有不同基因组合的流感病毒颗粒。 尽管许多组合可能无法存活, 但该方式是流感病毒 进化非常有效和重要的方式之一。经典的“混合 器”理论认为, 禽、猪和人流感的病毒均可感染猪, 并能在猪体内复制,猪充当了一个“混合器”。不同 流感病毒在此过程中常发生基因片段交换而产生新 的病毒株[ 4, 13 ] 。但是, 已经有研究认为人的下呼吸 道细胞也具有禽流感病毒受体[ 10 ] , 不能否定人亦可 被人和禽流感同时感染而起“混合器”的作用。 2.3 流感病毒可能的其他进化机制:基因同源重组 研究者发现许多禽流感在向人等哺乳动物传播 前,其受体结合位点已经发生适应于人体特性的改 变,这意味着流感病毒并不一定是在宿主细胞中迫 于生存压力才发生适应性突变进化。这与流感病毒 的突变进化连续的观点相一致 [ 5 ] 。也就是说, 流感 病毒的氨基酸突变进化机制不一定需要特异性抗体 的施压, 如 B型流感病毒的进化并不是在抗体压下 发生的[ 2] 。这些研究提示流感病毒可能还存在其 他非基因点突变和基因片段重排的进化方式。笔者 在研究 H5N1 禽流感时也发现目前流行的 H5N1 病 毒中许多毒株的 NA 和 NS 有部分基因缺失现 象[ 12] ,且进化树上分处在不同的亚系, 这显然不能 用基因重排和基因突变来解释。推测不同流感病毒 之间可以发生基因重组, 以同源重组 ( homologous recombination) 为主。虽然人们认为 RNA 病毒发生 基因重组现象罕见, 但已有许多研究证实基因重组 确实是 RNA病毒进化的一个重要方式, 如冠状病毒 ( coronavirus) 、脊髓灰质炎病毒( poliovirus) 、牛病毒 性腹泻病毒( bovine viral diarrhea virus, BVDV) 和芜 菁皱缩病毒( turnip crinkle virus, TCV) 等都有基因 重组现象。目前也有研究者通过基因比对发现禽流 感病毒的 PB2、PB1、PA、HA 和 NP 均有基因同源重 组现象[ 11] 。 3 20世纪人类历史上几次流感大流行 根据历史记录,1510 年在英国就已有疑似流感 的流行, 后来在 1580 年、1675 年和 1733 年也发生 规模流行。1742 ― 1743 年发生的流感大流行曾涉 及东欧, 1889 ― 1894 年又发生了席卷西欧的俄罗 斯流感。20 世纪发生了几次波及全球的流感事件, 即1918 西班牙流感、1957 亚洲流感、1968 香港流 感、1977 俄罗斯流感和 1997 年人际传播的 H5N1 禽 流感。根据目前的研究结果, 它们都是由经病毒间 基因重排这一进化机制而产生对人高度致病的甲型 流感病毒所引起。20 世纪流感基本遵守 4 年左右 小流行、10 年左右大流行的规律。 3.1 1918西班牙流感 1918—1919 年, 西班牙流感引起了 3 次暴发, 导致全球大约 5 千万人死亡 [ 3 , 6 , 8 ] 。尽管当时并未 分离到病毒,但研究者多认为它很可能是后来人类 流感病毒的祖先之一[ 6 ] 。1918 西班牙流感病毒的 起源一直是科学家们想要解决的问题。1997 年美 国从成功保存的死于西班牙流感的战士尸体组织中 提取了该病毒的5 个基因片段, 2005 年又提取到另 外3 个基因片段( PA、PB1 和 PB2) 。通过对其 8 个 基因的分析,证实 1918 西班牙流感病毒为 H1N1 亚 型,与 1930 年分离于猪的 H1N1 流感病毒可能来自 同一个祖先,是禽流感病毒[ 6 , 8] 。对其 HA 基因序列 分析发现, 尽管 1918 西班牙流感病毒 HA 与 A/ Swine/ Iowa/30 的 HA 同源性很高, 但有部分禽流感 HA 的氨基酸序列特征。对 1918 西班牙流感病毒 NA 的分析也存在类似的情况。核苷酸水平的遗传 进化分析结果显示, 1918 西班牙流感病毒 NA 属人 流感病毒基因;但氨基酸水平的遗传进化分析发现 其仍属于禽流感病毒基因[ 8] 。对 1918 西班牙流感 病毒 NP的进化进行分析, 认为其从禽流感病毒进 化而来,可能是在 1915 年经基因重排至人流感病毒 后,经过4 年的适应, 获得了人流感病毒特征, 或者 是1918年直接从禽流感病毒演化而来。综合以上 分析结果,1918 西班牙流感病毒极可能是人和禽流 感病毒通过基因重组或重排产生, 并在哺乳动物体 内获得适应性突变后, 成为人类历史上最大的流行 毒株和能感染猪的稳定谱系。 