常规切片制备的注意事项

常规切片制备的注意事项 作者：未知 来源：生物秀 时间：2007-9-9 1111 .... 取材 取材的好坏，直接影响切片的质量。医生在取材时，首先要有一把锋利的取材刀，在切 割组织时要避免取材刀来回拖拉，切取的组织块厚薄要均匀，一般厚度以 0.2 ～0.3cm 为适， 较容易发脆的组织如甲状腺、肝脏、血块、淋巴结、大块癌组织等可适当厚一点，而脂肪组 织、肺组织、纤维性肿瘤、平滑肌瘤等致密的或试剂 不易渗入的组织应取薄一些；淋巴结 应修掉两侧球冠，并尽量剔除周围的脂肪组织。在取材中还应十分注意组织内是否有缝线或 骨组织，如碰到不可避免的钙化组 织，应与技术室讲明，在切取纤维组织、肌肉组织、胃 肠道时，应注意纤维及肌肉的走向，取材时尽可能按与纤维平行走向切取为佳。 2222 .... 固定 固 定是技术室工作的第一步，也是在整个制片过程中无法补救的一步。所谓“固定”，就是 组织离体后，用各种办法使其细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结 构和位置的过 程。固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败，防止了细胞内的酶对蛋白质的分解作用， 使细胞内的各和成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物或酶类转 变为不溶性物质，以保持原有 的结构与生活时相仿。另外，组织固定后，均呈一定的硬化状态，增加组织韧性，而且不易 变形，有利于以后的组织处理。所以组织一 旦离体必需及时固定，固定液的量应为组织的5 倍。固定的关键主要与固定的及时性、固定液的选择、固定液的浓度、固定的温度和时间有 关。最常用的固定液为 10％福尔马林。笔者认为，10％福尔马林由于受到福尔马林的质量、 使用时的挥发和取材时带入的水分影响，浓度被降低致组织固定不足，而高浓度的福尔 马 林，降低了对组织的穿透性，形成周围固定好而中央固定不到的现象。通过实践，本人 认为以酸性12～15％的福尔马林最佳。大标本（2cm 厚）一般需要 6～12个小时，小标本一 般需要3～6个小时；当室温低18℃时，可在37℃以下的温箱内加温4～6个小时。由于HE染 色最佳着色 PH为3.5～4.5, 中性福尔马林对苏木素染色有一定影响 ,细胞核容易发灰,核染色 质不佳。 所以, 尽管中性福尔马林对抗原有很好的保存作用，但酸性福尔马林对绝大多数抗原来说也 有很好的保存作用，所以在没有特别处理的情况下常规 HE用12～15％酸性 福尔马林也可 以（每100毫升12～15％福尔马林液内加5毫升冰醋酸）。骨髓、结缔组织固定以 Bouin液为 佳，经Bouin液固定后的组织必须流水冲 洗4小时以上。有条件的单位可根据不同选用 二种或二种以上的固定液；少数单位还可建立组织冷冻库，以便适应各种特殊的处理要求。 3.3.3.3. 水洗 固定后水洗（10～20分钟），通常被很多人所忽视，而水洗不彻底，容易造成脱片和染色 不鲜艳。对需做免疫组织化学的组织，更不应当忽视。福尔马林不利于组织块内抗原的保存 4444 .... 脱水和透明 所 谓脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来，以利于有机溶剂的渗入，这一过程称 为脱水。脱水是否彻底，直接关系到组织是否能充分透明，而脱水过度（原因 是组织在纯 酒精内时间过久，发生组织质地发生变化）容易造成组织发脆。