牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立和应用

动物医学进展 。2007，28(7)：17-24 Progress in Veterinary M edicine 牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立和应用 张环·，杨俊兴 ，晁彦杰·，颜邦芬 ，吴 波 ，曹 莎 ，陈颖钰 ，谭亚娣 ，陈焕春 。，郭爱珍 。 (1．华 中农业 大学 农业微生物学 国家重点实 验室 ，湖北 武汉 430070；2．华中农业大学动 物 医学 院 。湖北武汉 430070) 摘 要 ：为了建立一种快速检测牛分支杆菌抗体的新方法用于诊 断牛结核病 ，利用胶体金免疫层析技术原 理，用原核诱导表达的牛分支杆菌抗原蛋 白 MPB83和 MPB70分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗 原，制备牛结核抗体检测试纸条。结果表明，粒径为 40 nlTl的胶体金制备的试纸条敏感性最高，胶体金最佳标 记 pH为 6．0，MPB83抗原最适标记量为每毫升胶体金 6．5／2g，MPB70抗原的最适 包被浓度为3．0 rag／mL，抗 MPB83蛋白 IgG的最佳包被浓度为 2．5 mg／mL，交叉试验证明试纸条不与牛的其他非相关疾病的阳性血清反 应，具有较高的特异性。比较试验证明其敏感性显著高于韩 国进 口试纸条。在上述试验条件下生产 了一批胶 体金试纸条进行临床样品检测，并与细菌分离培养、结核菌素皮内变态反应(TST)和韩国试纸条比较。本试纸 条与牛分支杆菌分离培养的符合率为 85 ，与TST的符合率为79．73％，与韩国试纸条的符合率为 98．75 。 快速检测牛结核抗体的免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点，适用于对牛结核病进行普查和检 疫，也可作为TST的辅助诊断方法，在牛结核病根除中具有良好的应用前景。 关键词：免疫层析 ；牛分支杆菌；牛结核 ；抗体检测 中图分类号 ：$852．618；$854．43 文献标识 码 ：A 文章编号 ：1007—5038(2007)07—0017—08 牛结核病是一种严重危害奶牛业的人兽共患传 染病，由牛分支杆 菌 (Mycobacterium boris)感染所 致[1]。“检疫扑杀”是目前国际通用的牛结核病控制 与根除策略。一些发达国家通过该策略成功控制了 牛结核病[2]，但牛结核在部分发达 国家与大多数发 展中国家仍对牛和人的健康构成严重威胁[3]。缺少 一 种兼有敏感、特异、简便、快速等多个特征的诊断 方法是实行“检疫扑杀”策略的障碍之一[4]。结核菌 素皮内变态反应(tuberculin skin test，TST)沿用了 百余年，但存在明显不足之处，包括对被其他分支杆 菌感染的动物没有特异性 ，不能判 断病情 ，免疫低下 动物易出现假阴性 ，不能进行 回顾性，操作繁 琐，对受试者刺激大等。外周血淋巴细胞 IFN—B释 放试验及针对多种抗原的 ELISA需要特殊仪器设 备，且耗时相对较长[4 ]。 免疫层析技术 (immunoehromatographie assay， ICA)[6 是近 2O年发 展起 来 的一项 免 疫学 检测 技 术。该技术不仅特异性强、敏感性高，而且不需要昂 贵仪器设备，操作简单快速。Greenwald R等[7 证 明 MPB83和 MPB70是 牛分支杆 菌主要 的特异性 分泌抗原。MPB70和 MPB83蛋 白的氨基酸序列具 有 61 的同源性，单克隆抗体验证了二者具有某些 共同抗原决定簇[8]。本研究利用牛分支杆菌的两个 同源蛋白质 MPB70和 MPB83，建立了一种双抗原 夹心胶体金免疫层析法。与现有方法的比较研究表 明，该方法具有灵敏度高、特异性好等优点。 1 与方法 1．1 抗原和血清 牛分 支杆 菌抗原蛋 白 MPB70和 MPB83均由 本实验室克隆、表达 ，并提纯和保存 。牛分支杆菌抗 原 MPB83的多克隆抗体由本实验室制备提纯并保 存。经结核菌素 (purified protein derivative，PPD) 皮试、ELISA、病理学和细菌学检验等方法证实的牛 结核病阳性和阴性血清由本实验室保存。牛副结核 病 、牛布鲁菌病 、牛巴贝斯虫 病、口蹄疫 和牛传染性 鼻气管炎病阳性血清均购自中国兽药监察所。临床 血清 241份采 自武汉市及 周边奶牛 场，120份 由中 国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所提供。 1．