八角莲中鬼臼毒素分离纯化与含量测定

物质16-82。在今后的研究中,有必要采用 HPLC等分 析手段,对余甘叶所含酮类、苷类等生物活性物质作 进一步研究。 参 考 文 献 [ 1] 中国植物志编委会 1中国植物志 [M ] 1 第四十四卷 1 第二分册 1 北京:科学出版社, 1996: 87-891 [ 2] 李宗友 1余甘子叶提取物的抗炎作用 [ J] 1 国外医学# 中医中药分册, 1998, 20( 4): 521 [ 3] 钟振国,曾春兰 1 余甘子叶提取物对慢性支气管炎并 肺气肿大鼠的保护作用研究 [ J] 1 时珍国医国药, 2008, 19( 4) : 863-8661 [ 4] 钟振国, 曾春兰 1 余甘子叶提取物体外抗菌实验研究 [ J] 1 中药材, 2008, 31( 3): 428-4311 [ 5] 赵谋明, 刘晓丽, 崔春 ,等 1 超临界 CO2萃取余甘子精 油成分及精油抑菌活性 [ J] 1 华南理工大学学报 (自然 科学版 ), 2005, 35( 12): 116-1201 [ 6] 周晓星, 植物甾醇降胆固醇作用的研究现状 [ J] 1 国外 医学# 卫生学分册 , 2007, 34( 2) : 101-1051 [ 7] 王欣, 王枫 1植物固醇的研究新进展 [ J] 1 国外医学# 卫生学分册, 2007, 34( 2) : 98-1011 [ 8] 朱斌, 叶铁虎,华宝来 1 抗凝药物和抗血小板药物与硬 膜外麻醉 [ J] 1 中华麻醉学杂志, 2006, 26( 3): 285-2871 八角莲中鬼臼毒素分离纯化与含量测定 杨光义 1, 2,林 励 1, 陈吉炎2,安志斌 2,陈 黎 2 ( 11广州中医药大学中药学院,广东 广州 510006; 21郧阳医学院附属太和医院,湖北 十堰 442000) 摘要 目的: 探讨八角莲根茎中鬼臼毒素分离纯化。方法: 采用综合提取法用 95%乙醇依次超声、浸渍、 回流提取, 滤液用氯仿萃取,用苯-乙醇混合液 ( 1B1 )重结晶得到鬼臼毒素单体; 采用 HPLC法, 以鬼臼毒素为指标 追踪考察各工艺提取效果。色谱条件:流动相为甲醇-01 1 m oL /L磷酸二氢钾水溶液 ( 50B50), 检测波长: 290 nm,柱 温: 30e ,流速: 11 0 mL /m in。结果:自制鬼臼毒素纯度为 9518% , 产率为 0186%。结论: 本方法工艺简单,适于工业 化生产推广。 关键词 八角莲; 鬼臼毒素; 分离纯化;含量测定 中图分类号: R28411 文献标识码: A 文章编号: 1001-4454( 2009) 05-0723-02 收稿日期: 2008-09-28作者简介:杨光义 ( 1975-) ,男,讲师,主管药师,在读博士研究生,研究方向:中药资源开发和新药研究; Te:l 13971908298, E-m ai:l ygy996@ 163. com。 八角莲为小檗科植物八角莲 Dysosma versip ellis (H ance1 ) M 1 Cheng的干燥根茎, 是鬼臼类中药中 较为常用的一种具有显著生物活性的有毒中药,具 有祛风除湿、活血止痛、镇咳平喘等功效。鬼臼毒素 为其主要活性成分,属芳基四氢萘木脂素化合物,具 有抗肿瘤、抗病毒活性 112。 015% 鬼臼毒素酊剂是 WHO推荐治疗尖锐湿疣最有效的一线药物 122。近 年来以其为母核,经结构改造出多种广谱抗癌药,如 VP 16、VM 26等化合物, 对细胞肺癌、白细胞癌等有 显著疗效132。本文在不使用柱层析法的情况下,探 讨只通过系统溶剂化学分离法从八角莲根茎中分离 纯化鬼臼毒素的工艺。 1 仪器与 111 仪器 U ltMi ate 3000型高效液相色谱仪, 包 括四元梯度泵、自动进样器、紫外检测器; Chrome- leon软件数据处理系统; D iamonsilTM C18色谱柱 ( 416mm @ 250 mm, 5 Lm ); RE-52A旋转蒸发仪 (上 海亚荣生化仪器厂 )。 112 材料 鬼臼毒素对照品 (购自中国药品生物 制品检定所, 批号: 111645-200301); 八角莲药材样 品由郧阳医学院附属太和医院武当中药研究所陈吉 炎教授提供并鉴定为小檗科植物八角莲 Dysosma versip ellis(H ance1) M1 Cheng的干燥根茎。甲醇 (色 谱纯 )、95%乙醇、氯仿 (分析纯 )。 2 方法与结果 211 鬼臼毒素的提取分离和纯化 取八角莲根茎 50 g, 粉碎过 2号筛, 置 1 000 mL圆底烧瓶中,加入 95%乙醇 400 mL, 超声提取 2次,每次 30 m in,浸渍 12 h,过滤,药渣加 95%乙醇 400 mL,加热回流 2 h, 倾出上清液,药渣同法重复回流提取 2次,每次 1 h, 合并 4次滤液, 减压浓缩, 得醇制浸膏; 取浸膏, 加 50mL水研溶,减压抽滤得黄棕色树脂状粗提物; 取 粗提物常温干燥, 用 40mL氯仿超声研溶 3次,减压 抽滤得氯仿溶解部分,取氯仿不溶解部分重复上述 #723#Journa l o f Ch ineseM ed icina lM a teria ls 第 32卷第 5期 2009年 5月 超声研溶操作 2次,合并氯仿溶解部分滤液,蒸干, 残渣溶于苯、95%乙醇混合液 ( 1B1)中,放置析出结 晶。