3.2 1957亚洲流感 1957 亚洲流感由 H2N2 流感病毒引起, 于 1957 年2 月在我国贵州西部首次出现。当年 3 ― 4 月引 起全国大流行, 5 ― 6 月进入日本和东南亚各国, ·96·微生物与感染 2009 年 6 月第 4 卷第 2 期 Journal of Microbes and Infection, June 2009, Vol. 4, No. 2 7 ― 8 月传到中东、欧洲和非洲, 10 月到达美洲。在 短短8 个月的时间里, 席卷全球, 发病率在 15% ～ 30% , 总病死人数大约为 200 万。序列分析认为, 此 次流行病毒株是流感病毒基因重排产生的二源重组 病毒, PB1、HA 和 NA 基因来自于禽流感病毒, 而其 他5 个基因( PB2、PA、NP、MP 和 NS) 来源于 20 世 纪 50 年代流行于人群中的 H1N1 病毒。该流行株 产生基因重排的过程不清楚, 推测可能由禽流感病 毒和人流感病毒在猪体内重组而产生 [ 4 ] 。然而, 当 时是否从猪群中分离出此 H2N2 病毒株则不得而 知。2006 年研究证实人也可以感染禽流感病毒, 因 为人的肺泡细胞具有禽流感病毒特定的受体[ 10 ] 。 所以,也不能排除 1957 亚洲流感病毒株在人体内形 成二源重组病毒。 3.3 1968香港流感 1968 香港流感由 H3N2 亚型病毒引起, 是人 H2N2 病毒与亚洲禽流感病毒进行基因重排而产生 的二源重组病毒,其 PB1 和 HA 基因来自禽流感病 毒,其他6 个基因( PB2、PA、NP、NA、MP和 NS) 来自 当时流行于人群中的 H2N2 病毒。1968 年 7 月首发 于我国香港特区并波及全世界, 它的传播速度和发 病率均不及1957 亚洲流感, 到 1968 年 8 ― 9 月才 传入新加坡、泰国和日本, 同年秋季到达欧洲, 年底 到达美洲。但这次流感流行导致大约 100 万人死 亡,流行株也来自人流感病毒和禽流感病毒的二源 重组病毒。 3.4 1977俄罗斯流感 1977 俄罗斯流感由 H1N1 流感病毒引起, 来源 不详。1977 年 5月首发于我国北方地区, 11 月至次 年1 月在俄罗斯出现, 同时在美国学生和新兵中暴 发。1978 年冬季在世界许多国家流行。此次流感 事件并未被记录为真正的大流感流行。1997 俄罗 斯流感主要感染儿童。遗传学分析显示,它与 20 世 纪50 年代曾流行过的 H1N1 流感非常相似, 其病毒 抗原性也没有发生改变。消失了约 20 年的流行株 在人群中重现,原因至今仍是个谜。此病毒很可能 存在于某一动物宿主中,该流感病毒的“贮存器”可 能是水禽,也可能是猪。值得注意的是, 此次重现的 H1N1 病毒和基因重排产生的 1968 香港 H3N2 病毒 在人群一直流行至今。 3.5 1997香港禽流感和 2003年以来的全球 H5N1 禽流感 前述几次世界范围发生的流感流行都由人流感 病毒引起,当时人们一直认为流感病毒具有种属特 异性,即禽流感对人无感染性。但 1997 年以后的 H5N1 病毒感染及其致人死亡事件彻底改变了这个 观点。 1997 年香港家禽中暴发 H5N1 禽流感, 同时报 道有18 人感染, 其中 5 人死亡。1999 年, 家禽中又 暴发 H9N2 禽流感。也有报道指出, 中国南方省份 也检测到一定比例人群中所含有的 H9N2 病毒特异 性抗体。2003 年在亚洲多个国家家禽中重新暴发 H5N1 禽流感, 随后扩散至全球范围, 导致巨大经济 损失。此病毒不但对家禽有高度感染性, 同时也似 乎具备了对人的感染能力。截至 2009 年 6 月, 已有 报道 15 个国家 429 人被 H5N1 病毒感染, 其中 262 人死亡, 病死率达 61%。对 1997 香港 H5N1 病 毒的序列分析研究证明, 1997 香港 H5N1 禽流感病 毒的 HA 来源于 A/Goose/Guangdong/1/96 ( H5N1 病毒 ) , NA 来 源于 A/Teal/Hong Kong/W312/97 ( H6N1 病毒 ) , 而其他 6 个内部基因来源于 A/ Quail/Hong Kong/G1/97( H9N2 病毒) [ 9] 。2003 全 球 H5N1 病毒与 1997 香港 H5N1 病毒相比, HA 高 度同源,但其他基因来源各不相同, 显示其仍是流感 病毒间基因重排株。