2 主要试剂及材料 氯化金(HAuC1 )、柠 檬 酸三钠 (NaC H O )、 聚乙烯吡咯烷酮(PVP一40)均购 自 Sigma公司；牛血 清白蛋白(BSA)购 自Roch公司；HRP标记的羊抗 收稿日期：2007—04—05 基金项 目：国家“十一 五”科技 攻关奶 业重大专项(2006BAD04A05)；武汉市科技攻 关课 (20066002O56) 作者简介 张书环(1981一)，女，内蒙古赤峰人，硕士研究生，主要从事动物病原分子生物学和免疫学研究。*通讯作者 维普资讯 http://www.cqvip.com 18 动物医学进展 2007年 第 28卷 第 7期(总第 166期) 兔和羊抗牛酶标二抗购 自Sigma公 司；硝酸纤维素 膜 ，玻璃纤维素膜，样品垫、吸水垫均购 自 Millipore 公 司。韩 国试剂 盒 “Anigen Rapid Bovine TB Ab Test Kit”购 自韩国动物遗传公司(Animal Genet— ics，Inc)。 1．3 MPB83一胶体金复合物的制备及 纯化 1．3．1 胶体金制备 参考 柠檬 酸三钠还原法L9]和 微波技术n。。，通过电子显微镜观察 ，确定制备 40 nm 胶体金颗粒的氯化金与柠檬酸三钠的最佳比例。其 操作步骤简述如下：将 100 mL 0．1 g／L的氯化金在 微波炉 中煮沸，在高速搅拌的状态下，迅速加入 0．70、1．O0、1．5O、2．O0、2．5O mL等不同体积新鲜制 备的 10 g／L柠檬酸三 钠 ，当溶 液颜色 变成深 蓝色 后 ，放置微波炉中继续加热 5 min，室温冷却后补足 所失水分，0．2 mol／L碳酸钾调整胶体金溶液 的 pH，0．22／Lm滤膜过滤后 4．C保存备用 。同时通过 电子显微镜下观察粒径大小及颗粒均匀程度 。 1．3．2 胶体金溶液的最佳 pH 确定 利用 EX— PASY工具包中Computepl／MW软件对 MPB83蛋 白的氨基酸序列进行分析，得出该蛋 白等电点为 4．86。用 0．2 mol／L碳酸钾将胶体金 溶液 的 pH调 整至等电点附近(5．0、5．5、6．0、6．5)，各取 1 mL不 同pH的胶体金分别加入过量的 MPB83蛋白，作用 45 min后加入 100 L i00 g／L NaCl，4℃静止 2 h 后观察胶体金颜色。胶体金颜色没有发生改变的最 低 pH为胶体金溶液的最佳 pH。 1．3．3 最适标 记抗原 量 的确定 用 0．02 mol／L pH 7．4的 PBS将待标记的 MPB83蛋 白稀释至 0．1 mg／mL，分别取 1O、2O、3O、4O、5O、6O、7O、8O、 90、100 L加入 1 mL胶体金中，用超纯水补足体 积 ，作用 45 min后加入 100肚L 100 g／L NaC1，4℃ 静止 2 h。以胶体金颜色没有发生改变的蛋白质加 入量最少的基础上 ，增加 3O 的蛋 白质含量为最适 标记量。 1．3．4 MPB83一胶体金复合物制备及纯化 取一定 量调整 pH 的胶 体金溶液，按 最适标 记量加入 MPB83蛋 白，中速搅拌 30 min后加入 100 g／L PEG20000，使其终浓度为 2 g／L，继续搅拌 30 min。 将金标 MPB83蛋白复合物在 4℃以 3 000 g离心 10 min，取上清，在 4℃以 15 000 g离心 30 min，沉 淀用 0．02 mol／L PBS pH 7．4，2 g／L PEG20000洗 涤 2次 ，在 4℃以 15 000 g，离心 30 min，沉淀用一 定量 的 PBS(pH7．4含 2 g／L PEG20000，10 g／L BSA，30 g／L海藻糖，0．2 g／L叠 氮钠)重悬，使 ODsss 一1．5，置于 4．c保存备用。 1．4 MPB7O与 MPB83的 同源性 检 测 利用 ELISAt¨ 和琼脂 扩散 试验L1 分别检测 MPB70和 MPB83与 抗 血 清 的 交 叉 反 应。将 MPB70包被酶标板条 ，包被浓度为 100 ng／~L，用本 实验室制备的兔抗 MPB83血清及 HRP一羊抗兔 IgG 检测 MPB70与 MPB83抗血清的反应，并与本实验 制备的 MPB70抗血清 、牛结核病 阳性血清和牛结核 病阴性血清的反应作对照 。同理 ，用 MPB83包被酶 标板 条 ，用 本 实 验 室 制 备 的 兔 抗 MPB70血 清及 HRP一羊抗兔 IgG检测 MPB83与 MPB70抗血清的 反应 ，并与本实验制备的 MPB83抗血清 、牛结核病 阳性血清和牛结 核病 阴性血 清的反应作对照 ，测定 波长 630 nm的吸光值(OD 。。 )。在琼脂扩散试验 中，将 10 g／L琼脂糖分别倾入两个培养皿 中，打孔。 