幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因芯片的制备和应用

主堡捡堕医堂盘查!Q螋生垒旦墓丝鲞筮!期堡h也』!生丛型，垒P堕!；Q鲤。!吐丝，盟垒兰 幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因 芯片的制备和应用 吴荣辉楼跃民何建华 陈如昌 郭小妹孙兰青 陈俊 ．新技术与新方法． 【摘要】 目的建立一种寡核苷酸微阵列幽门螺杆菌23SrRNA基因A2142G、A2143G及 C2182T点突变的方法。方法根据23SrRNA基因A2142G、A2143G及C2182T突变位点设计相应探 针，样本经不对称PCR扩增后，其产物与芯片杂交。非荧光标记引物扩增PCR产物克隆至T载体，测 序验证芯片结果，并结合临床最低抑菌浓度实验判断该方法的正确性。结果寡核苷酸微阵列技术 与测序检测幽『】螺杆菌23SrRNA基因多态性结果完全一致。经培养及鉴定幽门螺杆菌阳性的54份 标本，杂交结果显示A2142位点均为野生型(54／54)；A2143G突变率为11．1l％(6／54)，尚未发现 A2143C和A2143T的突变；c2182T突变率为12．96％(7／54)，尚未发现C2182A和C2182G的突变， 其余均为野生型，上述结果与菌株体外试验MIC结果完全一致。结论建立一种寡核苷酸微阵列技 术检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药的23SrRNA基因多态性的方法，可以高通量并直接检测胃黏膜而不 需进行细菌培养，推动个体化治疗的实施。 【关键词】螺杆菌，幽门；克拉霉素；抗药性，细菌；寡核苷酸序列分析 Anofigonudeotidemicroarrayapproachforclarithromydn·resistancettelicobacterpyloriddCec60nWU Rong—hui，LoUYue-．tin，HEJ妇汛一hua，CHENRu—chang．GUoXiao—mei．SUNLan·qing．cHEN 血，LDepartmentofcfinical，YiwuCentralHospital．Yiwu3220DD。China 【Abstract】ObjectiveTodevelopalloligonucleotidearraytodetectsinglenucleotidemutationsin 23SrRNAgene．MethodsPrimersandprobestargetingA2142GA2143GandC2182Tmutationsin23S rRNAgeneweredesignedtodevelop811oligonucleotidearray．Sampleswereperformedbyanasymmetric PCRandthePCRproduc协werehybridizedwiththespecificDNAmicroarraychips．Nonfluorescence— labelodPCRproductswereclonedintoTvectors．There8ultsofoligonucleotidearraywereconfirmedbv directDNAsequencingandevaluatedbyminimalinhibitoryconcentration(MIC)．ResultsTheliesul协 obtainedfromoligonucleotidemicroarraywereidenticaltothoseofdirectsequencing．In54Helicobacter pylorisamples，oligonucleotidemicroarrayindicatedthatnoA—to-Ctransitionat2142Wagfound．andthe mutantrateofA2143GWag11．1l％(6／54)。themutantrateofC2182TWas12．96％(7／54)．A2143C． A2143T．C2182AandC2182GmutationswerenotfoundTheotherspecimenswerewild．type．Allthe aboveresultswerethesamea8thatofMICtests．ConclusionsTheoligonucleotidemicroarrayiSareliable andaccurategenotypingassayforclarithromycin—resistanceofHelicobacterpylori．