第八章 基因诊断和基因治疗

nullnull第八章基因诊断与基因治疗null基因诊断（gene diagnosis）： ——从基因水平探测和分析疾病的起因。基因治疗（gene therapy）： ——从基因水平干涉和矫正疾病造成的紊乱。* 多数非感染性疾病发生的根本原因是基因结构的变异或达水平的异常；感染性疾病则是病原体入侵在体内表达外源性基因所致。**null*一、基因诊断的概念和特点二、基因诊断的主要技术方法三、常见的基因异常及其检测四、疾病的基因诊断(自习)五、基因诊断在法医学上的应用第一节 基因诊断 (gene diagnosis)*null* 基因诊断通常是指利用分子生物学的方法技术，直接检测体内DNA的结构变异或RNA的水平变化，从而对疾病作出诊断的方法。一 、基因诊断的概念和特点（一）概念 适用于遗传性疾病、感染性疾病、肿瘤等多种疾病的诊断，以及个体识别和亲子鉴定等法医学领域。*null*（二）特点--以已知基因作为检测对象（l）特异性强 （2）灵敏度高 （3）取样便利（4）早期诊断（5）应用广泛*null(一)核酸分子杂交（NA hybridization）（已学） (二)聚合酶链式反应（PCR）技术）（已学） (三)单链构象多态性分析（SSCP） (四)DNA分子多态性（DNA polymorphism）分析(五) 限制酶核酸内切谱酶切图谱分析(六)显微切割（microdissection）技术*(七)DNA序列测定（DNA sequencing） （已学） 二、基因诊断的主要技术方法**(一)核酸分子杂交*(一)核酸分子杂交4.DNA 芯片(DNA chip)技术 Southern/DNA印迹、Northern/RNA印迹 (第七/六章)和Western/蛋白质印迹(第九/二章)其他杂交方法:1.斑点印迹(dot blotting)与狭缝杂交2. 组织原位杂交(tissure in situ hybridization )3. 等位基因特异性寡核苷酸杂交 (allele-specific oligonucleotide hybridization, ASOH) 二、基因诊断的主要技术方法*null**荧光原位杂交(FISH) ：用于特定基因的定位及其缺失、扩增或重排的检测。null*荧光原位杂交检测原癌基因ERBB-2(Her-2)*null*荧光原位杂交（FISH）* 2008年，美籍华裔科学家钱永健，因研究绿色荧光蛋白方面的突出贡献而获诺贝尔null*等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASOH) 根据已知基因突变位点的碱基序列，设计和制备与野生型或突变型基因序列片段互补的两种探针，分别与被检DNA进行杂交，确定基因突变存在与否，分辨纯/杂合子。 方法：应用：基因结构变异所致疾病的诊断。特点：杂交条件要求严格，以避免出现假阳性或假阴性。*nullASO2：突变基因ASO1：正常基因ASO3 ASO3ASO3：杂合子基因等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASOH)null*(1) DNA的微量分析 (2) RT-PCR(reverse transcriptional-PCR)(3)巢式-PCR(nested PCR) (4) 不对称PCR(asymmetric PCR ) (5)多重PCR(multiplex PCR) (6)等位基因特异性PCR(AS-PCR) (7)原位PCR (in situ PCR,IS-PCR) 技术(二) PCR 技术 二、基因诊断的主要技术方法（8）实时荧光定量PCRnull*(三) 单链构象多态性分析 利用单个或多个碱基不同、但序列长度相等的双链核酸分子，经变性成单链后可具有不同的构象而在非变性PAGE电泳中的迁移率不同；(single strand comformation polymorphism, SSCP) 二、基因诊断的主要技术方法* 与正常的电泳图型对照，出现新条带即可判定存在碱基变异。null*与PCR联用称为PCR-SSCP；广泛用于大批样品基因突变的检测(初筛)。(三) 单链构象多态性分析(single strand comformation polymorphism, SSCP)null*1.限制性片段长度多态性的检测2.单核苷酸多态性3.