中间孔 中点入 1：1O稀释的抗血清 ，周边 4个孔 中 分别点入 5O肚L浓度为 500／~g／mL和 1 000／zg／mL 的 MPB70和 MPB83，置湿盒 中于 37℃经 48 h后 ， 观察沉淀线。 1．5 免疫层析 法的建立 1．5．1 检测线抗原和质控线抗体的包被 原核表 达并提纯 的牛分支杆菌特异性蛋 白 MPB70作为硝 酸纤维素膜上的检测线包被抗原。将 MPB70蛋白 用 0．02 mol／L PBS(PH7．4)稀释至 1．0、1．5、2．0、 2．5、3．0、3．5、4．0 mg／mL，置一2O℃贮存备用。兔 抗牛分支杆菌特异性蛋 白 MPB83的 IgG作为硝酸 纤维 素膜 上 的质 控 线 包 被抗 体 。用 0．02 mol／L PBS(pH7．4)将兔抗 MPB83 IgG稀释至 1．0、1．5、 2．0、2．5、3．0、3．5、4．0 mg／mL，一2O℃贮存备用 。 将稀释后 的 MPB70蛋 白和抗 MPB83蛋 白的 IgG 用 Bio—dot XYZ3O5O点膜仪(Bio—Dot，USA)以每厘 米0．80 L体积分别喷到黏附在 PVP底板(300× 70 mm)上的硝酸纤维素膜的检测线和质控线上， 37℃烘干后贮存备用 。 1．5．2 金标垫的制备 将纯化的 MPB83一胶体金 复合物用 Bio—Dot点膜仪以每厘米 5O L的量喷到 玻璃纤维素膜上(300 mm×6 mm)，冷冻真空抽干 后，室温干燥后贮存备用。 1．5．3 样 品垫的处理 将样 品垫(300×20 mm)浸 泡于 0．01 mol／L pH 7．4磷酸缓 冲液 (20 g BSA， 25 g海 藻 糖 ，3g PVP一40，0．2 g NaN ，8 g NaC1， 0．2 g KC1，2．9 g Na2 HPO4·12H2 O，0．2 g KH2 PO ，用超纯水 定容 至 1 000 mL)中 30 min后，于 37℃烘干，真空封装，置 4℃备用。 1．5．4 试纸条的组装 如图 1所示 ，先将硝酸纤维 素膜(3)粘贴到 PVP底板(7)的相应位置，然后将样 维普资讯 http://www.cqvip.com 张书环等：牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立和应用 19 品垫(1)，金标垫(2)，吸收垫(4)依 次粘贴到 PVP底 板(7)的相应位置 ，使金标垫(2)与吸水垫(4)与硝酸 纤维 素 膜 (3)部 分 接 触 ，用 CM一4000cutter(Bio一 2 Dot，USA)将其切成 4 mm 宽，室温干燥后贮存备 用 。 6 4 1．样品垫}2．金标垫；3．硝酸纤维素膜；4．吸收垫；5．检测线；6．质控线；7．PVC底板 1．The sample pad；2．The gold conjugate pad；3．The nitrocellulose membrane；4．The absorbent pad；5．The test line； 6．The control line；7．The backing plate 图 1 免疫层析试纸条 的组装 示意图 Fig．1 Assembled sketch of immunochromatographic strip 1．5．5 样本检测原理与结果判定 取 150 L待检 血清滴加在试纸条的样品孔 中，15 rain内读取结果 。 若待检血清 中含有 MPB70或 MPB83的抗体 ，血清 将与胶体金(Gold，G)标记的 MPB83抗原反应，形 成 MPB70抗体-MPB83-G(胶体金)复合物和／或 MPB83抗体一MPB83一G复合物，遇到检测线处预先 包被的 MPB70蛋 白时就会形成 MPB70一MPB70抗 体一MPB83一G复合 物 和／或 MPB70-MPB83抗体一 MPB83一G复合物 ，检测线出现颜色深浅不同的红色 条带(图 2A)。质控线处预先包被有兔抗 MPB83抗 体，可与 MPB83-G形成兔抗 MPB83抗体一MPB83一 G复合物，出现红色条带。如果质控线上没有红色 条带出现(如图 2C和 2D)，则检测无效。质控线出 现条带但检测线无条带时，判断为阴性。 检测线 Quality control line 质控线 Test lilie 加样孑L Sample adding well A B C D 九 阳性 ；R 阴性 ；C，D．无效 A．Positive；B．Negative；C，D．Invalid test 图 2 试纸条结 果判定 示意图 Fig．2 Result determination of immunochromatographic strip 1．5．