线虫的培养及其发育过程的观察

线虫的培养及其发育过程的观察 1、 实验原理 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegan）属于线虫动物门（Nematoda）隐杆线虫属（Caenorhabditis）秀丽隐杆线虫种（C.elegans），根据命名法则中的二名法命名为Caenorhabditis elegans。上世纪六七十年代分子遗传学的奠基人之一Sydney Brenner将线虫作为分子生物学和发育生物学的研究的模式生物。C.elegans为蠕虫状，长度约1mm，因其个体结构简单、体细胞数目恒定，特定细胞位置固定，生活史短、遗传背景清楚、基因组测序已经完成等，在遗传与发育生物学、行为与神经生物学、衰老与寿命、人类遗传性疾病、病原体与生物机体的相互作用、药物筛选、动物的应急反应、环境生物学和信号传导等领域得到广泛应用。如细胞凋亡现象及其机理以及RNA干扰技术最早都是在线虫中被揭示的。http://www.wormatlas.org/ （一）C.elegans的基本结构以及生活史 C.elegans有雌雄同体（XX）和雄虫(XO)两种性别，在自然条件下， 成虫大多为雌雄同体，雄虫的个体数只占大约千分之一。其基本的结构包括口、咽、肠、性腺以及胶原蛋白角质层，雌雄同体有两个卵巢、输卵管、储精囊，及单一一个子宫（图1，2），雄性有个单叶的性腺、输精管及一个特化为交配用的尾部（图3，4）。 C.elegans是唯一一个身体中的所有细胞能被逐个盘点并各归其类的生物。其幼虫含有556个体细胞和2个原始生殖细胞，而它的成虫则根据性别不同具有不同的细胞数。最常见的雌雄同体成虫在发育期间，共产生1090个细胞，其中131个在特定时期凋亡，因此，其成熟后含有959个体细胞和2000个生殖细胞，而较少见的雄性成虫则只有1031个体细胞和1000个生殖细胞。 C. elegans有五对常染色体和一对性染色体，是一个染色体数很少的二倍体。 图1 雌雄同体线虫解剖示意图 图2 雌雄同体线虫 A．DIC（微分干涉显微镜）拍摄的图； B. 雌雄同体线虫解剖示意图 图3 雄虫 A. 雄虫解剖示意图； B. DIC（微分干涉显微镜）拍摄的图； C. 性腺放大图； D. 尾巴放大图； E. L3时期雄虫尾巴图（上面是雄虫尾巴，下面是雌雄同体的尾巴） 图4：电镜下的雄虫 C.elegans的生活史包括胚胎期、幼虫期（L1-L4）、成虫期三个阶段（如图6）。一个雌雄同体线虫一生约可以产300个卵，卵经过L1、L2、L3、L4 4个幼虫时期，进入成虫期，如果外部条件比较恶劣，比如：拥挤、缺乏食物等，线虫会进入一个特殊的L3时期——dauer时期来抵抗外部的不良环境。C.elegans在实验室20-22℃的条件下，约3.5天长成成虫，可存活两到三周。线虫可以自体受精，当卵母细胞经过贮精囊时受精，也可以接受雄虫的精子进行异体受精（图5）。 图5 雄虫和雌雄同体线虫交配 根据实验需要，可将线虫饲养在固体培养基或者液体培养基中。 图6 22℃下秀丽隐杆线虫的生命周期 2、 实验目的 1、 理解线虫作为模式生物的优势以及在相关研究领域的应用； 2、 掌握线虫的基本培养技术，观察并且区分两种线虫个体发育过程的异同； 3、 实验器材 （1） 实验器材 恒温生化培养箱、解剖显微镜、超净工作台、6cm培养皿、挑针、摇床、10ml离心管以及管架、1.5ml离心管以及管架、250ml锥形瓶、酒精灯、75%酒精棉球 （2） 实验试剂 野生型N2线虫、E. coli OP50、LB固体培养基、LB液体培养基、NGM培养基等。 4、 实验步骤 1、 线虫培养板的准备： （1）配置NGM(Nematode Growth Medium)线虫基本培养基 A. 配置以下试剂 1M KPO4缓冲液：108.3 g KH2PO4、35.6 g K2HPO4加水至1升（高压灭菌） 1M MgSO4（高压灭菌） 1M CaCl2（高压灭菌） 5 mg/ml胆固醇（用无水乙醇配置，配完后，过滤，4℃保存） B. 