新型内毒素特异吸附血液净化材料的制备与性能研究

第３０卷　第３期 ２０１３年　６月 生物医学工程学杂志 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．３０　Ｎｏ．３ Ｊｕｎｅ　２０１３ 新型内毒素特异吸附血液净化材料的 制备与性能研究＊ 王菲菲　王　翔△　熊延连　许　培　靳欣欣　唐金龙　毛金春 （重庆大学 生物工程学院 生物流变科学与技术教育部重点实验室，重庆４０００４４） 摘　要：本研究目的是制备一种带有肝素（ｈｅｐａｒｉｎ）分子臂和多黏菌素Ｂ（ＰＭＢ）配基的用于清除内毒素的血液净化 吸附材料，探讨其在内毒素血症治疗方面的潜在应用价值。首先采用氯甲基树脂（ＰＳ）为载体，经乙二胺活化后引 入肝素分子臂，戊二醛将ＰＭＢ配基固定于吸附剂；荧光标记内毒素（ＦＩＴＣ－ＬＰＳ）体外静态吸附实验直接观察材料吸 附性能，内毒素体外静态吸附实验测定其吸附量和吸附率，并对吸附剂血液相容性进行了评价。结果表明，吸附剂 在２ｈ左右能够达到吸附平衡，对脂多糖（ＬＰＳ）的去除率能够达到７０％以上，对血细胞和血浆蛋白的吸附率分别小 于１０％和２０％。吸附剂对于ＬＰＳ具有高选择性及高吸附量，并具有良好的生物相容性，在内毒素血症治疗方面具 有一定的临床应用前景。 关键词：内毒素；血液净化；氯甲基树脂；肝素；多黏菌素Ｂ 中图分类号　Ｒ３１８．０８　　文献标志码　Ａ　　文章编号　１００１－５５１５（２０１３）０３－０６３５－０６ ＤＯＩ：１０．７５０７／１００１－５５１５．２０１３０１１９ Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｒｏｐｅｒｔｙ　ｏｆ　ａ　Ｎｅｗ　Ａｄｓｏｒｂｅｎｔ　ｆｏｒ　Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｍｏｖａｌ　ｉｎ　Ｂｌｏｏｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｗａｎｇ　Ｆｅｉｆｅｉ　Ｗａｎｇ　Ｘｉａｎｇ　Ｘｉｏｎｇ　Ｙａｎｌｉａｎ　Ｘｕ　Ｐｅｉ　Ｊｉｎ　Ｘｉｎｘｉｎ　Ｔａｎｇ　Ｊｉｎｌｏｎｇ　Ｍａｏ　Ｊｉｎｃｈｕｎ （Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏｒｈｅｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０００４４，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｒｅｍｏｖｅ　ｔｈｅ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｂｌｏｏｄ　ｏｆ　ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ　ｐａｔｉｅｎｔｓ，ｗｅ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ａ　ｎｅｗ　ａｄｓｏｒｂｅｎｔ ｗｉｔｈ　ｈｅｐａｒｉｎ　ｓｐａｃｅ　ａｒｍ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ　Ｂ（ＰＭＢ）ｌｉｇａｎｄ．Ｔｈｅ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｏｆ　ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ　ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ　ｒｅｓｉｎ　ｗａｓ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｎｄ　ｈｅｐａｒｉｎ　ｓｐａｃｅ　ａｒｍ　ｗａｓ　ｇｒａｆｔｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ＰＭＢ　ｌｉｇａｎｄ　ｗａｓ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｏｎｔｏ　ａｄｓｏｒｂｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ．Ｗｅ ｅｍｐｌｏｙｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＦＩＴＣ－ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＦＩＴＣ－ＬＰＳ）ｓｔａｔｉｃ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｔｏ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ　ｔｈｅ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｎ ｔｈｅ　ａｄｓｏｒｂｅｎｔ，ａｎｄ　ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）ｓｔａｔｉｃ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｔｏ　ｍｅａｓｕｒｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｖｅｌｙ　ｔｈｅ　ａｄｓｏｒｐ－ ｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｒａｔｅ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｔｈｅ　ｂｌｏｏｄ　ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｔａｔｉｃ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ ａｄｓｏｒｂｅｎｔ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ｒｅｍｏｖａｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＬＰＳ　ａｂｏｖｅ　７０％ ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ　ｔｉｍｅ　ｆｏｒ　２ｈｏｕｒｓ．Ｂｌｏｏｄ　ｃｏｍｐａｔｉ－ ｂｉｌｉｔｙ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ａｄｓｏｒｂｅｎｔ　ｈａｄ　ｌｉｔｔｌｅ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｂｌｏｏｄ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｐｌａｓｍａ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ａｄ－ ｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｒａｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｌｅｓｓ　ｔｈａｎ　１０％ｆｏｒ　ｈｅｍｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　２０％ｆｏｒ　ｐｌａｓｍａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｉｓ　ａｄｓｏｒｂｅｎｔ　ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｈｉｇｈ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ，ｈｉｇｈ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｇｏｏｄ　ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ　ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ａ　ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ． Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ；Ｂｌｏｏｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ　ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ　ｒｅｓｉｎ（ＰＳ）；Ｈｅｐａｒｉｎ；Ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ　Ｂ（ＰＭＢ） 　　＊ 科技部国家高技术研究发展（８６３计划）重大项目资助 （２０１１ＡＡ０２Ａ１０３）；国 家 科 技 部 计 划 攻 关 重 点 项 目 资 助 （２０１１ＢＡＩ１４Ｂ０３）；重 庆 市 科 委 科 技 计 划 攻 关 重 点 项 目 资 助 （ＣＳＴＣ２０１０ＡＡ５０５０）；中 央 高 校 基 本 科 研 业 务 费 资 助 （ＣＤＪＸＳ１０２３００）；重庆大学大型仪器设备开放基金项目资助 △ 通讯作者。Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｗａｎｇｃｈｎ＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ 引言 细菌内毒素是革兰氏阴性菌外膜的脂多糖（ｌｉ－ ｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）成分，类脂Ａ（ｌｉｐｉｄ　Ａ）是其 活性中心［１］。医学研究表明血液中ＬＰＳ水平与癌 症、急性炎症、创伤、烧伤等疾病所引起的全身炎症 反应及多脏器衰竭等病症有密切关系，是导致内毒 素血症的主要原因［２］。内毒素血症的高发病率、高 死亡率以及高治疗费用等问题，一直威胁着人类的 健康并且带来较大的经济负担。在美国每年有５０ 多万的内毒素血症患者，其中有３０％４５％的患者因 得不到有效及时的救治而死亡［３］。多年来，众多专 家和学者试图找到一种安全有效去除患者体内内毒 素并能达到治疗目的的方法。 生 物 医 学 工 程 学 杂 志 第３０卷 内毒素血症治疗研究已取得了一些进展［４］。日 本早在２０世纪９０年代就将固定有多黏菌素Ｂ（ｐｏｌ－ ｙｍｙｘｉｎ　Ｂ，ＰＭＢ）的血液灌流纤维柱应用于内毒素 血症治疗［５］，然而ＰＭＢ本身及固定ＰＭＢ的碳氢链 间隔臂在使用时会造成血液中血浆蛋白等的大量损 失［６］。因此，选择生物相容性良好的间隔臂和配基， 出高选择性、高吸附量的吸附剂在去除血液中 内毒素方面受到越来越多的关注。本研究基于肝素 （ｈｅｐａｒｉｎ）大分子良好的生物相容性以及具有多个 天然活性基团的特性，将其作为分子臂引入氯甲基 化树脂（ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ　ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ　ｒｅｓｉｎ，ＰＳ）载体， 通过化学放大固定ＰＭＢ配基，从而发挥其空间效应 及生物效应，使ＰＭＢ与ＬＰＳ分子活性基团类脂 Ａ 中负电荷的磷酸基团发生强亲和力吸附作用［７］，探 讨该吸附剂对ＬＰＳ选择吸附性能、血液相容性以及 在血液灌流治疗内毒素血症方面的潜能和意义。 １　材料与方法 １．１　材料与仪器 氯甲基－聚苯乙烯－二乙苯烯聚合物（ＰＳ）（天津 南开合成科技有限公司）；碳化二亚胺（１－（３－Ｄｉｍｅ－ ｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）－３－ｅｔｈｙｌ－ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，ＥＤＣ），Ｎ－ 羟基琥珀酰亚胺（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ，ＮＨＳ），异 硫氰酸荧光素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，ＦＩＴＣ）－ （ＦＩＴＣ－ＬＰＳ），ＰＭＢ（Ｓｉｇｍａ）；显色基质鲎试剂盒（厦 门鲎试剂实验厂有限公司）；大鼠（３００ｇ左右，第三 军医大学实验动物中心提供）；肝素钠、甲苯胺蓝、乙 二胺、磷酸缓冲液（ＰＢＳ）等均为国产分析试剂；傅里 叶变换红外光谱仪 （Ｆｏｕｒｉｅｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍ　ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，ＦＴＩＲ）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ＧＸ型，Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌ－ ｍｅｒ公司），倒置荧光显微镜（ＯＬＹＭＰＵＳ　ＩＸ７１），紫 外分光光度计（ＴＵ－１９０１），真空干燥箱，电子天平。 １．２　吸附剂肝素分子臂与ＰＭＢ配基的固定化 吸附剂肝素分子臂及ＰＭＢ配基的固定反应路 线如图１所示。 图１　吸附剂固定肝素分子臂与ＰＭＢ配基反应路线图 Ｆｉｇ．１　Ｓｋｅｔｃｈ　ｍａｐ　ｏｆ　ｇｒａｆｔｉｎｇ　ｈｅｐａｒｉｎ　ｓｐａｃｅ　ａｒｍ　ａｎｄ　ＰＭＢ　ｌｉｇａｎｄ　ｏｎｔｏ　ｔｈｅ　ａｄｓｏｒｂｅｎｔ １．２．１　ＰＳ载体的氨基化　ＰＳ使用前用无水乙醇 洗涤数次，抽干备用。取５ｇ　ＰＳ于４０ｍＬ　１，４－二氧 六环溶胀２ｈ，加入２５０ｍＬ三口烧瓶中，５ｇ　ＮａＯＨ、 ０．