6 特异性检验 用制备好的牛结核抗体检测 试纸条分别检测牛结核阳性与阴性血清、牛副结核 病、牛布鲁菌病 、牛巴贝斯虫病 、牛 口蹄疫 和牛传染 性鼻气管炎阳性血清，进行试纸条特异性检测。 1．5．7 敏感性检验 将 1份牛结核病 阳性血清用 生理盐水倍 比稀 释，用本研究 组装 的胶体金试纸条 和韩 国的胶体金试纸 条平行检测 ，用能检测 出阳性 信号的血清最高稀释度作为检测敏感度。 1．6 临床样 品检测 按所优化的试验条件生产了一批免疫胶体金试 纸条，用于临床奶牛血清样品的检测，同时与细菌培 养、TsT和韩国进口同类试纸条进行比较。 1．7 统计学分析 应用 t检验 比较不同方法检测结果 间的差异。 2 结 果 2．1 MPB7O与 MPB83同源性检 测 用 ELISA方法 分别 检测 了 MPB70与 MPB83 与相 应 抗 血 清 的 交 叉 反 应 ，结 果 MPB7O能 与 MPB83的抗血清反应，反应 的 OD 。。 与对 照的 MPB70抗血清和牛结核阳性血清的OD 相当，且 与牛结核阴性血清反应 的 OD 。。 差异极显著 (P< 0．01)；MPB83也能与 MPB70的抗血 清反应 ，反应 的 OD 与 MPB83抗血清和牛结核阳性血清的 ODe 相当，且与牛结核阴性血清反应的OD 差 异极显著(P<0．01)(图 3)。 琼脂扩散试验结果显示，中间抗血清孔分别与 加入 MPB70和 MPB83的抗原孔之间分别出现 了沉 淀线 ，说 明 MPB70与 MPB83抗原与相应的抗血清 之间具有交叉反应，证实 MPB70与 MPB83具有共 同的抗原决定簇 。 维普资讯 http://www.cqvip.com 20 动物医学进展 2007年 第 28卷 第 7期(总第 166期) 萎 凸 0 暑 口 0 、 图 3 ELISA分析牛分支杆 菌 MPB70与 MPB83同源性 Fig．3 ELISA analysis of homdogy between M ．／~'vis MPB70 and MPB83 2．2 胶 体金 的制备 胶体金颗粒大小与柠檬酸三钠的加入量呈反比 (表 1)。将制备的不同粒径的胶体金在电子显微镜 下观察 ，并计 算 粒径 大小 ，最 终 确定 加入 1．6 mL 10 g／L的柠檬 酸三钠 于 100 mL 0．1 g／L的氯化金 溶液中所制备的胶体金颗粒约为 40 nm(图 4)。 2．3 最适标 记胶 体金 pH 的确 定 用 pH为 5．0、5．5、6．0、6．5的胶体金溶液标记 MPB83，室温作用 45 rain后加 入 100 L 100 g／L NaC1，4℃静止 2 h后观察胶体金溶液颜色。结果表 明，加入 100 g／L NaC1后胶体金颜色未改变的最低 pH为 6．0，因此最适标记 pH为 6．0。 2．4 最适标记抗原量的确定 取待标记 的 0．1 mg／mL MPB83蛋 白 1O、2O、 3O、4O、5O、6O、7O、8O、90、100 L分别加入 1 mL胶 体金 中，作用 45 rain后加入 100 L 100 g／L NaC1， 4℃静止 2 h观察。胶体金溶液颜 色未发生改变需 要的最低 MPB83蛋 白量 为 5．0／xg，最 低量的 3O 为 1．5 g，因此，每毫升胶体 金溶液中 MPB83最适 标记量为 6．5／zg(表 2)。 表 1 胶体金制备过程中柠檬酸三钠加入量的确定 Table 1 The determination of the adding amount during the preparation of colloidal gold 擎 图 4 胶体金颗 粒电镜照片 Fig．4 Electron microscope photo of colloidal gold particles 2．5 检测线抗原和质控线 IgG最佳包被浓度的确定 分别以1、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5、4．0 mg／mL 7种不同浓度的 MPB70抗原包被硝酸纤维素膜上 的检测线，结果显示，随着抗原包被浓度的增加，检 测线的颜色也逐渐加深，在到达 3．0 mg／mL以后色 泽不再加深 ，因此确定 3．0 mg／mL为最佳抗原包被 浓度。 分别以 1、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5、4．0 mg／mL 7 种不同浓度的抗 MPB83蛋 白的 IgG包被硝酸纤维 素膜上的质控线，结果显示，随着 IgG包被浓度的增 加，质控线的颜色也逐渐加深，在到达2．5 mg／mL以 后色泽不再加深 ，因此确定 2．5 mg／mL为最佳 IgG 包被浓度 。 