大孔吸附树脂纯化女贞子中齐墩果酸和熊果酸的研究

大孔吸附树脂纯化女贞子中齐墩果酸和熊果酸的研究 姚　干, 何宗玉, 闫光凡, 梁亦龙, 谢婷婷, 陶　建Ξ (重庆邮电大学生物信息学院, 重庆 400065) 摘　要: 目的　研究大孔吸附树脂纯化女贞子中齐墩果酸和熊果酸的动态吸附与解吸工艺, 为工业化生产提供参 考。　采用高效液相色谱法测定齐墩果酸和熊果酸的量; 运用静态吸附与解吸试验对树脂型号进行筛选, 结合 单因素试验优选女贞子齐墩果酸和熊果酸的纯化操作条件。结果　H PD 2100 树脂对齐墩果酸和熊果酸的吸附与解 吸性能较好; 吸附的优化条件为树脂床径高比1∶6, 料液质量浓度0120 g (生药) ömL , 体积流量2 BV öh 和吸附容量 214 mL ög (树脂) ; 最佳解吸条件为乙醇体积分数80% , 体积流量2 BV öh 和溶剂用量4 BV ; 产品中齐墩果酸、熊果酸 的质量分数分别为25121%、15165% , 转移率分别达98164%、98158%。结论　H PD 2100 可有效地富集、纯化女贞子 中齐墩果酸和熊果酸。 关键词: 女贞子; 齐墩果酸; 熊果酸; 大孔吸附树脂 中图分类号: R 28412; R 286102　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253- 2670(2007) 10- 1498- 04 Pur if ica t ion of a leanol ic ac id and ursol ic ac id from F ructus L igus tr i L ucid i by macroporous res in s YAO Gan, H E Zong2yu, YAN Guang2fan, L IAN G Y i2long, X IE T ing2t ing, TAO J ian (Co llege of B io info rm ation, Chongqing U n iversity of Po sts and T elecomm un icat ions, Chongqing 400065, Ch ina) Key words: F ructus L ig ustri L ucid i; a leano lic acid; u rso lic acid; m acropo rou s resin 　　女贞子系木犀科植物女贞L ig ustrum lucid um A it1 的干燥成熟果实, 为常用的补益肝肾中药, 齐 墩果酸和熊果酸是其主要有效成分。以往女贞子皂 苷类成分的提取纯化工艺研究仅以单一成分齐墩果 酸作为定量指标[ 1 ]。本实验采用高效液相色谱法同 时测定齐墩果酸和熊果酸[ 2 ] , 以二者的比吸附量或 解吸率之和作为评价指标[ 3 ] , 优选大孔吸附树脂纯 化 女 贞 子 中 齐 墩 果 酸 和 熊 果 酸 的 工 艺 条 件。　　　　　　　　　　　　　　　 1　仪器与材料 W aters 1525 型高效液相色谱仪; A G285 分析 天平 (瑞士M ett ler To ledo) ; SHQ T—8 自动液相色 谱分离色谱仪 (上海) ; R 502—B 旋转蒸发仪; ZPD— 150 型振荡培养器; L —550 型台式低速大容量离心 机; KQ —3200B 超声波清洗器。FL 21、FL 22、SA 21 大孔吸附树脂, 天津欧瑞生物科技有限公司; AD S2 7、AD S28 大孔吸附树脂, 天津南开和成科技有限公 司; H PD 2100、H PD 2450、H PD 2600 大孔吸附树脂, 沧州宝恩化工有限公司。甲醇为H PL C 色谱纯, 其余 试剂均为市售分析纯。齐墩果酸 (批号 1107092 200304)和熊果酸对照品 (批号1107422200304)均购 自中国药品生物制品检定所。女贞子购自重庆康济医药有限公司, 由重庆邮电大学生物信息学院闫光凡副教授鉴定为木犀科植物女贞L 1lucid um A it1 的干燥成熟果实。2　方法与结果211　齐墩果酸和熊果酸的H PL C 法测定21111　色谱条件: K rom asil C 18色谱柱 (250 mm ×416 mm , 5 Λm ) ; 流动相: 乙腈2甲醇2水2乙酸胺(70∶1615∶1315∶015) ; 体积流量: 1 mL öm in; 检测波长: 215 nm ; 进样量: 10 ΛL。