２ｇ四丁基溴化铵溶于４０ｍＬ蒸馏水加入反应体 系，５０ｍＬ乙二胺迅速加入，反应混合物于８５℃搅 拌反应６ｈ，产物洗涤至中性，得到氨基化ＰＳ（ＰＳ－ ＮＨ２），抽干备用。 １．２．２　肝素分子臂的连接　一定质量的ＰＳ－ＮＨ２ 浸入５ｍｇ／ｍＬ肝素钠的柠檬酸缓冲液（０．０２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＰＯ４，０．０１ ｍｏｌ／Ｌ 柠 檬 酸，用 ０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ调节ｐＨ至４．７；ＥＤＣ与ＮＨＳ物质的量比值 ６３６ 第３期 王菲菲等：新型内毒素特异吸附血液净化材料的制备与性能研究 为１∶１）中，３７℃恒温振荡反应２４ｈ。抽滤，用ＰＢＳ 洗涤数次，抽干备用。肝素接枝量由甲苯胺蓝比色 法［８］测定。 １．２．３　ＰＭＢ配基的固定　用５％的戊二醛于偶联 缓冲液（０．１ｍｏｌ／Ｌ　Ｎａ３ＰＯ４，０．１５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ，ｐＨ ＝７）活化５ｇ肝素化的氯球（ＰＳ－Ｈｅｐ）吸附剂，在适 量ＮａＣＮＢＨ３ 存在情况下室温反应４ｈ，吸附剂经缓 冲液充分洗涤后，与４ｍｇ／ｍＬ　ＰＭＢ溶液室温反应６ ｈ，同时用 ＮａＣＮＢＨ３ 催化还原。ＰＭＢ吸附剂（ＰＳ－ Ｈｅｐ－ＰＭＢ）其配基固定量通过反应初始含量与固定 化后洗涤液中的ＰＭＢ含量之差计算得到，用紫外分 光光度计测定其吸光度。 １．３　吸附剂体外静态吸附试验 １．３．１　大鼠血浆制备　吸附剂体外血浆吸附实验 均采用大鼠血浆进行研究。大鼠经戊巴比妥钠３０ ｍｇ／ｋｇ腹腔注射麻醉后，通过颈静脉插管采血，肝素 抗凝，离心得到血浆。 １．３．２　ＦＩＴＣ－ＬＰＳ血浆溶液静态吸附实验　取０．２ ｇ吸附剂与２ｍＬ不同浓度ＦＩＴＣ－ＬＰＳ大鼠血浆溶 液于室温避光振荡吸附反应一定时间，ＰＢＳ充分洗 涤３次，于倒置荧光显微镜下在相同曝光强度以及 曝光时间观察拍照。吸附剂表面ＦＩＴＣ－ＬＰＳ荧光强 度用Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ软件统计分析。 １．３．３　ＬＰＳ水溶液及血浆溶液体外静态吸附实验 　０．２ｇ去热原吸附剂用生理盐水平衡数小时，抽滤 表面游离水分，分别与２ｍＬ不同浓度ＬＰＳ水溶液 及大鼠血浆溶液混匀后３７℃振荡吸附反应一定时 间。吸附前后ＬＰＳ浓度用显色基质鲎试剂盒通过 终点显色法测定，于波长（λ）５４５ｎｍ处测吸光度，用 内毒素标准曲线计算ＬＰＳ浓度。根据下式计算吸 附剂的吸附率及吸附量 ＡＲ（％）＝（Ｃｂ－Ｃａ／Ｃｂ）×１００％ ＡＣ＝［（Ｃｂ－Ｃａ）×Ｖ］／Ｍ 式中ＡＲ为吸附率（％），ＡＣ为吸附量（ＥＵ／ｇ），Ｃｂ、 Ｃａ分别为吸附前后的ＬＰＳ浓度，Ｖ为ＬＰＳ溶液体 积；Ｍ为吸附剂质量（ｇ）。 １．４　吸附剂血液相容性试验 用自制的微型血液灌流器进行离体血液灌流实 验。取大鼠股动脉血８ｍＬ，抗凝，控制适当流速，灌 流２ｈ前后分别取２０μＬ与２ｍＬ于血液细胞分析 仪和常规全自动生化分析仪测定血细胞及血液生化 指标变化。 ２　结果与讨论 ２．１　ＰＳ载体的活化及肝素分子臂的连接 ＰＳ的红外光谱图如图２所示，其中１　２６４．９ ｃｍ－１为４位被－ＣＨ２Ｃｌ取代强化的１，４－二取代苯＝ Ｃ－Ｈ的面内弯曲振动；图３为ＰＳ接枝乙二胺后的 红外光谱图，与图２比较，在３　３３８．１ｃｍ－１及３　３１１．３ ｃｍ－１出现了－ＮＨ２ 的伸缩振动，并且－ＣＨ２Ｃｌ强化的 ＝Ｃ－Ｈ面内弯曲振动峰１　２６４．９ｃｍ－１消失，说明乙 二胺与苯环上的氯甲基发生了反应，成功引入ＰＳ载 体。 图２　ＰＳ的红外光谱图 Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ＦＴＩＲ　ｓｐｅｃｔｒａ　ｏｆ　ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ　ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ　ｒｅｓｉｎ 图３　氨基化ＰＳ的红外光谱图 Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ＦＴＩＲ　ｓｐｅｃｔｒａ　ｏｆ　ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ　ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ　ｗｉｔｈ　ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐ 　　本研究通过将肝素分子中的羧基与氨基化的树 脂表面的氨基共价结合，甲苯胺蓝法测定吸附剂肝 素的固定量为１３．