造成组织发脆的原因还有加 温（温度超过35℃）、脱水剂内加有丙酮、浸蜡用的石蜡中 二甲苯过多等等。一般我们总认 为组织发脆跟高浓度酒精有关，而忽视了与低浓度的酒精关系，其实低浓度的酒精具有强大 的穿透力，比纯酒精更容易渗透到组织块 内部使之脱水，组织如果在低浓度酒精里充分脱 水，在高浓度酒精里只需脱去从低浓度到高浓度之间的水份，因此，仅需短时间就可完成， 如果这时不缩短纯酒精的 时间，便会引起组织发脆；如果脱水时加温，使用丙酮，还可引 起组织收缩，并影响免疫组织化学的标记。为了使石蜡浸入到组织块内，必须经过一种既能 与脱水剂 混合，又能与石蜡相溶的媒介物质，这个过程称透明。目前最好的透明剂是二甲 苯。很多人认为二甲苯极容易使组织发脆，这个观点很片面，在常温下，如果不是时 间过 长（超过24小时以上）二甲苯并不会引起组织过份发脆，相反会使某些组织结构比较质韧的 组织：比如子宫肌瘤等相当好切），但是当二甲苯温度超过35℃ 以后，极易引起组织发脆。 所以本人认为，大小标本最好分开脱水，一般情况下，大标本脱水时间（室温18℃）以80 ％酒精2小时、95％酒精（2道）各1个 半小时至2小时、纯酒精（3道）各1个半小时至2小时， 二甲苯（2道）各30-60分钟为宜；小标本脱水时间应相应缩短。脱水时间长短，与室温高低 有密切 的相关。我们在实践中发现，室温在12～15℃时，可作为一个临界温度范围。当室 温高于此温度范围时，组织容易脱水，可适当缩短脱水时间；而室温低于该温 度范围时， 应适当延长脱水时间（如能保证在一个恒定的温度下最佳）。更换试剂，应以量为基础，定 量更换，不能等到切片不好时再去更换。否则，至少会有 2～3批组织切片不好。根据我科 经验，如试剂用量为500ml，每500个蜡块更换一次为宜。 5.5.5.5. 浸蜡 组织透明后，在熔化的石蜡内浸渍的过程称为浸蜡。用其他浸透剂（如火棉胶、明胶等） 渗入组织内部的过程可称为浸透或透入。浸蜡温度过高（超过60℃），在 蜡内加入二甲苯蜡 或由于透明时带进的二甲苯过多，都会导致组织发硬，还会使组织内的抗原受到破坏；所以 作者主张浸蜡用的石蜡熔点在56℃（三道），第一 道：石蜡30分钟；第二道：石蜡90分钟； 第三道：石蜡，90分钟。浸蜡温度控制在56～58℃左右。（第一道也可用硬脂酸石蜡1：3混 合浸蜡，不仅可软 化组织，特别适用于比较韧、硬的组织，而且由于硬脂酸是弱酸性的， 对细胞核有媒染作用，核浆比鲜明，但容易脱片；同时对疏松组织容易散片）。有条件的可 以 每天打开第一道石蜡的盖子，让二甲苯挥发。浸蜡所用的石蜡如有杂质尽可能过滤，以 防附在组织上，造成切片刀刀口受损，或切片破碎和划痕增多。 6.6.6.6. 包埋 用包埋剂来支持组织的过程称包埋。最常用的是石蜡包埋法。包埋的关键一是平整，二 是方位。要求在包埋时，应采用镊子轻压组织块拱起部份，使之平贴于底部， 通常采用组 织的最大面包埋。囊壁、管腔组织应竖直包埋。小块多颗组织，应尽量放在一起，并保证在 一个平面上。修去两边的余蜡（所谓的两边，指切片时与切片 刀垂直的两侧）。包埋时还应 注意有无缝线，纸絮，如有一定要去除。胃黏膜活检标本，不能按一般的规律取最大包埋面， 应采取窄面竖起包埋。包埋的蜡更应过 滤，留有杂质的石蜡，容易造成污染或刀口受损。 蜡的熔点应在56～58℃之间选择，不提倡在冬天使用软蜡。因为用软蜡包埋的蜡块，到了夏 天，会粘在一起， 不利于资料的保存，而且即使在冬天，用硬蜡包埋的蜡块也比用软蜡包 埋的蜡块要好切。 