21112　标准曲线的绘制: 精密吸取齐墩果酸和熊果酸混合对照品甲醇溶液 (质量浓度均为 1 m gömL )014、018、112、116、210 mL , 定容至5mL , 进行H PL C分析。以质量浓度为横坐标, 峰面积为纵坐标, 绘制标准曲线, 得回归方程。齐墩果酸Y = 4 387191 X -22109, r = 01999 94, 线性范围: 0108～ 0140 m gömL ; 熊果酸Y = 2 964138 X - 20184, r= 01999 91,线性范围: 0108～ 0140 m gömL。212　吸附原液的制备: 采用H PL C 法测得女贞子药材中齐墩果酸和熊果酸的质量分数分别为 01765%、01475%。取女贞子药材适量, 粉碎成20 目, 加8 倍量 ·8941· 中草药　Ch inese Trad itiona l and Herba l D rugs　第38 卷第10 期 2007 年 10 月 Ξ 收稿日期: 2007201211 基金项目: 重庆邮电大学博士启动基金 (2005A 251) ; 重庆市自然科学基金资助项目 (CSTC2006BB5429) 作者简介: 姚　干 (1970—) , 男, 四川阆中人, 副研究员, 博士, 主要从事中药药效物质基础、作用机制及中药新药研究。 T el: (023) 62471286　E2m ail: cdyaogan@ sina1com © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 80% 乙醇回流提取3 次, 每次 115 h, 合并提取液, 回 收乙醇, 剩余物用蒸馏水充分溶解, 离心, 取上清液作 为吸附原液 (质量浓度以生药计为014 gömL )。以下 各项试验根据具体情况调整药液质量浓度。 213　大孔吸附树脂型号的选择 21311　静态吸附性能比较: 根据齐墩果酸和熊果酸的 理化性质和树脂的吸附性能, 选用FL 21、FL 22、SA 21、 AD S27、AD S28、H PD 2100、H PD 2450、H PD 26008 种 型号树脂进行试验。临用前, 取不能过65 目药典筛的 树脂, 按说明书方法预处理后使用。精确称取树脂5 g, 置100 mL 碘量瓶中, 加入质量浓度为012 gömL 药液 50 mL , 120 röm in 振摇(30 ℃) , 每隔1 h 从上清液中 取样, 进行H PL C 法分析, 计算比吸附量[比吸附量= (吸附前药液质量浓度- 吸附后药液质量浓度) ×药液 体积ö大孔吸附树脂质量]。以比吸附量为纵坐标, 时间 为横坐标, 绘制静态吸附曲线。从图1 可以看出, 在前3 h 内, 树脂吸附速率随时间的延长而快速升高, 而后渐 趋饱和, 5 h 后基本达到吸附平衡。在静态吸附饱和状 态下, H PD 2100 的比吸附量最大, SA 21、AD S27 次之, 均明显高于其他5 种树脂。 töh 图 1　静态吸附曲线 F ig11　Sta tic adsorption curve 21312　静态解吸性能比较: 将已吸附了齐墩果酸和 熊果酸的SA 21、AD S27 和H PD 2100 树脂滤过, 除去 水液, 置碘量瓶中, 加入 60% 乙醇 50 mL , 120 röm in 振摇 (30 ℃) , 每隔1 h 从上清液中取样, 进行H PL C 法分析, 计算解吸率[解吸率= (洗脱液质量浓度× 洗脱液总体积) ö吸附总量×100% ]。以解吸率为纵 坐标, 时间为横坐标, 绘制静态解吸曲线。由图 2 可 知, 60% 乙醇均可不同程度地将齐墩果酸和熊果酸 从3 种树脂上解吸下来。其中, H PD 2100 的解吸率最 大, 解吸能力最强, 优于其余2 种树脂。 　　综合比吸附量和解吸率两项指标, 选用H PD 2 100 富集、纯化女贞子中齐墩果酸和熊果酸。 214　H PD 2100 吸附女贞子中齐墩果酸和熊果酸的 影响因素研究: 将适量H PD 2100 湿法装柱 (柱规格: töh 图 2　静态解吸曲线 F ig12　Sta tic desorption curve 50 cm ×2 cm ) , 取300 mL 药液按径高比、质量浓度、 体积流量和pH 值的不同水平进行动态吸附, 吸附 完毕后, 加 2 BV 蒸馏水洗脱, 收集流出液, 进行 H PL C 法分析, 计算比吸附量。 