数目可变的串联重复序列多态性的检测(四)DNA分子多态性 (DNA polymorphism )分析(single nucleotide polymorphism, SNP )(variable number of tandem repeats, VNTR)(restriction fragment length polymorphism, RFLP )* 二、基因诊断的主要技术方法null*VNTR的重复序列出现次数在6次100次之间；小卫星DNA(minisatellite DNA):重复单元长度为6~70bp；微卫星DNA(microsatellite DNA ):重复单元长度为1~6bp。短串联重复DNA(short tandem repeat DNA, STR DNA):重复单元长度为2~6bp。根据重复单元长度可分为：*null* 不同个体间重复单元 [如(CA)n/(TG)n]的拷贝数 (即出现的频率) 不同，因而产生多态性，称为VNTR多态性。VNTR多态性：限制酶识别位点 限制酶识别位点 *null(五) 限制酶核酸内切谱酶切图谱分析 某限制酶的切点改变时(由点突变、单个碱基的插入或缺失引起)，用该限制酶切割后得到的DNA片段的大小和数目都随之发生变化，通过电泳分析即可作出判断。PCR-RFLP 设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在 PCR扩增后用该限制酶切割 PCR产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。 二、基因诊断的主要技术方法null-GAATTC- -CTTAAG-EcoR Ⅰ限制性内切酶位点的变化null 瑞士 MII CellCut 全自动激光显微切割（荧光）系统 美国Arcturus公司的Veritas激光捕获显微分离仪(六)显微切割(microdissection)技术 二、基因诊断的主要技术方法null(七)DNA序列测定 该法是基因诊断所有的技术方法中最准确最可靠的—种。缺点：费时、费力、费用高。 二、基因诊断的主要技术方法null(一)点突变的检测三、常见的基因异常及其检测(二)大片段核苷酸丢失或插入的检测(三)基因重排的检测(四)基因扩增的检测(五)DNA多态性的检测 (六)基因表达异常的检测(七)病原体基因的检测 null(一)点突变的检测 狭义的点突变指碱基替代，分为单点突变和多点突变；广义的点突变还包括少数核苷酸的缺失或插入。 三、常见的基因异常及其检测1.已知点突变的检测 突变位点已被阐明的遗传病，可采用PCR等位基因特异性寡核苷酸杂交(PCR/AS0H)检测。null2.未知点突变的检测初筛：PCR-SSCP分析法 确认：DNA sequencingnull原因：β-珠蛋白链第 6位密码子GAG→GTG，造 成Glu→Val所致。bp 结果：3. 少数核苷酸缺失或插入的检测 可供选择的方法：PCR-RFLP分析、AS-PCR(等位基因特异PCR）、PCR-SSCP及DNA测序等镰刀型红细胞性贫血null(二) 大片段核苷酸丢失或插入的检测 1. 中等长度 (0.5-1.5kb) 的DNA片段缺失或插入，可用一对引物的普通PCR检测。 2. 若基因较大度 (大于1.5kb) ，且多个位点 存在插入或缺失、位点间距离较远，宜采用多重PCR法检测。（多重PCR的引物设计示意图）三、常见的基因异常及其检测null DMD基因定位于人类 X染色体短臂 Xp21.2上。位于该区的dystrophin(肌营养不良蛋白)基因的突变或部分缺失，是导致DMD的原发病因。 dystrophin基因中有9个易发生缺失的热点区片段,它们分别位于外显子4、8、12、17、19、44、45、48和51。杜氏肌营养不良症 (Duchenne muscular dystrophy, DMD)null*多重PCR法检测中的基因突变 同时用2对引物双重扩增dystrophin基因外显子17和48区域内的2个片段，可检测出75％左右的基因缺失型患者； 若同时用9对引物多重扩增，则可以检测到90％左右的基因缺失型患者。*null(三) 基因重排的检测 基因从一条染色体的正常位置转移到其他染色体的某个位置称基因易位或重排。1.荧光原位杂交技术(FISH) 2.PCR扩增 可用不同颜色的荧光标记DNA探针，可在染色体上定位基因或DNA片段及它们彼此间的排序。 前提条件是已知重排基因和位点的序列。三、常见的基因异常及其检测null**null(四) 基因扩增的检测 基因扩增指基因拷贝数增加的现象,可增加几十到上千倍。 可用待测基因的 DNA片段或cDNA片段为探针，基因组DNA 采用适当的限制酶酶切后作Southern印迹杂交分析。三、常见的基因异常及其检测null (五)DNA多态性的检测 1.限制性片段长度多态性(RFLP)2.数目可变串联重复序列(VNTR)多态性 多态性位点周围DNA序列已知时，可用PCR/ RFLP分析。 