硫酸软骨素含量的测定方法--HPLC法

液相色谱法 GB/T 20365-2006 该法的直接分析对象是硫酸软骨素分子本身，不同的硫酸软骨素有不同的保留时间，根据硫酸软骨素的特性进行色谱柱分离，通过色谱柱分离后定量测定CS含量，同时可检测CS产品纯度。该法专属性强、精密度和准确度较高，样品溶解可直接测定CS含量以及确定CS纯度。 但要考虑到自己的CS含量可能不纯，到时候可能会出现杂峰。 酶解-液相色谱法（药典-硫酸软骨素钠） CS钠在硫酸软骨素ABC酶作用下，酶解为三种不饱和的二糖，再通过色谱柱分离后定量测定氨基己糖和葡萄糖醛酸的含量。此法优点是可以根据硫酸软骨素A 、B 和C 的量判断产品软骨的来源。猪来源的硫酸软骨素A 与C 的比值约5.5；牛的比值约1.5；鸡的比值约4.6；鱼的比值约0.5。 如果胶原蛋白中不含有葡萄糖醛酸和氨基己糖的话，该方法就是最适合的方法了。 比色法（国家药监局-WS-10001-HD-0892）-2002） 根据Elson-Morgan反应进行。用此反应测定分子组成中的2-氨基-D-葡萄糖和2-氨基-2-脱氧-半乳糖，包括用碱性乙酰丙酮处理生成的几个生色基团与对二甲氨基苯甲醛（Ehrlich’s试剂）反应生成红色化合物，以分光光度法测定吸收值，同时用氨基己糖制备曲线。操作时，先用HCI水解硫酸软骨素产生氨基己糖，在碱性条件下与乙酰丙酮反应，再与对二甲氨基苯甲醛缩合，生成红色化合物。 该法操作繁琐，影响因素较多，如水解时间、保温时间、pH值、浓度等， 不仅不能准确测定CS的主体结构的真实含量，而且结果重现性不好。 因为待测物中还含有羟脯氨酸等氨基酸，影响含量测定，故在本测试中不适用。 改善的 Briefly, in this procedure the polysaccharide solution was hydrolyzed by heating in 6 N HCI at 95°C for 4 hr. The hydrolyzate was dissolved in distilled water to a final concentration of about 100μg/ml and 1 ml of the dissolved hydrolyzate was used for each separate determination. The solution of monosaccharides was then heated at 95°C at pH 9.8 and successively reacted with 2,4-pentanedione (acetylace- tone, Fisher Scientific, Fair Lawn, N.J.) and with p-dimethylamino benzal-dehyde (DAB) (Fisher Scientific, Fair Lawn, N.J.) until a red chromagen adduct was formed. The concentration of chromagen was determined spectropho-tometrically at 527 nm (Model 6-20A Spectrophotometer, Coleman Instruments, Maywood, Ill.). Our modification consisted in replacing 95% ethanol (Commercial Solvents, Terre Haute, Ind.), the solvent commonly used in preparation of the DAB solution (Ehrlich’s reagent), with 2-propanol (Certified ACS, Spectranalyzed, Fisher Scientific, Fair Lawn, N. J.). This replacement improved the procedure by reducing significantly the color developed by the DAB solution (blank) in the absence of the polysaccharide unknown. Use of 2-propanol in place of 95% ethanol (100% ethanol, Commercial Solvents, Terre Haute, Ind., was also tried but found unsatisfactory) increased the signal/ noise ratio of the spectrophotometric reading by a factor of 5 through the entire range of concentration of the polysaccharide. Elson-morgan方法标准差为9%。无明显的系统误差，更适用于含量为5%以下的测定。 液相色谱法，缺点在于随着水解时间延长，峰面积减少，相对来说，在低含量下,Elson-morgan法更精确。 咔唑法 该法主要用于测定CS-A钠。 方法原理：硫酸软骨素在酸性溶液中水解生成D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖。本方法是基于CS溶液中加热水解生成等摩尔数的葡萄糖醛酸，与咔唑溶液发生缩合反应生成紫红色化合物，于波长520 nm波长处有最大吸收。 该法准确度有所提高，但专属性仍然不强。对产品中掺入葡萄糖醛酸造成测定结果偏高的问题无法解决。 查一下胶原蛋白水解物对测定结果有没有影响？有没有D-葡糖醛酸？ 比色法的缺点在于：①杂质成分不明，不知道是否会掺入影响杂质；②操作繁琐，影响因素较多。 CPC电位滴定法——氯化十六烷基吡啶 方法原理：CS为聚阴离子，可与CPC结合，在适宜条件下生成稳定的乳浊液，与CS对照品溶液比较混悬液的透光度。可知检测物的含量。 测定时，以含聚山梨醇酯80的pH7.0磷酸盐缓冲液作为稀释剂。 该法主要用于测定原料及产品等。该法实验的影响因素少、便于操作，但其他酸性粘多糖也有类似的沉淀反应，专属性不好。 本身GAG与胶原蛋白共沉淀后，净电荷呈正点还是负电呢？在酸性条件下，还是正点吧，该法则不能采用了吧？