21411　径高比对吸附效果的影响: 固定质量浓度 012 gömL、体积流量2 BV öh, 考察树脂床径高比为1 ∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9 的比吸附 量。从图3 可以发现, H PD 2100 富集齐墩果酸和熊果 酸的能力随径高比的降低而提高。当径高比为1∶6 时, 比吸附量达到最大, 此后随着径高比的降低, 比吸 附量逐渐下降。原因可能是随着径高比的降低, 药液 流动的阻力增加, 影响了齐墩果酸和熊果酸在树脂床 内部的扩散, 故径高比宜控制在1∶6 左右。 径高比 图 3　径高比与比吸附量的关系 F ig13　Rela tion sh ip between ra tio of he ight v ia d iam e- ter and com parative mass of adsorption 21412　质量浓度对吸附效果的影响: 固定体积流量 2 BV öh、径高比 1∶6, 考察药液质量浓度为 0108、 0112、0116、0120、0124、0128、0132 gömL 的比吸附 量。从图4 可以看出, H PD 2100 富集齐墩果酸和熊果 酸的能力随着质量浓度的增加而提高。当质量浓度 为0120 gömL 时, 比吸附量达到最大, 此后随着质量 浓度的增加, 比吸附量逐渐下降。原因可能是随着质 量浓度的增加, 与齐墩果酸和熊果酸竞争吸附 的杂质量也随之增加, 比吸附量相应减少, 故质量浓 ·9941·中草药　Ch inese Trad itiona l and Herba l D rugs　第38 卷第10 期 2007 年 10 月 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 质量浓度ö(m g·mL - 1) 图 4　齐墩果酸和熊果酸的质量浓度与比吸附量的关系 F ig14　Rela tion sh ip between concen tra tion of oleanol ic ac id and ursol ic ac id and com parative mass of adsorption 度宜控制在0120 gömL 左右。 21413　体积流量对吸附效果的影响: 固定质量浓度 0120 gömL、径高比1∶6, 考察体积流量为1、115、2、 215、3、315、4 BV öh 7 个水平的比吸附量。由图5 可 知, H PD 2100 富集齐墩果酸和熊果酸的能力随体积 流量的增加而降低。原因可能是如果体积流量过大, 一部分齐墩果酸和熊果酸来不及被树脂吸附便流出 树脂床。当体积流量为2 BV öh 时, 齐墩果酸和熊果 酸的比吸附量较大, 低于该值时, 比吸附量未见明显 增加。虽然较低的体积流量对吸附有利, 但会延长操 作周期, 对生产不利, 故体积流量宜控制在 2 BV öh 左右。 体积流量ö(BV ·h - 1) 图 5　体积流量与比吸附量的关系 F ig15　Rela tion sh ip between eluen t volum e and com parative mass of adsorption 21414　pH 值对吸附效果的影响: 固定质量浓度 0120 gömL、树脂床径高比 1∶6 和体积流量 2 BV ö h, 考察pH 值为 3131、4133、5132、6135、7134、8136 的比吸附量。从图6 可以看出, H PD 2100 富集齐墩果 酸和熊果酸的能力随着pH 值的增加而提高。当pH 值为6135 时, 比吸附量达到最大, 此后随着pH 值的 增加, 齐墩果酸和熊果酸的比吸附量逐渐下降, 故药 液pH 值宜控制在6135 左右。 pH 值 图 6　pH 与比吸附量的关系 F ig16　Rela tion sh ip between pH va lue and com parative mass of adsorption 　　根据上述各项单因素实验结果, 确定H PD 2100 吸附女贞子中齐墩果酸和熊果酸的优化条件为: 径 高比1∶6、质量浓度0120 gömL、pH 6135、体积流量 2 BV öh。