针对串联重复序列两侧的DNA序列设计引物，PCR 扩增后电泳。三、常见的基因异常及其检测null1. mRNA 的相对定量分析 (1) 斑点杂交或狭线杂交 (2) RT-PCR 法 (六)基因表达异常的检测三、常见的基因异常及其检测2. mRNA的绝对定量分析 用荧光定量PCR法对扩增产物定量。3.mRNA的长度分析(2)先分析RT-PCR产物电泳条带长度，后测序确认。(1)采用Northern印迹杂交法检测某种特异的mRNA的 长度有否改变； null(一)遗传病的基因诊断1.血红蛋白病（hemoglobinopathy） 四、疾病的基因诊断(自习)2.苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)(二) 感染性疾病的基因诊断1.乙型肝炎的基因诊断2.痢疾杆菌和侵袭性大肠杆菌的检测(三) 肿瘤的基因诊断1.肺癌(lung cancer)2.乳腺癌(breast cancer)null(一)重复序列多态性与DNA指纹 人类基因组DNA序列中存在众多的多态遗传标记，除非同卵双生，几乎没有任何两个人的DNA分析图谱会完全相同，称为DNA指纹。五、基因诊断在法医学上的应用 人类基因组中存在有大量的数目可变的串联重复序列(VNTR)；可分为小卫星 DNA、微卫星DNA/短串联重复(STR) DNA 。 VNTR位点的平均杂合度在70% 左右，可取代RFLP成为构建连锁图谱的新标记。null(二) DNA指纹与法医案检工作 ※法医学基因诊断的主要目的: 个体识别和亲子鉴定。※法医案检中的基因诊断技术VNTR（数目可变串联重复序列/小卫星）的核酸分子杂交分析 STR（短串联重复序列/微卫星）的PCR分析 SNP的基因芯片检测五、基因诊断在法医学上的应用null*亲权鉴定与DNA指纹图 由此图可推断出：A和C是亲生女儿；B为妻子和其前夫所生；D为养女。 *null血迹中的DNA**Alec John Jeffreys Oxford, United Kingdom null第二节 基因治疗（gene therapy）一、基因治疗的概念二、基因治疗的基本程序三、基因治疗的主要策略和技术方法四、遗传病的基因治疗(自学）五、肿瘤的基因治疗（自学）六、感染性疾病的基因治疗(自学）七、基因治疗临床试验的现状分析（了解）八、基因治疗存在的问题与展望(了解）null生活在保护罩中的SCID患病儿童**nullnull 导入的基因可以是正常基因、重组基因或 RNA，还涵盖了基因上调及下调。一、基因治疗的概念 指应用分子生物学技术导入外源基因，在原位修复基因的缺陷，或纠正或补偿因基因的缺陷和异常引起的功能紊乱，从而达到治疗疾病的目的。**null(一)目的基因的选择与制备(七)基因治疗临床试验的审批和实施（自学）(六)转染细胞的筛选和导入基因的鉴定(四)基因导入的 非病毒学方法(五)靶细胞的选择(三)基因导入的 病毒学方法 二、基因治疗的基本程序(二)基因导入方式的选择*null遗传病一般用野生型的正常基因(一)目的基因的选择与制备(二)基因导入方式的选择 又称为离体法，即选择适当的靶细胞，一般取自患者，在体外进行基因转移，筛选出表达外源基因的细胞，再将这些细胞放回患者体内。 是目前应用较多的方式1.间接法(回输法) (ex vivo) 2.直接法(体内法) (in vivo)3.原位法 (in situ)null 病毒学方法是以重组病毒为载体，将外源基因与病毒载体重组后，通过感染而将目的基因导入靶细胞的方法。(三)基因导入的病毒学方法**感染细胞null常用的RNA病毒载体：逆转录病毒(retrovirus, RV ) 慢病毒(lentivirus):也属于RV家族常用的DNA病毒载体：腺病毒(adenovirus,Ad) 腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV) 单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV) 埃-巴二氏病毒 (Epstein-Barr virus,EBV) 痘苗病毒(vaccinia virus)*null1.逆转录病毒载体基因组分为3个区：※长末端重复序列（long terminal repeat, LTR) :※结构基因： gag、pol、env 3个结构基因※ ψ [psai]序列：病毒包装信号序列增强子、启动子、转录起始和终止信号莫洛尼氏鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因组结构示意图莫洛尼氏鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因组结构示意图 LTR LTR U5 R U3 U5 R U3 U3=增强子， R=启动子， U5=转录起始位点； Ψ=病毒包装信号； gag =核心抗原，pol=逆转录酶， env=外壳蛋白。