Itishigh-throughput screeningmethodforgastricmucogaandimprovetheapplicationofstrategyforpersonalizedtherapy． 【Keywords】Helicobac／erpylori；Clarithromycin；Drugresistance，bacterial；Oligonucleotide arraysequenceanalysis 幽门螺杆菌(Hprior／，Hp)可引起慢性胃炎、消 化性溃疡，而且与胃癌、胃MALT淋巴瘤，以及一些 心血管疾病、血液病、自身免疫性疾病、皮肤病等有 关[1引。Hp感染者合并溃疡患者必须接受根除治 疗【3]，临床常规应用三联或四联疗法根除Hp即质 子泵抑制剂和(或)铋剂联合克拉霉素、阿莫西林、 甲硝唑／替硝唑等2种抗生素。而耐药菌株的出现 给Hp的根除带来很大的困难，由于抗生素滥用及 DOI：10．3760／ema．j．isan．1009-9158．2009．04．027 基金项目：浙江省医药卫生科学研究基金资助项目(2002A089) 作者单位：322000浙江省义乌市中心医院检验科 应用不，耐药菌株的出现日益增多，导致Hp耐 药率日益升高。研究表明Hp克拉霉素耐药与23S rRNA基因A2142G、A2143G[41和C2182T”o点突变 相关。常见的检测基因突变的方法有聚合酶链反 应．限制性片段长度多态性(PCR—RFLP)及直接测序 等，但这些方法操作费时且价格昂贵。本研究旨在 探索建立一种快速、简便的检测方法，获取Hp克拉 霉素耐药相关23SrRNA基因多态性的流行病学资 料，为l临床合理用药提供依据。 材料与方法 一、主要试剂与仪器 万方数据 生堡撞墅堡堂盘壶!塑堡璺旦筮丝鲞筮兰魍垦垒!』地丛型：△画!!塑：坠￡丝：丛璺堡 Hp分离培养基(中国疾病预防控制中心疾病 预防控制所)，细菌基因组DNA抽提试剂盒(美国 Promega公司)，PCR引物、TaqDNA聚合酶(大连宝 生物工程有限公司)，Hp菌株NCTC11637(中 国疾病预防控制中心张建中教授惠赠)，克拉霉素 E—test法药敏试剂条(瑞典ABBiodisk公司)，CEQTM TDCS试剂盒(美国BeckmanCoulterm公司)，MCO一 175M三气培养箱(日本三洋株式会社)，GeneAmp PCRSystem9600(美国Perkin．Elmer公司)，DNA自 动合成仪(ABi8089，美国ABi公司)，芯片点样仪 (美国Cartisan公司)，激光共聚焦扫描仪GenePix 4000(AxonInstrument)，质粒经紫外分光光度仪 (DU640)、CEQTM2000XL测序仪(美国Beckman Coultera瑚公司)o 二、HpDNA标本的收集及药物敏感试验 胃黏膜活检标本于2006年4一月取自义乌市 中心医院消化科，随机选择胃溃疡及胃炎患者150 例，其中男97例，女53例，年龄为19—62岁，平均 年龄39岁。患者内镜下距幽门前5cm大弯或小弯 处用活检钳钳取黏膜组织2块，一块组织样本用于 基因组DNA提取，另一块组织用无菌镊将黏膜组织 装入预先装有保存液(10％蔗糖，2．8％布氏肉汤 粉，10％小牛血清)的1．5rnl离心管，4℃保存，转 送实验室。取l块胃黏膜组织，生理盐水研磨后直 接划线接种法，接种于分离培养基(含10％新鲜绵 羊血、10％Hp生长因子的哥伦比亚琼脂)，三气培 养箱中(5％02，10％C02，85％N：)37℃培养3～5 d，挑取琼脂平板上透明针尖样可疑菌落转种到新的 分离培养基平皿。并进行氧化酶反应试验、过氧化 氢酶试验、尿素酶试验及尿素酶特异性基因PCR鉴 定。经分离培养鉴定，其中54份培养阳性，阳性菌 株经培养后取O．5个麦氏单位的Hp菌悬液均匀涂 布于培养基平皿中，干燥后贴上克拉霉素Etest纸 条，于三气培养箱内培养至细菌菌落呈相互融合生 长时，读取结果。判断标准：平皿内生长完全被试条 所抑制处所对应得刻度即为MIC，其中敏感S：≤ O．25；中介(I)：0．5¨g／ml；耐药(R)≥1ws／mi。质 控菌采用HpNCTCll637，结果参照1999年美国临 床和实验室标准化协会(CLSI)标准。 三、寡核苷酸合成 寡核苷酸引物或探针采用标准亚磷酰胺化学方 法在DNA自动合成仪上合成。合成完毕用浓氨水 55℃作用15h脱保护／切割，寡核苷酸纯合柱 (OPC)柱纯化。固定探针在3’端以氨基修饰，氨基 与探针序列之间以间隔臂(spacer，聚乙二醇亚磷酰 胺试剂)相连。荧光标记引物用cy3亚磷酰胺试剂 在普通引物序列的5’末端直接以标准亚磷酰胺化 学合成法进行荧光标记(每个引物分子标记一个荧 光分子)。寡核苷酸探针包括A2142G、A2142C、 A2142T、A2143G、A2143C、A2143T、C2182T、 C2182A和C2182G，优化的寡核苷酸探针序列详见 表l。 