按该条件进行3 次重复性试验, 结果齐墩果 酸、熊果酸的比吸附量分别为 3175 m gög (R SD 为 0177% )、2133 m gög (R SD 为0165% )。 215　吸附容量的考察: 按上述优化条件, 取300 mL 药液加入树脂床 (含50 g H PD 2100 树脂)中, 收集30 份流出液 (5 mL ö份) , 进行H PL C 法分析, 分别计算 流出液中齐墩果酸和熊果酸的质量浓度 (C )。以洗 脱体积为横坐标, 齐墩果酸和熊果酸之和的C öC 0 为 纵坐标, 绘制吸附泄漏曲线。图7 表明, 流份25 中齐 墩果酸和熊果酸的之和C öC 0 为流份 24 的 8151 倍, 明显表现出泄漏现象, 按每段流份 5 mL 计算, 总上 样体积为120 mL , 即1 g H PD 2100 的最佳吸附容量 为214 mL , 相当于016 g 生药。 洗脱体积öBV 图 7　吸附泄漏曲线 F ig17　Adsorption- leakage curve 216　洗脱液乙醇体积分数的考察: 按上述优化条 件, 将 120 mL 药液加入树脂床中, 吸附完毕后, 依 次用 0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、 80%、90% 乙醇进行洗脱 (体积流量 2 BV öh) , 溶媒 用量以相应的终点洗脱液颜色变浅 (在 560 nm 处 无紫外吸收) 为度。分别收集洗脱液, 进行H PL C 法 ·0051· 中草药　Ch inese Trad itiona l and Herba l D rugs　第38 卷第10 期 2007 年 10 月 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 分析, 计算齐墩果酸和熊果酸的累积解吸量。从图8 可以看出, 齐墩果酸和熊果酸主要集中在 30%～ 80% 乙醇洗脱液中, 蒸馏水和 90% 乙醇洗脱液中很 少。因此确定洗脱工艺为上样后先以蒸馏水2 BV 洗 脱杂质后, 继以 80% 乙醇洗脱树脂床中的齐墩果酸 和熊果酸。 乙醇体积分数ö% 图 8　乙醇体积分数对齐墩果酸和熊果酸解吸效果影响 F ig18　Eluting eff ic iency of d ifferen t concen tra tion of ethanol to oleanol ic ac id and ursol ic ac id 217　解吸曲线的绘制: 按上述优化条件, 将120 mL 药液加入树脂床中, 吸附完毕后, 先用 2 BV 蒸馏水 洗脱, 继以 80% 乙醇进行洗脱, 收集 30 份乙醇洗脱 液 (10 mL ö份) , 进行H PL C 法分析, 计算洗脱液质 量浓度。以洗脱体积为横坐标, 质量浓度为纵坐标, 绘制解吸曲线。图9 表明, 流份21 的质量浓度为流份 20 的1ö30 倍, 表明此时树脂床中的齐墩果酸和熊果 酸基本解吸完全。按每段流份10 mL 计算, 溶媒用量 为200 mL , 相当于4 倍树脂床容积。提示解吸溶媒最 佳用量为4 BV。 洗脱体积öBV 图 9　乙醇用量对齐墩果酸和熊果酸解吸效果的影响 F ig19　Effect of elco ia l volum e on oleanol ic ac id and ursol ic ac idon 218　精制度、保留率考察: 取药液 2 份 (120 mL ö 份) , 1 份按上述优化条件进行试验, 将洗脱液和另 1 份药液减压浓缩、真空干燥, 制备干浸膏, 称重, 进行 H PL C 法分析, 计算精制度[精制度= 处理前干膏收 率ö处理后干膏收率×100% ]和保留率[保留率= 处 理后总量ö处理前总量×100% ]。采用相同方法进行 3 次重复试验。结果, 过柱前、后干膏平均收率分别 为 13160% ( R SD 为 0188% )、2144% ( R SD 为 0182% ) , 平均精制度为5157 (R SD 为0172% ) ; 齐墩 果酸、熊果酸过柱前质量分数分别为 4159% (R SD 为1131% )、2185% (R SD 为1105% ) , 过柱后分别为 25121% ( R SD 为 1131% )、 15165% ( R SD 为 1128% ) ; 其平均回收率分别为 98164% (R SD 为 0155% )、98158% (R SD 为0159% )。 