８９６μｇ／ｇ，实现了肝素在氯甲基树 脂上的固定。 肝素是由糖醛酸和葡萄糖胺以１→４键连接起 来的重复二糖单位组成的多糖链的混合物，是一种 含有硫酸基的酸性粘多糖类天然抗凝物质［９］。本研 究将其作为固定ＰＭＢ配基的分子臂，一方面考虑到 其分子结构的空间优势，能够加大配体的空间自由 度，减少基质载体对配体造成的空间位阻，提高 ７３６ 生 物 医 学 工 程 学 杂 志 第３０卷 ＰＭＢ配体与目标分子的结合概率，另一方面则是由 于肝素是一种抗凝血的高亲水性的糖基生物大分 子，固定于材料表面能够提高其亲水性，减少疏水表 面对血浆蛋白及血小板吸附作用，后文则讨论了其 对ＬＰＳ的吸附作用及对血液相容性的影响。 ２．２　ＰＭＢ配基的固定 ＰＭＢ是一种环形碱性亲脂性肽类抗生素［１０］， 其携带的二氨基丁酸阴离子残基可与ＬＰＳ的活性 中心类脂 Ａ 的磷酸基团结合，改变类脂 Ａ 的构 象［１１］，从而使之失去活性。图４为选择了最适ＰＭＢ 初始反应浓度、ｐＨ和戊二醛偶联剂的浓度后，其固 定量随时间的变化情况，反应时间大于５ｈ可以使 ＰＭＢ固定量达到最大；此外，我们发现ＰＭＢ配基的 固定量要高于肝素分子的接枝量，这可能是由于除 了肝素分子中有可以与戊二醛偶联剂结合的氨基 外，还有氨基化树脂上未反应的氨基也可能与偶联 剂发生作用，从而使配基固定量达到饱和。 ２．３　吸附剂的吸附性能 ２．３．１　ＦＩＴＣ－ＬＰＳ血浆溶液静态吸附实验　为了 更直观地观察ＬＰＳ在吸附剂上吸附的情况，我们采 用带有ＦＩＴＣ标记的ＬＰＳ作为研究对象，在相同条 件下通过软件计算吸附剂表面荧光强度来定性地反 映其吸附量的变化。图５是 ＰＳ、ＰＳ－Ｈｅｐ和 ＰＳ－ Ｈｅｐ－ＰＭＢ在不同初始浓度ＦＩＴＣ－ＬＰＳ大鼠血浆溶 液中吸附２ｈ后的荧光图像及荧光强度统计比较。 结果发现不同材料表面的荧光强度随ＦＩＴＣ－ＬＰＳ浓 度的增大而增强，在浓度４０μｇ／ｍＬ以上基本达到 吸附饱和；ＰＳ－Ｈｅｐ－ＰＭＢ在相同浓度下对ＬＰＳ的吸 附性能要高于ＰＳ－Ｈｅｐ及ＰＳ，说明接枝肝素分子臂 发挥了空间效应，增强了ＰＭＢ对ＬＰＳ的特异亲和 吸附性。图６是材料随时间吸附ＦＩＴＣ－ＬＰＳ的荧光 图像及荧光强度比较，结果发现在相同吸附时间 ＰＳ－Ｈｅｐ－ＰＭＢ的吸附性能要优于ＰＳ和ＰＳ－Ｈｅｐ，并 且在吸附２ｈ左右能达到平衡，吸附效率较高，有一 定临床使用价值。 图４　反应时间对ＰＭＢ配基固定量的影响 Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｏｎ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｑｕａｎｔｉｔｙ　ｏｆ　ＰＭＢ　ｌｉｇａｎｄ ２．３．２　ＬＰＳ水与血浆溶液体外静态吸附性能　吸 附前后ＬＰＳ浓度用显色基质鲎试剂盒通过终点显 色法测定。表１和图７为ＰＳ－Ｈｅｐ－ＰＭＢ于不同浓 度ＬＰＳ溶液中吸附２ｈ后吸附量与吸附率的比较。 我们发现水溶液中ＬＰＳ的吸附率较高，基本达到 图５　材料在不同浓度ＦＩＴＣ－ＬＰＳ大鼠血浆溶液吸附２ｈ后结果 （倒置荧光显微镜，４００×；Ａ，ＰＳ－Ｈｅｐ－ＰＭＢ；Ｂ，ＰＳ－Ｈｅｐ；Ｃ，ＰＳ） （ａ）材料吸附ＦＩＴＣ－ＬＰＳ荧光图像；（ｂ）荧光强度比较 Ｆｉｇ．５　Ａｄｓｏｒｂｅｎｔ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ＦＩＴＣ－ＬＰＳ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ｐｌａｓｍａ　ａｆｔｅｒ　２ｈｏｕｒｓ （Ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　４００× Ａ．ＰＳ－Ｈｅｐ－ＰＭＢ；Ｂ．ＰＳ－Ｈｅｐ；Ｃ．ＰＳ） （ａ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｍａｇｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｄｓｏｒｂｅｎｔ；（ｂ）ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ８３６ 第３期 王菲菲等：新型内毒素特异吸附血液净化材料的制备与性能研究 图６　材料在ＦＩＴＣ－ＬＰＳ大鼠血浆溶液吸附不同时间结果（４０μｇ／ｍＬ　ＦＩＴＣ－ＬＰＳ） （倒置荧光显微镜２００×；Ｄ，ＰＳ－Ｈｅｐ－ＰＭＢ；Ｅ，ＰＳ－Ｈｅｐ；Ｆ，ＰＳ） （ａ）材料吸附不同时间荧光图像；（ｂ）荧光强度比较 Ｆｉｇ．