7.7.7.7. 磨刀 要想切好一张切片，首先要有一把锋利的切片刀。磨刀是从事切片技术人员的一项最基 本技术，刀磨的好坏，直接关系到切片的质量。磨刀的手法各人不同，但都要 求用力均匀， 使刀口和磨刀石全面接触，两手的用力点应在刀口上，而不是在刀背上。切片刀应用一次磨 一次，每次仅需10～15分钟，过长时间的磨刀，容易把 已经磨出的锋刃磨掉，检查切片刀 是否锋利，用手试摸刀口的并不十分科学，不仅不能切片刀是否真正锋利，而且容 易损害刀口，最简单的办法是每次磨好 后拿一个蜡块试切一下。每次磨好刀后，应将磨刀 石用盖子盖好，以防灰尘掉在磨刀石上，用有灰的磨刀石磨刀，会使切片刀产生许多细小的 缺口。现在很多单位都 买了磨刀机，磨刀机用来开刀锋和磨缺口的确不错，但由于磨刀的 角度和时间不易精确掌握，故效果并不理想。根据我们的经验，真正的锋刃很难用机器磨出 来。一 次性刀片在很大程度上解决了这个问。如用一次性刀片，必须及时更换刀口。一 个刀口切小标本不应超过20～25只蜡块，切大标本不应超过10～15只蜡 块。 8.8.8.8. 切片 切片的第一步必需粗切。粗切的厚度大约在５0～100微米左右，质地较硬的组织或较小 的组织应再薄一些，粗切致组织全部暴露后，才进行细切。细切至组织块 面均匀一致， 无白点后，再把切的蜡片放入温水中。切片时要求用力均匀、柔和，摇速不易过快或过慢。 过快会导致切片厚薄不均，机器磨损；过慢会使切片增 厚。切片厚度一般 3～5微米。切片 的要求是完整、薄、均匀。切下的片膜其大小形状应与组织块一致，切片的不完整，常会将 重要病变遗漏，导致误诊、漏诊。在 切片放蜡块时，应注意组织包埋的方向，组织的层次， 纤维、肌肉等的走向应与切片刀平行，较难切的部分应放在上面，如皮肤的表皮，肿块的包 膜，胃肠道的浆膜 等，这样可以减少组织的断裂现象。操作切片机时应用力均匀，避免用 力过重。对脱钙组织、骨髓，以及已知的钙化组织，应选用固定的刀口，以减少其他部位出 现 缺口的可能性。在使用毛笔展片时要防止笔丝进入刀口，因为每切到一根笔丝，就会增 加一个缺口。切片厚度一般为 4～6微米，有人认为：只要切片机刻度标着几 个微米，切出 来的片子就是几个微米。其实不然，当切片刀不锋利，或切片时速度不匀，或切的较慢时， 切的片子都会变厚，只有在切片刀十分锋利、切片匀速的情 况下，才能真正保证其厚度。 下面是切片时碰到的问题的原因及可能处理的方法：(1)组织发脆：一般是脱水、透明、浸 蜡时间过长、温度过高，并与组织本身质 地也有关，在切片时，边切边用嘴向蜡片吹气， 可能会好些。(2)切片卷起，可能是刀不锋利，或刀锋在另一面，或刀角度过大，切片太厚 等等。(3)蜡片弯 曲：可能是刀锋不均，切片刀未磨直，切片刀与蜡块不平行。 (4) 透明、 浸蜡时间过长、温度过高，并与组织本身质地也有关(5)厚薄不均：可能是刀、刀座及蜡块 未夹紧，组织太硬，或切片机主轴太向前，或切片机已磨 损。(6)切片出现裂痕：可能是刀 有缺口，石蜡内有杂质，组织内有钙化、骨片或有线结, 也可能会有棉纸纤维等。(7)切片不 连片，切不下片，切片很厚，或者切片后蜡块发白，内陷：组织脱水不佳。补救办法：可先 将蜡块溶解，取出组织，放入加热 水浴的丙酮内（80℃）， 30～60分钟，再进行透明浸蜡 包埋切片，也许会好一点。 9.9.9.9. 展片与捞片 展片水温应在 42℃至 47℃之间，这主要和包埋蜡的熔点有关,水温过高，会引起组织细 胞散开，水温过低，切片皱摺无法摊平。