表1探针序列 注：黑粗斜体碱基为突变位点 四、PCR扩增 为产生单链的目标片段采用不对称PCR扩增 的方法，正向引物HpF(5'-CTGCATGAATGGCGTAA CGAG-3’)与反向引物(或荧光标记反向引物)HpR (5’．cAAGGATGAcTccATAAGAGc．37)的比例优化 为1：10。20斗l反应体系中含有1．5mmol／L MgCl2，dNTP各200斗moL／L，正向引物0．I斗moL／L， 反向引物l恤moL／L，HpDNA50ng，1XPCR缓冲液 和lUTaq酶(大连TaKaRa公司)。PCR扩增条件 为：预变性94℃5rain；变性94℃30s，退火55℃ 308，延伸72℃30s，共30个循环；最后延伸72℃ 5rain。PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳分析。 五、寡核苷酸微阵列的制备 将探针至终浓度为100vLmol／L，与点样液 [750mmol／LNaCl，75mmol／L乙酸钠，5％glycer01． 1％Ficolland0．1％十二烷基硫酸钠(SDS)]l：l 稀释，并取10斗l至96孔板。用芯片点样仪 万方数据 生坐捡墅匡堂盘盍!Q塑生璺旦箍丝鲞筮堡翅垦丛!』!坐丛鲤：叁P巫!!Q鲤，!吐丝。堕生兰 (Cartisan)点至醛基化玻片上，每点体积约为 0．5nl，点心间距为500Ixm，点直径约为200Ixm，每 条探针重复点2次，阵列如图1所示。点样时保持 环境湿度90％，温度23℃。点样后的芯片在使用 前于室温放置至少24h。 ·l ·l +2 +2 +3 ·3 +4 ●4 幸5 ·5 奉6 ·6 ●1 ●^， ·8 ·8 幸9 ●9 ·10 ·lO ·ll ●ll ·12 ·12 +13●13 ●14 ·14 事15 ·15 ·16 ●16 ●17 +17·18 ·18 ·19 ●19 *20*20 图1基因芯片点样示意图 六、杂交、洗涤与扫描 Cy3一标记的不对称PCR产物与杂交液 (750mmol／LNaCI，75mmol／Lsodiumacetate， O．1％SDS，l斗g／IId鲑精DNA，2．5％甲酰铵)按1 ：4混合，将10山混合液转移至芯片的杂交区域。 芯片置于杂交盒中在42℃水浴中保温lh。杂交后 取出芯片依次在洗液A(150mmoL／LNaCI，15 mmol／L乙酸钠，0．2％SDS)，洗液B(30mmob／L NaCI，3mmol／L乙酸钠)和洗液C(15mmoL／L NaCl，1．5mmol／L乙酸钠)中各洗涤lmin。待干 后芯片用激光共聚焦扫描仪上扫描，扫描参数为： Cy3荧光素扫描模式，激发波长532am，发射波长 570n／n。获得并分析精度为lO¨肌的16位TIFF格 式灰度图像。 七、寡核苷酸微阵列灵敏度试验 用靶序列特异的引物对HpDNA进行PCR扩 增，扩增的DNA片段经纯化后，按照Promega公司 的试剂盒说明，与PromegapGEM—T载体连接，转 化感受态大肠杆菌，挑取阳性克隆，提取质粒，质粒 经紫外分光光度仪定量后稀释成106、105、104、103、 102和10拷贝／山，分别进行PCR后杂交、扫描。所 有实验重复3次，具体步骤同前。 八、测序验证 提取Hp基因组DNA，采用与上述PCR相同的 引物进行对称PCR扩增，扩增产物经纯化后，采用 CEQTMTDCS试剂盒在CEQ删2000XL测序仪上进 行测序，严格按照操作说明书操作。 结 果 1．Hp单核苷酸多态性检测引物的设计与优化： 根据文献报道，选择3个与克拉霉素耐药相关的突 变位点(A2142G、A2143G及C2182T)。经优化后探 针平均长度为(15±2)bp，突变位点设计位于探针 中间，两端各延伸7—10bp。根据杂交结果进行筛 选，探针序列详见表1。 2．Hp基因型分析结果：经培养和PCR证实为 Hp阳性的54份标本，杂交结果显示A2142位点均 为野生型(54／54)；A2143G突变率为11．1％(6／ 54)，尚未发现A2143C和A2143T的突变；C2182T 突变率为13．O％(7／54)，尚未发现C2182A和 C2182G的突变，其余均为野生型(表2)。 表2 54份临床样本基因突变及MIC值检测结果 3．直接测序法验证：寡核苷酸微阵列技术与 PCR测序检测Hp23SrRNA基因多态性结果完全 一致，结果见图2。 4．药物敏感性实验：Etest法测定克拉霉素的 MIC，质控菌采用HpNCTCll637，结果参照1999年 CLSI标准。基因芯片检测与PCR直接测序结果完 全一致(表2)。 5．