６　Ａｄｓｏｒｂｅｎｃｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ｉｎ　ＦＩＴＣ－ＬＰＳ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ｐｌａｓｍａ　ｆｏｒ　ａｄｓｏｒｂｉｎｇ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｍｅ（４０μｇ／ｍＬ　ＦＩＴＣ－ＬＰＳ） （Ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　２００×；Ｄ，ＰＳ－Ｈｅｐ－ＰＭＢ；Ｅ，ＰＳ－Ｈｅｐ；Ｆ，ＰＳ） （ａ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｍａｇｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｄｓｏｒｂｅｎｔ；（ｂ）ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ９６％以上，大鼠血浆溶液中 ＬＰＳ去除率则基本在 ７０％以上，并且随着ＬＰＳ浓度的增大，吸附率有所 下降，这可能是由于血浆中的血浆蛋白与ＬＰＳ在材 料表面的吸附过程中有竞争关系，吸附在材料表面 的血浆蛋白一方面可能会掩盖材料的结合位点，一 方面造成一定的空间位阻，影响ＬＰＳ在材料表面的 吸附作用。 表１　吸附剂于不同浓度ＬＰＳ溶液的吸附量 Ｔａｂ．１　Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆ　ａｄｓｏｒｂｅｎｔ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ＬＰＳ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＬＰＳ初始浓度／ （ＥＵ·ｍＬ－１） 吸附量／（ＥＵ·ｇ－１） 水 血浆 ０．１０　 ０．９７　 ０．７６ ０．２５　 ２．４３　 １．９０ ０．５０　 ４．８３　 ３．７１ ０．７５　 ７．３８　 ５．５２ １．００　 ９．８６　 ７．０５ 　　表２与图８为吸附时间对ＬＰＳ吸附量与吸附 率的影响。ＬＰＳ初始浓度为０．５ＥＵ／ｍＬ，随着时间 的延长吸附剂的吸附量与吸附率都随之增大，并在 ２ｈ左右能够达到吸附平衡，这表明在短时间内该吸 附剂具有良好的吸附效率，大鼠血浆中的吸附率能 够达到７０％以上，为进一步研究提供了理论依据。 表２　时间对吸附剂吸附量的影响 Ｔａｂ．２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｉｍｅ　ｏｎ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆ　ａｄｓｏｒｂｅｎｔ 吸附时间／ｍｉｎ 吸附量／（ＥＵ·ｇ－１） 水 血浆 １５　 ２．６０　 １．３８ ３０　 ４．５３　 ２．９６ ６０　 ４．８１　 ３．５３ ９０　 ４．８２　 ３．６３ １２０　 ４．８７　 ３．６９ 图７　吸附剂于不同浓度ＬＰＳ溶液２ｈ后的吸附率 Ｆｉｇ．７　Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ａｄｓｏｒｂｅｎｔ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ＬＰＳ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　２ ｈｏｕｒｓ ２．４　吸附剂的血液相容性 血液相容性是评价生物医用材料一项重要的指 标［１２］。本研究采用大鼠进行了离体血液灌流实验， 灌流前后血液成分变化如表３所示。我们发现实验 前后血液成分总体变化不大，血细胞及血小板相对 变化率都在１０％以下，血浆蛋白的相对变化率则在 ２０％以下，说明接枝了肝素的吸附剂血液相容性良 好，符合一般临床灌流要求，具有临床应用前景。 　　综上所述，ＰＭＢ作为已证实对ＬＰＳ有特异中 和作用的抗生素，目前国内外许多学者将其固定于 吸附载体［１３］，例如日本研究人员制成的ＰＭＢ血液 纤维柱，其每克纤维可以结合７ｍｇ的ＰＭＢ［１４］，并 ９３６ 生 物 医 学 工 程 学 杂 志 第３０卷 图８　时间对吸附剂吸附率的影响 Ｆｉｇ．８　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｉｍｅ　ｏｎ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ａｄｓｏｒｂｅｎｔ 表３　灌流前后血液成分的变化（ｎ＝５） Ｔａｂ．