2．6 试纸条特异性试验 用制备好的牛结核抗体检测试纸条分别检测牛 结核病阳性血清和阴性血清 、牛副结 核病 、牛布氏杆 菌病 、牛巴贝斯虫病、口蹄疫和牛传染性鼻气管炎病 阳性血清 ，结果显示 ，该试纸条与牛结核病 阳性血清 作用检测线出现明显的红色条带，而与牛结核病阴 性血清、牛副结核病、牛布鲁菌病、牛巴贝斯病、口蹄 疫和牛传染性鼻气管炎病阳性血清作用检测线未见 红色条带，说明该试纸条具有很好的特异性(图5)。 痧 维普资讯 http://www.cqvip.com 张书环等：牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立和应用 21 表 2 胶体金最适标记抗原 MPB83量的确定 Table 2 The deterruination of the optimal amount for MPB83 to make colloidal gold labeled MPB83 pH 6．0胶体金／mL 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Gold labeled pH 6．0 ‘ ‘ 0．1 mg／mL MP~ 3／ⅡL 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 MPB83含量／ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M P1383 content ‘ ddH2O 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 100 g／L NaCI／ L 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 2 h后结果 深蓝 浅蓝 浅红 浅红 红 红 红 红 红 红 Result after 2 h Mazarine Baby blue Carnation Carnation Red Red Red Red Red Red 1 0 0 100 100 深蓝 M azarine 质控线 Quality manage 1ine 检测线 Determine line 加样 区 Add sample area 2 3 4 5 6 1．牛结核病阳性血清I2．牛结核病阴性血清I3．牛副结核病阳性血清I4．牛布氏杆菌病阳性血清I 5．牛巴贝斯虫病阳性血清I6．口蹄疫阳性 血清I7．牛传染性鼻气管炎阳性血清 1．Positive cattle antiserum to M．bov／s l 2．Negative cattle antiserum to M bovi I 3-7．Positive antisera to M．paratuberculosis，Brucellasis． Babesia boris．Food-and-mouth disease virus，Infectious bovine rhinotracheitis virus．respectively． 图 5 试 纸条 特异 性交叉反应试 验 Fig．5 Analysis of cross-reaction of the strips 2．7 试纸条敏感性试验 研究的胶体金试纸条与韩国同类胶体金试纸条 同时检测 1份倍比稀释的牛结核病阳性血清。结果 显示，韩国试纸条的阳性血清最低检出稀释度为 1： 640，而研制的试纸条为 1：2 560，研制 的试纸条敏 感性较韩 国试纸条高 4倍或两个滴度 (图 6)。 2。8 与细菌培养的比较试验 采集 60份牛鼻拭子进行细菌培养，培养出具有 典型牛结核分支杆菌特征的有 8份，采集相应牛号 的牛血清，用研究的试纸条检测，检出 7头阳性，阳 性符合率为 87．5 (7／8)。鼻拭子细菌培养阴性有 52头，其中研究的室纸条检测为阴性的有 44头阳 性，阴性符合率为 84．62 9，6(44／52)，总符合率为 85 9／6(51／60)(表 3)。说明研制的试纸条与细菌培养 具有较高的符合率。 2．9 与 TST 比 较 试 验 将 301份临床牛血清样品用本研究制备的牛结 核病抗体快速检测试纸条检测，并与 TST方法进行 比较(表 3)，结果显示，TST阳性牛 45头，其中试纸 条检出31份，阳性符合率为 68．89 (31／45)。TST 阴性牛 256头 ，其中试纸条检测为阴性 牛 209头 ，阴 性符合率为 81．64 9／6(209／256)，总符合率为79．73 (240／301)。说明胶体金试纸条与 TST具有一定的 符合率。 2．