灵敏度：寡核苷酸芯片检测细菌耐药的23S rRNA基因最低可达到102基因拷贝数，低于该拷贝 数时芯片扫描无信号产生，结果见图3。 讨 论 了解细菌的耐药情况对根除Hp治疗十分重 要。有些菌株原发耐药，有些菌株继发耐药。克拉 霉素对耐药菌株则无济于事，因此将克拉霉素作为 经验性治疗的常规用药并不明智，而目前医学界耐 药问题尚未能解决。有大规模研究表明克拉霉素耐 药的发生率一般不超过10％[61，而有些欧洲国家如 法国和比利时耐药率相对高，达10％一15％一1。克 拉霉素治疗其耐药菌株常预示着根除失败的可能性 很大【8J。因此，在根除治疗前了解细菌的耐药性至 关重要。 研究证实Hp克拉霉素耐药与2142或2143位 点突变有关一J。本研究结果显示，没有发现2142位 点的突变，A2143G和C2182T的检出率均小于 15％。A2142G或A2143G突变常常导致克拉霉素 和核糖体亲和力下降，从而引起耐药；而A—C或A 万方数据 ·465· 注：a图为2142A、2143A和2182C测序图；b图为2142A、2143A和2182C寡核苷酸微阵列检测结果；c图为2142A、2143A和2182C寡核苷酸 微阵列检测图；d图为2142A、2143A和2182T寡核苷酸微阵列检测结果 图2测序结果与基因芯片分析结果比较 注：8图为104拷贝／一；b图为103拷贝／山；c图为102 拷贝／一；d图为101拷贝／m 图3寡核苷酸微阵列灵敏度实验结果 一T突变却很少见。经典的检测突变的方法常用 PCR．RFLPL5,10]。 由于突变率较低，建立一种在大规模人群中快 速而精确地检测突变的方法显得尤为重要。当今正 在发展的基因芯片技术为Hp的分型及耐药性同时 检测提供了一个极好的契机。寡核苷酸芯片检测 SNP有一定的使用价值，具有高通量、方法简便的特 点。因此本实验建立了寡核苷酸芯片平台检测23S rRNA的突变情况。 为了验证PCR一寡核苷酸芯片的准确性，本实验 对PCR产物进行转化、克隆及测序，测序与寡核苷 酸芯片检测结果一致。因此PCR产物与寡核苷酸 芯片杂交是切实可行、具有高通量的方法。与传统 的方法相比，寡核苷酸芯片可以对胃黏膜活检标本 直接进行菌株变异检测，对混合菌株感染时同样适 用，而用细菌培养的方法却很难区分混合株，而且费 时费力，培养相当困难。测序是一种经典的方法，但 是往往只能检测优势株的序列；或者野生株和突变 株的数量相当时才容易检测；而寡核苷酸芯片可以 检测少量变异菌株。该方法可以让医生在短时间内 准确判断患者的耐药情况。因此，寡核苷酸芯片检 测细菌耐药具有其优越性，本研究检测基因型所用 的探针和微阵列都自行设计和生产，相信在不久的 将来，药物耐药芯片会商品化，给医务人员带来直接 的便利。 参 考 文 献 【lJ GuanM，StephermJ，ThompsonJ，ela1．Significantassociation ofCagApositiveHelicobacterpylofistrainswithriskofpremature myocardialinfarction．Heart，2000，84：267_271． [2]Zent山nP．SerioloB，DulbeecoP．eta1．Eradicationof Hehcobaaterpylorimayreducedi8ease8eveIitvinrheumatoid arthritis．AlimentPharnmcolTher，2002．16：1291．1299． [3]NIHConsensusConference．Helicobacterpyloriinpepticul哪 diⅨw．NIHConsensusDevelopmentPanelonHelicobacterpylori iIlpepileulcerdi鸵雠．JAMA，1994，272：65-69． [4]VersalovieJD，ShortridgeK，KibierMV。eta1．Mubttionin23S rRNAareassociatedwithclarithromycinresistanceinHelicobanter pylori．AntimicrobAgentsChemther，1996．40：477-480． [5]MatsuokaM，YoshidaY，HayakawaK．eta1．Simultaneous colonizationofHelicobaaterpylotiwithandwithoutmutationsin the23SrRNAgeneinpatientswith110historyofclarithromycin exl∞,sttl-e．Gut，1999．45：503-507． 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