３　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｌｏｏｄ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｂｅｆｏｒｅ　ａｎｄ　ａｆｔｅｒ　ｒｅｐｅｒｆｕ－ ｓｉｏｎ（ｎ＝５） 血液成分 灌流前 灌流后 变化率／％ ＷＢＣ／（１０９·Ｌ－１） ４．０８±０．０６　 ３．９６±０．０８　 ２．７５±１．６９ ＲＢＣ／（１０１２·Ｌ－１） ７．６４±０．０４　 ７．３４±０．１２　 ３．９８±１．４８ ＰＬＴ／（１０９·Ｌ－１）１５８．３２±１．５６　 １４４．６６±３．９７　 ８．６３±２．１５ ＴＰ／（ｇ·Ｌ－１） ５５．９６±０．４０　 ４６．９２±１．１２　 １６．１６±１．６５ ＡＬＢ／（ｇ·Ｌ－１） １６．１２±０．２９　 １３．１８±０．４６　 １８．２６±１．４３ ＧＬＢ／（ｇ·Ｌ－１） ３９．８４±０．４６　 ３２．６８±１．４７　 １７．９７±３．４３ 取得了良好的效果和稳定性。但也有研究发现 ＰＭＢ直接固定或使用碳氢链分子臂固定于载体表 面会造成血浆蛋白的大量损失，这可能是由于ＰＭＢ 其本身携带的阳离子基团会与负电荷的蛋白质发生 静电吸附作用［１５］，以及分子臂其血液相容性不理想 所致。本研究首先选用了具有良好的机械性能、化 学稳定性以及血液相容性的氯球树脂作为吸附剂载 体，成功将肝素引入材料表面，发挥了其分子结构以 及抗凝血、高亲水性等方面优势，得到了血液相容性 较为理想的吸附剂；此外，ＰＭＢ配基的固定量较高， 有利于对ＬＰＳ选择性吸附，实验证明其对ＬＰＳ的去 除率较之已有吸附材料处于较高水平，为下一步的 研究提供了重要的实验依据。目前临床应用有价值 的特异高效的性和吸附剂仍处于探索阶段，现有的 吸附材料对内毒素血症患者有一定的疗效，但仍需 进行更深入地研究。 ３　结论 制备了以ＰＳ为载体，带有肝素分子臂及ＰＭＢ 为配体的内毒素特异吸附剂；ＦＩＴＣ－ＬＰＳ体外吸附 实验发现ＰＳ－Ｈｅｐ－ＰＭＢ吸附剂吸附性能要优于ＰＳ－ Ｈｅｐ及ＰＳ，定性地说明了该吸附剂对内毒素有特异 亲和吸附作用；ＰＭＢ吸附剂对血浆中内毒素的去除 率能达到７０％以上，并且具有良好的血液相容性， 吸附前后血细胞及血浆蛋白变化均不大，符合一般 临床灌流要求，在内毒素血症治疗方面具有良好的 医学应用前景。 参 考 文 献 ［１］ ＤＡＶＩＥＳ　Ｂ，ＣＯＨＥＮ　Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｒｅｍｏｖａｌ　ｄｅｖｉｃｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｓｅｐｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｅｐｔｉｃ　ｓｈｏｃｋ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ， ２０１１，１１（１）：６５－７１． ［２］ ＷＩＮＴＥＲＳ　Ｂ　Ｄ，ＥＢＥＲＬＥＩＮ　Ｍ，ＬＥＵＮＧ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｌｏｎｇ－ ｔｅｒｍ　ｍｏｒｔａｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　ｌｉｆｅ　ｉｎ　ｓｅｐｓｉｓ：ａ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｒｅ－ ｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｃｒｉｔ　Ｃａｒｅ　Ｍｅｄ，２０１０，３８（５）：１２７６－１２８３． ［３］ ＯＮＧ　Ｋ　Ｇ，ＬＥＬＡＮＤ　Ｊ　Ｍ，ＺＥＮＧ　Ｋ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｒａｐｉｄ　ｈｉｇｈｌｙ－ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏ－ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，２００６，２１（１２）：２２７０－２２７４． ［４］ 何建川，邵阳，张波，等．内毒素血症治疗的研究进展［Ｊ］．医学 研究杂志，２００８，３７（９）：１０２－１０４． ［５］ ＭＩＴＡＫＡ　Ｃ，ＴＯＭＩＴＡ　Ｍ．Ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ　Ｂ－ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｆｉｂｅｒ ｃｏｌｕｍｎ　ｈｅｍｏｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｆｏｒ　ｓｅｐｔｉｃ　ｓｈｏｃｋ［Ｊ］．