滤集晶体加 15 mL无水乙醇温热, 将不溶物滤 过,乙醇溶液减压蒸干,残渣同法重结晶 6次, 得白 色针晶, 60e 干燥 12 h,称重,即得。 212 样品的制备 21211 对照品溶液的制备: 精密称取在五氧化二 磷干燥器中减压干燥 12h的鬼臼毒素对照品 2515 mg,置 50 mL容量瓶中, 用甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 备用。 21212 供试品溶液的制备 :提取分离各工艺过程 供试品溶液的制备: 取综合提取后药渣, 加甲醇适 量,超声 30 m in, 过滤,浓缩定容于 50mL量瓶中,备 用;醇提取液、氯仿萃取液和水洗涤液挥干溶剂后, 甲醇溶解,定容于 50mL量瓶中,备用。 自制鬼臼毒素溶液的制备: 精密称取自制鬼臼 毒素晶体按 / 212110项下对照品溶液的配制方法同 法处理,备用。 213 含量测定142 21311 色谱条件: 色谱柱: D iamonsilTM C18柱 ( 250 mm @ 416mm, 5 Lm ); 流动相:甲醇-011moL /L磷酸 二氢钾水溶液 ( 50B50); 流速: 110 mL /m in;检测波 长: 290 nm;柱温: 30e 。 21312 线性关系考察: 精密量取上述对照品溶液 溶液 110、210、310、410、510mL, 分别置 10 mL容量 瓶中, 加甲醇稀释至刻度,摇匀,按上述色谱条件测 定峰面积, 以峰面积 Y为纵坐标, 鬼臼毒素含量 X 为横坐标, 绘制标准曲线, 得回归方程为: Y = 0101108X + 516752, r= 019996。结果表明, 鬼臼毒 素进样量在 0104769 ~ 014769mg /mL范围内, 浓度 与峰面积呈良好的线性关系。 21313 精密度试验: 精密吸取自制鬼臼毒素对照 品溶液 10 LL, 重复进样 5次, RSD为 0124% , 表明 仪器的精密度良好。 21314 稳定性试验:取自制鬼臼毒素供试品溶液, 分别于配制后 0、2、5、8、12 h进样, RSD为 0184% ( n = 5) , 表明样品供试品溶液在 12h内稳定性良 好。 21315 加样回收率试验: 精密称取已测含量的药 材制成供试品溶液,以加入法进行实验,结果其平均 回收率为 99194%, RSD = 1171%, 说明该测定方法 可行。结果见表 1。 21316 样品测定: 分别精密量取对照品溶液及供 试品溶液 10 LL进样,以外标一点法计算含量。结 果见表 2。 表 1 鬼臼毒素加样回收率试验结果 (n= 5 ) 药材中含量 /m g 加入量/m g 测得量/m g 回收率/% 平均回收率 /% RSD/% 21 4209 21 3843 41 7931 99149 21 4179 21 3843 41 7707 98168 21 4128 21 3843 41 8224 101106 991 94 1171 21 4148 21 3843 41 7555 98117 21 4229 21 3843 41 8618 102129 表 2 HPLC法追踪测定提取各工 艺过程鬼臼毒素的产率 样品 鬼臼毒素质量/mg 占理论产量的百分比 /% 药渣 6183 0167 醇提取液 1014100 99133 氯仿萃取液 6164 0165 水洗涤液 41134 4105 鬼臼毒素晶体 406100 40110 注: 理论产量 =药渣中鬼臼毒素质量 +醇提取液中鬼臼毒素质量 3 讨论 311 本实验比较了超声、浸渍、回流提取法和综合 提取法 (依次采用前 3种方法 )的提取效果,发现综 合提取法可使药渣中鬼臼毒素的残存率降为 0167% ,是产率和纯度得以提高的重要基础; 水洗涤 树脂状粗提物工艺过程鬼臼毒素的损失占理论产量 的比例较大,多次重复优化发现: 洗涤水的用量为树 脂状粗提物重量的 3 ~ 5倍时损失最低 (本实验可 降至 4112% );用氯仿研溶树脂状粗提物是提高鬼 臼毒素产率的关键步骤,采用超声法助溶,可使氯仿 残渣中鬼臼毒素损失率降为 0165%。 312 本实验用 HPLC法追踪测定提取药渣、氯仿 萃取液、水洗涤液各工艺过程鬼臼毒素的损失率,经 过多次实验不断改进和完善, 自制鬼臼毒素纯度为 9518% ,产率为 0186%,产率和纯度均有较大提高, 其纯度基本可满足化学对照品的。该工艺与索 氏提取相比,工业化程度较高,适用于批量生产。 参 考 文 献 [ 1] 尚明英, 郑国钧,徐珞珊, 等 1 H PLC法测定鬼臼类生药 中鬼臼木脂素的含量 [ J]1中国药科大学学报, 1996, 27 ( 4): 219-2221 [ 2] 张三全,曾抗, 李国峰,等 1动物实验对脂质体鬼臼毒素 外用的安全性观察 [ J] 1 临床皮肤科杂志, 2003, 32( 4): 188-1901 [ 3] 刘长军,侯嵩注 1抗癌活性物质鬼臼类木脂素的研究进 展 [ J] 1天然产物研究与开发, 1997, 5( 3): 81-871 [ 4] 陈黎, 涂自良,陈吉炎, 等 1高效液相色谱法测定八角莲 中鬼臼毒素的含量 [ J] 1 时珍国医国药, 2007, 18( 9 ): 2208-22091 #724# Journa l o f Ch ineseM ed icina lM a teria ls 第 32卷第 5期 2009年 5月