10 与韩国进 口试纸条 比较试验 将 240份临床牛血清样品用本研究制备的牛结 核病抗体快速检测试纸条检测，并且与同类韩国试 纸条进行 比较(表 3)，结果显示 ，韩 国试纸条阳性牛 61头，其中研制的试纸条检测 60为阳性，阳性符合 率为98．36 9／5(60／61)。韩国试纸条阴性牛】79头， 。 。 猢。红 维普资讯 http://www.cqvip.com 22 动物医学进展 2007年 第 28卷 第 7期(总第 166期) 其 中本研究试纸条检测判断为 阴性 的有 177头 ，阴 性符合率为 98．88 (177／179)，总符合率为98．75 礤 奄 矾 蝰 筇墨 曼l 2 3 4 (237／240)。说 明本研究试 纸条与韩 国试纸条具有 较高的符合率 。 质控线 Quality manage 1ine 检测线 Delermine ljnc JJl1样区 Add sample area 质控线 Quality manage Iine 检测线 Determinc liHe l：20 l：40 ：：80 l：l60 i：320 ：：64 !：l 280 l：2 560 l：5 l20 1～9．牛结核病阳性血清从 1：2O始倍比稀释至 1：5 120 1-9．Represent serially diluted positive antisera tO M．boris from 1：2O tO 1；5 120 图 6 试 纸条 敏感性试 验 Fig．6 Sensitivity test of the strips 表 3 本研究试纸条与其他方法的比较 Table 3 Comparison results of the test strips and other methods _J JI】样区 Add san：pie arca 合计 Total 阳性 Psositive 阴性 Negative 阳性 Psositive 阴性 Negative 阳性 Psositive 阴性 Negative 3 讨论 牛分支杆菌是典型的胞内寄生菌，机体对其产 生的免疫 ，首先是细胞 免疫 ，其次才是 体液免疫，二 者是分离的[1 。因此，基于细胞免疫的 TST检测方 法 ，对感染后期 的开放性结核及全身性结核不敏感 ， 而此阶段正是结核患者传播疾病的危险时期。基于 体液免疫反应的抗体检测方法正好弥补了上述缺 陷。牛分支杆菌感染机体后，在繁殖过程中能分泌 多种抗原，诱导机体产生相应抗体，其抗体水平与疾 病的病程呈正相关L1 。因此，检测血清中IgG抗体 的水平对于疾病的诊断有重要意义。 业已证明，MPB83和 MPB70是牛分支杆菌主 要的特异性分泌抗原[7]。MPBT0是结核菌素的主 要成分之一，在感染期间不但刺激机体产生细胞免 疫反应，而且产生很强的迟发型超敏反应。在牛分 支杆菌中成熟的 MPB70蛋 白很稳定 ，是理想的检测 抗原Ll 。MPB83是一种菌体表面相关脂蛋 白，在体 内不仅引发细胞免疫 ，而且 引发体液免疫 ，具有免疫 原性 ，能诱导免疫保护反应[1 。MPB83抗体水平不 但和病理变化程度及 细菌负荷量成正 比，还是一种 早期分泌靶蛋白，可被疾病早期的人和动物免疫系 统识别，因而对 牛结核病的早期诊断具有重要意 一～钳～衙钳～一一 细 一一钳～衙钳～一一 维普资讯 http://www.cqvip.com 张书环等：牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立和应用 23 义[17-18]。牛分支杆菌人工感染试验证 明，MPB83和 MPBT0蛋 白的抗体是人工接 种后 牛体产生 的重要 抗体 ，在接种后 2周到 1个月期间产生L1 。 MPBT0和 MPB83蛋白是两个 同源性较高的蛋 白，其氨基酸序列具有 61 9／6的同源性 ，单克隆抗体也 证实二者具有共同抗原决定簇[8]。基于这两个蛋白 具有 高度的相似性 ，本 试验所 建立的检测 牛结核抗 体的免疫胶体金试纸条 ，应用 了这两个抗原蛋 白，可 以同时检测牛血清中针对 MPBT0和 MPB83抗原的 抗体 。研究结果显示 ，与 只检 测单 一抗原的抗体相 比，双抗原检测显著提高了检测的灵敏度。本试验 制备的试纸条敏感性较 只检测 MPB70抗原的韩 国 试纸条高 4倍 。交叉特异性试验显示该试纸条不与 牛副结核病 、牛布鲁菌病 、牛 巴贝斯虫病 、口蹄疫和 牛传染性鼻气 管炎病 阳性血清作用 ，具有很好 的特 异性。用制备的胶体金试纸条对 6O份临床血清进 行检测并与牛分支杆菌分离培养进行 比较 ，结果显 示二者的符合率较高(85 9／6)。用制备的试纸条检测 301份牛血清并与 TST进行比较，结果显示该试纸 条与TST具有一定的符合率(79．