ψgag pol env**null4)具有内部核糖体进入位点(IRES)的载体1)基于LTR的载体2)内部启动子载体3)双拷贝基因载体(1) 逆转录病毒载体的结构特点和类型：结构特点： 删除结构基因gag、pol和env；加入一个抗性标记基因(新霉素磷酸转移酶基因：neo) 、适当的酶切位点。1.逆转录病毒载体类型：null(2) 包装细胞 是事先转染及整合了缺陷型逆转录病毒(辅助病毒)基因的哺乳动物细胞系。 辅助病毒因含有完整的病毒结构基因序列，所形成的细胞系能大量产生病毒包装蛋白；但辅助病毒自身的RNA因缺失了包装信号(ψ)及相关序列，不能被包装，本身不产生病毒颗粒。 逆转录病毒载体DNA 转染进入细胞后，由载体转录出标记基因和目的基因的RNA(含有5’-LTR、3’-LTR和包装信号)，可被包装细胞产生的病毒蛋白包装成病毒颗粒。null 经包装细胞系产生的病毒颗粒，含有病毒结构蛋白，但其RNA(由目的基因及标记基因转录合成) 不含病毒蛋白的编码序列，故只有一次性感染能力，即感染细胞后不能产生新的病毒颗粒，被称为假病毒颗粒。 假病毒颗粒可以释放到包装细胞的培养液中，收集后可用来感染靶细胞，使之稳定表达目的基因，同时又可避免病毒扩散。**null1234假病毒颗粒的产生并感染靶细胞逆转录病毒载体重组逆转录病毒的RNA被病毒蛋白包装（假病毒）转染出芽包装释放感染null（3）逆转录病毒载体的优缺点优点： ※宿主范围广，感染宿主细胞效率高，且可同时感染大量细胞并长期存留； ※能整合于宿主细胞的染色体中，可使靶细胞变成稳定表达目的基因的转化细胞。缺点： ※只能在核膜尚未形成时才能进入核内，故只能将外源基因转移至增殖分裂的细胞； ※能容纳外源基因的大小有限，应小于8kb； ※稳定性较差，在纯化或浓缩过程常使其感染性降低，在体内病毒颗粒能迅速被补体破坏。*null(4) 逆转录病毒载体的安全性逆转录病毒感染的可能性：污染的可能性：逆转录病毒载体在靶细胞基因组的随机整合： 可能破坏细胞生长的必需基因或抑癌基因；激活或增强原癌基因表达。 所用逆转录病毒载体的假病毒均是从细胞培养上清中制备； 在包装细胞内，ψ序列和不含ψ序列的辅助病毒间发生重组，形成具有感染能力的野生型逆转录病毒；*null2.腺病毒载体 腺病毒(adenovirus,Ad)有49种血清型，根据其凝血特性分为 A-F 6个亚型,其中 C亚型的2型和5型(Ad2和AD5)在人体基本不致病,故腺病毒载体多由2型和5型病毒基因改建而来。 腺病毒基因组由早期转录域、晚期转录域和RNA聚合酶Ⅲ转录子(VA)组成。*null ITR ITR 早期转录域基因：E1a、E1b、E2、E4编码病毒DNA 复制所必需的调节蛋白；E3介导宿主对腺病毒感染的反应；各自有单独的启动子控制。 晚期转录域基因：L1、L2、L3、L4、L5和IVa2 编码病毒结构蛋白；由单一主要晚期启动子控制。 两端短末端反向重复序列（inverted terminal repeat, ITR） ：含有病复制和包装所必需的顺式调控元件。腺病毒基因组结构示意图：*null 2.感染宿主细胞范围较广，既能感染分裂相细胞，也能感染非分裂相细胞； 5.腺病毒载体不易被补体灭活，可直接体内应用。 3.可获得高滴度的病毒颗粒；优点：* 1.基因导入效率高，对人类安全； 4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；腺病毒载体的优缺点null2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。3.有两个环节可能产生复制型腺病毒。 4.基因组较大，构建载体较复杂；靶向较性差。 1.不能整合到靶细胞的基因组DNA 中。(1)腺病毒产生过程中与 293辅助细胞内E1区序列发 生同源重组； (2)腺病毒载体与被治患者体内已感染的野生型腺病 毒，甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。缺点：*腺病毒载体的优缺点null3.受体介导的基因转移技术通过受体介导的细胞内吞作用将基因导入2.直接注射法肌肉和瘤体内注射，可将裸DNA直接注射。1.脂质体法(四)基因导入的非病毒学方法 目前普遍使用阳离子脂质体 ( lipofectin和lipofectamine)，其转染细胞的效率比一般的脂质体要高几个数量级。