病毒基因重排发生的过程及宿 主,目前仍然不清楚。1997 香港 H5N1 病毒感染人 的事件和后来陆续报道的人被 H5N1 病毒感染, 充 分证明了禽流感病毒可感染人,因此, 禽流感病毒与 人流感病毒间发生基因重排的“混合器”不仅限于 猪。 4 2009甲型H1N1流感病毒可能的演化机制 WHO曾将 2009 甲型 H1N1 流感病毒的来源确 定为猪流感,因为从基因序列看, 此新病毒与已知的 猪流感病毒非常接近, 同源性在 90% 以上。但是, 按照流感病毒的命名, 应该按分离的宿主进行 划分,而在 2009 年 5 月 2 日前, 未检测到这种新病 毒在猪群里传播,只在加拿大西部艾伯塔省 1 个猪 群发现有猪感染2009甲型 H1N1 流感病毒, 然而卫 生专家认为这些猪可能是被 1 名猪场工人传染的。 这名工人近期从墨西哥返回后, 确诊感染了甲型 H1N1 流感病毒。 因为2009甲型 H1N1 流感病毒首先出现在人 群中, 并不断蔓延, 因此有可能来自人。截至 2009 年5 月 26 日, 经测定完成的 1 037 个 H1N1 流感病 毒序列发布在 NCBI( www. ncbi. nlm. nih. gov) 上, 其 中 WHO选取代表株( A/California/04/2009) 作为候 选株进行疫苗生产。将 NCBI 上发布的 2009 甲型 ·07· 微生物与感染 2009 年 6 月第 4 卷第 2 期 Journal of Microbes and Infection, June 2009, Vol. 4, No. 2 H1N1 流感病毒的 8 个基因片段进行比较, 同源性 均高达99%以上, 说明分离于全球各地的 H1N1 流 感病毒为同一来源。虽然, 每年全球都有季节性的 流感流行,但各地的流感病毒是有相对遗传距离的。 1 株病毒所感染的人数超万并引发如此大范围的流 行是自1977年以来少见的, 这也预示着 2009 甲型 H1N1 流感病毒具有在人际间迅速传播的能力, 所 以 WHO把此次流感事件预警级别提高至 6 级。 4.1 基因重排 2009 甲型 H1N1 流感病毒被认为由不同流感 病毒间的基因重排而来。研究者经对已知的 2009 甲型 H1N1 流感病毒序列分析, 认为其是四源基因 重排的结果。美国与日本学者的初步研究发现, PB1 来源于 1968 香港 H3N2 人流感病毒, PB2 和 PA 来源于禽流感病毒, HA、NP 和 NS来源于早期流行 于北美地区的 H1N1 猪流感病毒,而 NA和 MP 则由 20 世纪 90 年代初欧亚猪群中流行的 H1N1 病毒提 供。推测重排过程可能有 3 个方面。① 北美 H3N2 猪流感病毒的由来:由 1968 香港 H3N2 人流感病毒 提供 PB1、HA 和 NA,一直流行于北美地区的 H1N1 猪流感病毒提供 NP、MP 和 NS, 某一禽流感病毒提 供 PB2和 PA; 通过基因重排,形成了引发 1998 年美 国得克萨斯和明尼苏达等州猪流感大暴发的三源基 因重排的 H3N2 病毒 ( 1998 北美 H3N2 猪流感病 毒) [ 1 8] 。② 2000 北美 H1N1/H1N2 猪流感病毒的 由来: 1998 北美 H3N2 猪流感病毒与本地已有的 H1N1 猪流感病毒杂交,互换基因, 形成广泛流行于 北美猪群的 H1N1 和 H1N2 病毒, 而此 2 种猪流感 病毒开始感染人类[ 13 , 14] 。③ 2009 甲型 H1N1 流感 病毒的由来: 北美 H1N1 和 H1N2 猪流感病毒获得 20 世纪 90 年代初欧亚 H1N1 猪流感病毒的 MP 和 NA 后形成如今肆虐全球的 2009 甲型 H1N1 流感病 毒[ 15, 17 ] 。对于 2009 甲型 H1N1 流感病毒的形成过 程,或者说该病毒发生在何种动物体内, 目前仍不清 楚。当然,按常规的流感病毒理论, 猪是最有可能在 整个过程起“混合器”的作用。然而, 目前的研究已 证实, 人也可以被禽流感病毒感染[ 10] , 所以, 对最初 1998 北美 H3N2 猪流感病毒的形成需要重新考虑。 