73 )，符合率不 高可能是由于二者检测机制不同所致，TST针对结 核菌诱导的细胞免疫，而本研究的试纸条针对细菌 诱导的体液免疫，而如前所述，结核菌诱导的这两种 免疫反应在某种程度上(疾病的较早期和疾病的较 晚期)是分离的，这就势必造成二者的符合率受到限 制。此外 ，TST可交叉检 出因环境分支杆 菌诱 导的 细胞免疫反应 ，所 以具有一定 的非 特异 性反应。对 240份临床血清样品进行检测并与韩国试纸条进行 比较，结果显示该试纸条与韩国试纸条的符合率为 98．75 9／6。试验表 明检测牛结 核抗体的免疫胶体金 试纸条不但具有廉价、简便、快速、特异、敏感等优 点，而且无需专门的仪器设备和技术人员，试纸条可 常温放置，便于运输和贮存。 综上所述，本试验建立了一种检测牛结核抗体 的免疫胶体金方法，该方法具有简便、快速、特异、敏 感等优点，可以对牛结核病进行普查和检疫，也可以 作为 TST的辅助诊断方法 ，具有 良好 的应用前景 。 参考文献： E1] 王忠仁．牛结核病与人结核病的相互关系[J]．中国防痨杂志， 2005。27(5)：123—125． [2] Gordejo R F J，Vermeersch J P．Towards eradication of bovine tuberculosis in the European Union[J]．Vet Microbiol，2006， I12(2-4)l101-109． [3] Domenech R．Human Mycobact"i“m bovi5 infection in the U— nited Kingdom ：Incidence，risks，control measures and review of the zoonotic aspects of bovine tuberculosis[J]．Tuberculosis (Edinb)，2006，86(2)；77-109． [4] 杨卫冲，焦新安．牛结核病诊断技术研究进展[J]．中国人畜共 患病杂志 ，2004，20(12)：1090—1093． [5] Rhodes S G，Widen D，Buddle B M，et a1．Antigen specificity in experimental bovine tubercul。Sis[J]．Infect Immun，2000，68 (5)：2573-2578． [6] Shiff C J，Premji z，Minjas J N．The rapid manual ParaSight—F test．A new diagnostic tool for Plasmodium falciparum infec— tion[J]．Trans Rsoc Trop Med Hyg，1993，87(6)：646—648． [7] Greenwald R，Esfandiari J，Lesellier S，et a1．Improved serode- tection of Mycobacterium bovAs infection in badgers 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Bang—fen ，WU Bo ，CAO—Sha ， CHEN Ying—yu ，TAN Ya-di ，CHEN Huan-chun ，GUO Ai—zhen ’。 (1．State Key Laboratory of Agricultural Microbiology．HuazhangAgriculture University·Wuhan，Hubei·430070，China； 2．College of Veterinary Medicine．Huazhong Agriculture University·Wuhan·Hubei·430070·China) Abstract：To develop a new method tO rapidly detect antibodies against Mycobacterium bovis for diagnosis of bovine tuberculosis(bTB)．Strips were prepared with the principle of colloidal gold immunochromatogra— phy assay (GICA)with the two recombinant Mycobacterium boris antigens MPB83 and M PB70． MPB83 was labeled by colloidal gold and MPB70 was used as the test capture reagent tO detect the corresponding antibodies．