3　讨论 　　不同产地来源的女贞子药材中, 皂苷类有效成 分以齐墩果酸为主, 但熊果酸也占 1ö5 以上[ 4 ]。因 此, 对女贞子进行质量评价时, 有必要将齐墩果酸与 熊果酸分离测定, 工艺研究也应同时兼顾两种成分。 女贞子皂苷类有效成分的定量控制在《中国药 典》采用薄层扫描法, 规定了齐墩果酸的下限, 但操 作繁琐, 精密度和重现性较差。齐墩果酸和熊果酸的 结构与性质类似, 在H PL C 法检测时, 若以甲醇2水 为流动相, 齐墩果酸和熊果酸分离度仅为 111, 分离 效果不理想, 一般需分别测定, 工作量和试验误差均 会增加。实验以乙腈2甲醇2水2乙酸胺 (70∶1615∶ 1315∶015)作为流动相[ 5 ] , 图谱基线平稳, 分离度大 于 115, 二成分基线分离, 操作简化、方法可靠, 定量 准确、快速。 关于女贞子皂苷类有效成分的制备, 目前国内 主要有 3 种生产工艺[ 5 ]: 醇提2酸水解法、醇提2酸碱 反复处理法和醇提2酸碱处理法, 存在或收率不高、 或耗时较长、或操作复杂等缺点, 而且仅以齐墩果酸 作为评价的指标成分。这样, 女贞子中的另一有效成 分熊果酸就有可能提取不充分, 造成资源浪费, 故有 必要在工艺中同时考虑熊果酸的收率及质量分数。 References: [ 1 ]　Sh i L F, Yuan Y F, Yuan H J1 TL C Studies on the active constituen ts of F ructus L ig ustri L ucid i and derivatives of the constituen ts [J ]1 P harm Care R es (药学服务与研究) , 2006, 1 (6) : 482501 [ 2 ]　Sh i X H , Guo D N , D i D H 1 D eterm ination of o leano lic acid and urso lic acid in the fru its of L ig ustrum lucid um A it. by H PL C [J ]1 S tra it P harm J (海峡药学) , 2005, 17 (4) : 412 431 [ 3 ]　Yao G, H e Z Y, Fang J N 1 Purification of to tal irido id glyco2 sides and genipo side in Gard en ia jasm inoid es w ith H PD 450 m acropo rous resin [J ]1 Ch in T rad it H erb D rug s (中草药) , 2006, 37 (1) : 572611 [ 4 ]　Zhou J , L iu Y S1 D eterm ination of conten t of o leano lic acid and urso lic acid in F ructus L ig ustri L ucid i by gas ch rom atog2 raphy [J ]1 Ch in J N ew D rug s C lin R em (中国新药与临床杂 志) , 2003, 22 (10) : 59625981 [ 5 ]　L ian G X, L iu Y F, L i Y1 D raw of effective constituen t2 o leano lic acid in L ig ustrum lucid um [J ]1 J Q iqihar U niv (齐 齐哈尔大学学报) , 2005, 21 (4) : 242251 ·1051·中草药　Ch inese Trad itiona l and Herba l D rugs　第38 卷第10 期 2007 年 10 月 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. 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