另外,比对 2009 甲型 H1N1 流感病毒 PB2 的同源序 列,也发现 2009 甲型 H1N1 流感病毒的 PB2 与 A/ Swine/Minnesota/55551/00( H1N2 病毒) 、A/Swine/ Korea/JNS06/2004( H3N2 病毒) 和多个 H3N2 禽流 感病毒分离株, 如 A/Mallard duck/South Dakota/Sg- 00127/2007( H3N2 病毒) 的同源性均为 96% , 究竟 2009 甲型 H1N1 流感病毒的 PB2 由 H3N2/H1N2 猪 流感病毒还是 H3N2 禽流感病毒提供? 目前尚不清 楚。广泛存在于北美的 H3N2 禽流感病毒也极有可 能是 2009 甲型 H1N1 流感病毒的 PB2 基因供体。 1998 北美 H3N2 病毒与原来流行于猪群中的北美 H1N1 病毒的基因重排极可能发生于猪体。同源序 列比对2009甲型 H1N1 流感病毒的 MP, 发现其与 A/Hong Kong/1774/99 ( H3N2 病毒) 的同源性达 97% , 与欧亚 H1N1 猪流感病毒的同源性为96% , 所 以, A/Hong Kong/1774/99( H3N2 病毒 ) 直接提供 MP的可能性更大; 2009 甲型 H1N1 流感病毒的 NA 与欧亚 H1N1 猪分离株 A/Swine/England/195852/ 92 ( H1N1 病毒) 最相近, 同源性为 94% , 证明其由 欧亚 H1N1 猪流感病毒提供。 4.2 HA 基因点突变或基因同源重组( 产生抗原漂 移、受体嗜性改变等) 很显然,2009 甲型 H1N1 流感病毒表面基因发 生了点突变, 但目前没有相关研究证实 2009 甲型 H1N1 流感病毒可能存在基因同源重组的可能。 2009 甲型 H1N1 流感病毒的 HA 和 NA 发生了明显 的抗 原改变, 与 其最 为可 能的 祖先 A/Swine/ Indiana/P12439/00 ( H1N2 病 毒 ) 和 A/Swine/ England/195852/92( H1N1 病毒) 相比, NA 的同源 性分别只有95%和 94%。根据序列分析, 季节性流 感病毒 H1H1 代表株( A/Brisbane/59/2007, 2008 年 人用疫苗株) 的 HA 和 NA 与本次流感病毒代表株 ( A/California/04/2009) 的氨基酸同源性分别只有 73%和 82% , 两者抗原性相差甚远。因此, 已有的 甲型 H1N1 流感病毒疫苗无法产生有效保护。 4.3 2009甲型 H1N1流感病毒来源于实验室的疑 问 某澳大利亚学者在分析了 2009 甲型 H1N1 流 感病毒基因序列特征后,质疑其可能来源于实验室。 虽然缺少证据,但目前科学家确实已可通过成熟的 反向遗传技术系统在实验室中制造各种流感病 毒[ 16] ,此技术可以加快流感病毒的进化速度。因 此,实验室生物安全问题毫无疑问是值得警惕的。 流感病毒反向遗传技术目前被世界上许多相关实验 室用于流感病毒疫苗研究和基因功能研究等, 不排 除在此过程中可能产生的各种重排病毒和突变病毒 流出实验室,并在自然界进一步适应进化和淘汰, 形 成新的流行毒株。 5 结语 目前值得庆幸的是 2009 甲型 H1N1 流感病毒 ·17·微生物与感染 2009 年 6 月第 4 卷第 2 期 Journal of Microbes and Infection, June 2009, Vol. 4, No. 2 仍然对部分抗病毒药物敏感,致病力还未太强, 病死 率为0. 55% ( 139/25 288) 。由于 76. 3% ( 106/139) 的死亡病例发生在墨西哥, 这对发展中国家如何应 对突发新传染性疾病提出了新的挑战。毫无疑问, 2009 甲型 H1N1 流感病毒的传播能力相当强, 现代 交通工具的快捷性也加快了流感病毒的传播。由于 2009 甲型 H1N1 流感病毒目前仍在人群中流行, 其 表面抗原在受到强免疫压力后必然会发生快速突 变,且现在正是普通流感病毒流行期, 如 2009 甲型 H1N1 流感病毒与其他流感病毒共同在人群中流 行,也将增加它们相互交换基因而产生更具适应性 和更高致病力毒株的可能性。因此, 从人医和兽医 角度对流感病毒进行检测, 以及加强流感病毒进化 和跨宿主传播机制方面的研究均尤显迫切。 参考文献 [ 1] Rambaut A, Pybus OG, Nelson MI, et al. 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