4. 其他：表达识别膜抗原的单抗/鱼精蛋白将质粒DNA导入null(五) 靶细胞的选择*生殖细胞基因治疗 （国际上严禁进行人生殖细胞的基因治疗操作）2．体细胞基因治疗1.转染细胞的筛选：G418(六)转染细胞的筛选和导入基因的鉴定2.导入基因的鉴定: PCR、Northern 印迹、免疫组化、免疫沉淀 动物实验(七)基因治疗临床试验的审批null1.基因标记实验三、基因治疗的主要策略和技术方法(一)基因治疗的主要策略*2.基因置换（gene replacement） 3.基因添加（gene augmentation） 4.基因干预 (gene interference)null(二)基因干预主要有以下几种方法1、反义RNA技术 反义RNA结合于细胞中特异mRNA，抑制基因的表达。反义RNA的应用方法： (1)体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞； (2)构建表达(转录)反义RNA的重组体，并导入细胞，转录出反义RNA而发挥作用。*null2、核酶(ribozyme)技术 基因治疗时，利用核酶分子结合到靶RNA分子中适当的部位，形成锤头状核酶结构，将靶RNA分子切断，达到治疗的目的。*null3. RNA干扰 RNA干扰(RNA interference，RNAi) 是一种由双链RNA 诱发的基因沉默现象。在此过程中与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因的表达。 有义RNA或反义RNA均能抑制基因的表达，而且双链RNA比单链RNA更为有效，其抑制基因表达的效率比反义RNA至少高2个数量级。*nullRNA干扰过程主要有2个步骤： （1）小干扰性RNA（siRNA）形成（2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)。 该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断 长的双链RNA在细胞内被双链RNA特异性核酸酶(Dicer)切成 21~23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰RNA (small interfering RNA， siRNA)。RNA干扰的机制*null小RNA干扰现象的几个概念 ☆微小RNA ：也称micro RNA(miRNA) ，一般临时出现于发育阶段，其前体大小约70nt，形成发夹结构，已发现数百种。 ☆小干扰RNA（ small interfering RNA，siRNA ）：大小21~23 nt, 双链RNA。 ☆RNA干扰（RNA interference ，RNAi ） ☆ RNA干扰沉默复合体 （RNA interference silencing complex ，RISC）nullmiRNA和siRNA使靶基因mRNA沉默的机制Fire和Mello也因此荣获2006年度诺贝尔生理学/医学奖。*null发育过程的调节抑制转座子活性和病毒感染生物学效应不需完全互补需完全互补靶mRNA 结合单链分子双链分子结构内源发夹环结构的转录产物内源或外源长双链RNA诱导产生前体miRNAsiRNAsiRNA 和miRNA的差异比较null4、自杀基因技术 自杀基因（suicide gene）技术就是用适当载体将一些“自杀基因” 转导入肿瘤细胞中，这些基因所表达的产物能将原先对细胞无毒或相对低毒的药物前体转变为细胞毒性物质，而起到杀伤肿瘤细胞的作用。tk基因：胸腺嘧啶核苷激酶（thymidine kinase） cd基因：胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase CD）自杀基因*null自杀基因(suicide gene)的功能示意图抑制 DNA合成 *细胞死亡自杀基因 + 病毒载体 重组载体 转染(有毒)(无毒)tk基因(细胞) null七、基因治疗临床试验的现状分析Total：17861999，Jesse Gelsinger2002，5名 SCID-X1 患者2007，Jolee Mohrnull(一) 获准实施临床试验的疾病种类Total：1786null(二) 所用目的基因和靶细胞来源Total：1786null(三) 基因导入系统和导入途径Total：1786null(四) 临床试验的实施阶段Total：1786nullTotal：1786(五) 临床试验的国家分布八、基因治疗存在的问题与展望null