称取3g NaCl 、2.5g蛋白胨 、20g Agar 到锥形瓶中，加入975ml H2O，高压灭菌，121℃ 20 min C. 待培养基冷却至55℃时，加入25 ml 1 M KPO4缓冲液、1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4、1 ml 5 mg/ml 胆固醇, 混匀。 D. 将混匀的培养基倒入线虫培养皿中，约2/3培养皿高度。室温放置过夜。 （2）线虫食物的准备： A. 配置LB液体培养基： 称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl到锥形瓶中，加入1L H2O，调PH值到7.0，高压灭菌 B. 吸取灭菌后的5ml LB液体培养基到10ml已灭菌的管中，挑取op50单克隆到液体LB中，37℃ 振荡过夜(10-15 h)。菌液可4℃保存2周。 （3）每个NGM平板中滴入200μl的菌液，室温放置过夜，即可用于线虫的培养。 2、线虫的观察： 每个小组在解剖显微镜下，对观察用线虫（主要是N2）按照下列提纲进行观察： · 认识线虫的各主要组织器官：头部、尾部、咽、肠、子宫； · 区别雌雄同体以及雄虫； · 观察线虫的运动方式； · 观察线虫的进食、产卵（线虫约20分钟产一次卵，每次可连续产5-10个卵）等行为； · 区分各个发育时期的线虫。 普通解剖显微镜下线虫特点（图9）： · 雌雄同体成虫：长约1110-1150μm，显微镜下可见子宫里面有排列规则的卵； · 雄虫：个体较雌雄同体短，身体细长，爬行速度快，最主要是其尾部，雄虫的尾部像扇子一样，雌雄同体尾部细长（图3，4）。 · L1幼虫：长约250μm · L2幼虫：长约360-380μm · L3幼虫：长约490-510μm · L4幼虫：长约620-650μm，比成虫要小，最主要特征是腹部有白色的点，通过点来识别L4时期线虫 · Dauer：翼部明显，体型非常瘦，长宽比为30:1，运动减慢 图9 秀丽隐杆线虫各个幼虫时期的大小比较 3、挑虫、培养： (1) 将铂金丝做的笔在酒精灯上烧红后，在线虫培养基上轻划几下，即可用于挑虫； (2) 解剖显微镜下找到合适的成虫，用“笔”将它轻轻挑起，迅速在解剖显微镜下将之放到新的平板上，共挑取3-5只线虫； (3) 将培养皿做好标记，放到20℃生化培养箱中培养； (4) 产卵3小时后，显微镜下可以看见培养皿上有椭圆颗粒状的线虫卵（胚胎），此时，可以将成虫挑走。产卵当天计作day0。 (5) Day1(次日)上午，胚胎发育成幼虫L1时期。 (6) Day2下午线虫发育到L4时期，显微镜下可看见线虫的腹部有白色的点。 (7) Day3 上午线虫开始产卵，一个生活周期结束。 4、实验结果分析： (1) 练习挑虫技术，直到能熟练地在平板之间进行线虫的转移而不伤害线虫； (2) 在线虫培养期间，请注意观察。 附：Pad制作方法（图10）： 1) 配置5%（质量体积比）agar 20ml； 2) 将两个载玻片平行的放置在水平桌面上，中间放一个盖玻片，用移液枪吸取5%的agar，滴一滴在盖玻片上后，上面放置一载玻片，尽量避免气泡的产生； 3) 将第三个载玻片拿起（盖玻片、agar、载玻片），用镊子将盖玻片（包括agar）轻轻的往边上推，用镊子将载玻片翻过来，此时agar面朝上。（Pad最好是现做现用，或者将做好的pad放在湿盒中保存） 4) 配置20-100mM的叠氮化钠，建议使用50mM（叠氮化钠有毒，戴手套）。吸取10-20ul的叠氮化钠到agar上，用眉笔挑取线虫5-15只到agar上； 5) 用镊子将盖破片倒置在载玻片上（agar面朝向载玻片），注意不要产生气泡； 6) 显微镜下观察。 图10 Pad 制作示意图 五、实验注意事项 1、 挑虫要多加练习，不要急于做实验。 2、 有些观察项目需要对同一个虫子进行连续观察，请耐心点。 3、在操作过程中，注意不要将培养基戳破，防止线虫钻进培养基内不方便观察。 4、操作过程中尽量少说话，防止污染线虫培养基。 5、如果在超净台外观察线虫，尽量不要打开培养皿的盖子。 6、线虫容易失水死亡，尽量缩短线虫离开培养基的时间。 7