The highest sensitivity was found with strips prepared by 40 nm particles of colloidal gold．The optimal labeling pH of colloidal gold solution was 6．0．The best amount of M PB83 for colloidal gold label— ling was 6．5 g per m1．The optimal concentration of capture reagent MPB70 and control coating protein an— ti—MPB83 IgG was 3．0mg／mL and 2．5mg／mL，respectively．The strips did not react with positive sera of other unrelated bovine diseases and displayed high specificity．Comparison test showed that the strips had a higher sensitivity than a commercial M PB70 test strips from Korea．A batch of colloidal gold test strips were manufactured tO detect clinical samples，in parallel with culture of M ．bovis，tuberculin skin testing (TST)and test strips from Korea．The agreement ratios were 85 ，79．73 and 98．75 ，respectively，be— tween this strip with M ．bovis isolation，TST，and the Korea M PB70 strip．This novel colloidal gold test strip for bTB antibody detection is sensitive，specific，convenient tO be used，rapid to get results．It will be a good method in bTB survey used alone or as a supplementary diagnostic method for TST in bTB eradi— cation program． Key words：immunochromatography；Mycobacterium bovis；bovine tuberculosis；antibody detection { r 黼 豢豢 诺 精采 夺谱 欢迎订阅 2008年《动物医学进展》(月刊) 欢迎大家踊跃投稿! 《动物医学进展》原名为《国外兽医学一畜禽疾病》，1980年创刊，由教育部主管、西北农林科技大学主 办，为动物医学类学术性刊物，国内外公开发行，面向全国组稿。本刊坚持四项基本原则，贯彻“科技兴国，科 教兴农”、“科学技术工作必须面向经济建设”的方针。面向全国，服务于科研、教学和生产。读者对象为全国 农业、医学院校师生，科研人员，广大兽医工作者以及畜牧兽医行政管理人员。 《动物医学进展》主要报道 国内外动物 医学方面先进的理论与技术 ，基础与临床兼顾。以文献综述、研究 论文、专论与讲座及其临床资料等主要栏 目，报道基础兽医学、预防兽医学、临床兽医学等方面的最新进展和 科技成果。本刊已被多家数据库和文摘期刊收录，多次获省 、学会优秀期刊奖 。 《动物医学进展》为月刊 ，A4开本 ，120页 ，每期订价 1O．O0元，年 价 12O．O0元。全 国各地 邮局均可订 阅，邮发代号 52-60。如错过订期可直接向《动物医学进展》编辑部订阅，每册加收 1．O0元邮资。欢迎订阅! 本刊设有广告栏 目，收费合理，印刷精美，欢迎广大客户刊登畜禽品种、饲料、药品和书刊等广告。 地 址：陕西杨陵西北农林 邮 编：712100 E-mail：dyjzyilan@263．net dyj z@chinaj ourna1． 科技大学动物科技学院 net．cn 电 话(传真)：029—87092574 http || ．dyjzbjb com dyj z．chinaj ourna1．net．cn 维普资讯 http://www.cqvip.com