Ｓｈｏｃｋ， ２０１１，３６（４）：３３２－３３８． ［６］ ＰＥＴＳＣＨ　Ｄ，ＡＮＳＰＡＣＨ　Ｆ　Ｂ．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｒｅｍｏｖａｌ　ｆｒｏｍ　ｐｒｏ－ ｔｅｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０００，７６（２－３）：９７－１１９． ［７］ ＳＣＨＲＯＭＭ　Ａ　Ｂ，ＢＲＡＮＤＥＮＢＵＲＧ　Ｋ，ＬＯＰＰＮＯＷ　Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ａｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ　ｔｈｅ　ｓｈａｐｅ　ｏｆ　ｔｈｅｉｒ　ｌｉｐｉｄ　Ａ　ｐｏｒｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００， ２６７（７）：２００８－２０１３． ［８］ 刘秀英，张超灿，徐卫林．甲苯胺蓝分光光度法测定肝素钠的 研究［Ｊ］．化学试剂，２００９，３１（４）：２７１－２７４． ［９］ 李娟，吴英锋，杨新林．肝素功能化生物材料的研究进展［Ｊ］． 有机化学，２０１０，３０（３）：３５９－３６７． ［１０］ ＣＲＵＺ　Ｄ　Ｎ，ＰＥＲＡＺＥＬＬＡ　Ｍ　Ａ，ＢＥＬＬＯＭＯ　Ｒ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｆｆｅｃ－ ｔｉｖｅｎｅｓｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ　Ｂ－ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｆｉｂｅｒ　ｃｏｌｕｍｎ　ｉｎ　ｓｅｐｓｉｓ：ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｃｒｉｔ　Ｃａｒｅ，２００７，１１（２）：Ｒ４７． ［１１］ 章志丹，马晓春．多黏菌素吸附在脓毒症中的应用［Ｊ］．中国实 用外科杂志，２００８，２８（６）：４８７－４８９． ［１２］ ＡＳＡＮＯ　Ｔ，ＫＩＮＯＳＨＩＴＡ　Ｙ，ＫＯＢＡＹＡＳＨＩ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ　ｄｅｖｉｃｅ　ｆｉｌｌｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｏｌｙ　ａｒｙｌａｔｅ ｂｅａｄｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｍｅｄ　Ｍａｔｅｒ　Ｅｎｇ，２０１０，２０（１）：４７－５４． ［１３］ 田爽，李涛．用血液灌流治疗内毒素血症的研究进展［Ｊ］．国际 生物医学工程杂志，２００９，３２（１）：５０－５４． ［１４］ ＴＡＮＩ　Ｔ，ＳＨＯＪＩ　Ｈ，ＧＵＡＤＡＧＮＩ　Ｇ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｔｒａｃｏｒｐｏｒｅａｌ ｒｅｍｏｖａｌ　ｏｆ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ：ｔｈｅ　ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ　Ｂ－ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｆｉｂｅｒ　ｃａｒ－ ｔｒｉｄｇｅ［Ｊ］．Ｃｏｎｔｒｉｂ　Ｎｅｐｈｒｏｌ，２０１０，１６７（１）：３５－４４． ［１５］ ＨＩＲＡＹＡＭＡ　Ｃ，ＳＡＫＡＴＡ　Ｍ，ＮＡＫＡＭＵＲＡ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ． Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙ（ｅｐｓｉｌｏｎ－ｌｙｓｉｎｅ）ａｄｓｏｒｂｅｎｔｓ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｒｅｍｏｖａｌ　ｏｆ　ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｓｃｉ　Ａｐｐｌ，１９９９，７２１（２）：１８７－１９５． （收稿：２０１２－０３－０６　　修回：２０１２－０４－１４） ０４６