包埋蜡中如有二甲苯，也会造成 石蜡溶解现象。 而用一次性刀片切的片子，一碰到热水，片子上的皱摺就无法再展开，这有二个方法可以解 决：第一、可以在切片时边切边向蜡片吹气，这样的片子 就会非常平整，放到热水里就会 自然展开，比较方便快捷，但这样的片子会略微厚一点；第二、在切完片子后，先把切片放 在 30%酒精水溶液中，让酒精的张力自 动把皱摺展开，然后再将切片移到热水，这样的片 子会较薄;如酒精浓度过高，容易引起切片破碎，出现裂隙，像脂肪之类细胞间粘附性较小 的组织一碰到酒精就会 散开，故不能用此法。最后捞片时玻片要干净，要选择那些完整、 无皱摺的切片，粘贴于玻片中 1/3和下 1/3的中间。 10.10.10.10. 烤片和脱蜡 烤片，一般在 60℃的温箱内烤片 0.5～1小时左右，温度过高，会引起切片细胞收缩；时 间太短(少于 20分钟)，容易造成脱片。脱蜡也相当重要，如果脱蜡 不干净，切片不易着色 或着色不匀，所以，脱蜡用的二甲苯要经常更换，一般用 3道二甲苯，每 500ml 液体，处 理 500张切片后更换一次为宜。当室温低于 18℃时，必须将切片从温箱拿出后立即放入二 甲苯中脱蜡，或将二甲苯放入温箱内预热（37℃左右）脱蜡，最高不得超过 60℃。然后经 高浓度的酒精到低浓度 的酒精洗去二甲苯，至水。 11.11.11.11. 染色 苏木素染色时间要根据染料的新旧、温度、切片的类 型而定，一般为 5－15分钟。经水略 洗后，用盐酸酒精分化，分化程度必须用显微镜控制。分化水洗后，可用温水或自来水蓝化， 并充分水洗（流水冲洗 5分钟以 上），以防盐酸残留导致切片褪色。我们不提倡使用碱性溶 液（释氨水、肥皂水等）促蓝，尽管蓝化效果很好，但从实践的结果来看，用碱性溶液促蓝 的切片不能长 期保存，容易褪色。最后入伊红复染（5－20 秒）。HE染色的关键在于深浅 适度，对比鲜明，一般有经验的，肉眼就能判断，但偶而也会出现失误，所以用显微 镜控 制是最保险的方法。其关键的步骤在于苏木素染好后的分化及蓝化过程，在蓝化结束后，应 在显微镜下观察细胞核着色是否合适，核结构是否清晰，胞浆内是否 有残留的苏木素等等。 染色理想的切片在显微镜下应是：细胞核与细胞浆应蓝红相映，鲜艳美丽；核浆对比明显， 核膜及核染色质颗粒清晰可见。 12.12.12.12. 脱水和封片 切 片脱水应从低浓度的酒精到高浓度的酒精，80%酒精 1道，95%酒精 2道，纯酒精 2道， （正丁醇 1道），二甲苯 2道。浓度低的酒精比浓度高的酒精更容易脱 水，但也容易使伊红 退色，故脱水时间可短一点，每道 3－5分钟，纯酒精每道 10分钟。为增加酒精与二甲苯的 相融性，可在二甲苯前面增加一道正丁醇；石碳酸 －二甲苯液也有此效，但用石碳酸时如 不洗净，可引起切片退色，不利于切片久存，故不作推荐。切片经二甲苯透明后，用中性树 胶封固。为增加切片的透明度，防 止细胞收缩、龟裂或切片出现黑色结晶样小点。所以我 们规定切片必须湿封，不得用温箱烤干或电吹风吹干后干燥封片。在南方冬春、霉雨季节， 封片时要防止口鼻 呼出的气体接触到切片；在天气较潮湿的日子里，不宜一次将多张切片 取出待封，以免切片“还潮”，形成透明不佳,出现云雾状水珠。脱水剂的更换也应有一定的 时 间规定。一般是每 500ml 液体，处理 500张切片后更换一次为宜。封片树胶不能过稀，封 片时树胶要均匀充满盖玻片且树胶不及外溢为佳。要将组织全部覆 盖，也不能有气泡。最 后，粘贴标签，标签必须贴于玻片左侧，编号书写清楚，最好能打印