HPLC法测定裸花紫珠中齐墩果酸与熊果酸的含量_张艳秋

[收稿日期 ] 2008209219 [基金项目 ] 海南省自然科学基金项目 (80591) [作者简介 ] 张艳秋 (19622) ,女 ,吉林人 ,研究员 ,执业药师。 HPLC法测定裸花紫珠中齐墩果酸与熊果酸的含量 张艳秋 1 ,洪金波 1 ,刘文林 2 (1. 海南省药物研究所 ,海南 海口 　570314; 2.海南制药厂有限公司 ,海南 五指山 　572200) 　　[摘要 ] 目的 :建立裸花紫珠中齐墩果酸与熊果酸的含量测定方法 ,考察海南五指山地区野生裸花紫珠 中齐墩果酸与熊果酸的含量。方法 :采用高效液相色谱法测定裸花紫珠中齐墩果酸与熊果酸的含量 ,乙 腈 -甲醇 - 3. 5 %乙酸胺水溶液 (69∶10∶21)为流动相 ;流速为 1 mL /m in,检测波长为 215 nm。结果 :齐 墩果酸与熊果酸的线性范围分别为 1. 63～6. 53μg( r = 0. 999 6) 与 1. 20～7. 20μg ( r = 0. 999 7) ,回收 率分别为 98. 11% 和 101. 64% 。结论 :本法操作简单 ,测定结果准确 ,适于裸花紫珠中齐墩果酸与熊果 酸的含量测定。 [关键词 ] 裸花紫珠 ;齐墩果酸 ;熊果酸 ;高效液相色谱法 [中图分类号 ] R286. 0　[文献标识码 ] A　[文章编号 ] 100721237 (2009) 0120005203 HPLC de te rm ina tio n o f o le a no lic a c id a nd u rso lic a c id in fo lium ca llica rp a e nud iflo ra e ZHANG　Yan2qiu1 , HONG　J in2bo1 , L IU　W en2lin2 (1. Pharm aceu tica l Institu te of Ha inan P rovince　Haikou 570314, Ch ina; 2. Ha inan Pha rm aceu tica l Factory CO. L TD　W uzh ishan 572200, Ch ina) [AB STRAC T ] O b je c tive: To establish a method for quality control of oleanolic acid and ursolic acid in foli2 um callicarpae nudiflorae, which is originally grew in the five2finger mountain area. M e tho d s: The content of oleanolic acid and ursolic acid in folium callicarpae nudiflorae were determ ined by high performance liquid chroma2 tography(HPLC). The analytical column was C18 (250 mm ×4. 6 mm , 5μm) . The mobile phase consisted of ace2 tonitrile2methanol23. 5% ammonium acetate (69∶10∶21) , the flow rate was 1. 0 mL /m in. The UV detection wave2 lenghth was 215 nm. R e su lts: O leanolic acid and ursolic acid showed a good linearity in range of 1. 63～6153μg ( r = 0. 999 6) and 1. 2～7. 2μg ( r = 0. 999 7) . The average recovery was 98. 11% , 101. 64% , respectively. Co nc lu s io n: The method is a simp le, convenient, accurate and relable, and it can be used to quality control of fo2 lium callicarpae nudiflorae . [ KEY WO RD S ] Folium callicarpae nudiflorae ; O leanolic acid; U rsolic acid; H igh performance liquid chro2 matography (HPLC) 　　裸花紫珠药材为马鞭草科植物裸花紫珠 (Calli2 carpa nudiflorea Hook. Et A rn. )的干燥叶 ,具有消 炎、解毒、收敛、止血作用 ,用于治疗化脓性炎症、急 性传染性肝炎、外治烧伤、烫伤、外伤出血等 ,是海南 黎族民间常用的一味药材。 在海南黎族民间验方基础上 ,经现代研究发展 而成的裸花紫珠片与复方木麻黄片 ,就是以裸花紫 珠为主药的成方制剂 ,前者用于治疗胃出血及病毒 性肝炎 ,后者用于治疗寒湿痢疾。裸花紫珠药材主 产海南五指山地区 ,由于裸花紫珠药材化学研究较 少 ,化学成分不明确 ,其含量测定指标难以建立 ,给 药材质量控制带来困难。最新研究文献报道 ,从裸 花紫珠中分离出了具有抗菌消炎作用的齐墩果酸、 熊果酸以及黄酮类成分 [ 1 ] ,我们经对其进行薄层色 5 海南医学院学报　2009, 15 (1) Journal of Hainan M edica l College　 谱及高效液相色谱 ( HPLC)分离检测发现 ,裸花紫 珠中所含齐墩果酸与熊果酸含量很高 ,以两者作为 含量测定指标对裸花紫珠药材进行质量控制具有实 际意义。本实验系用 HPLC法对裸花紫珠中齐墩果 酸与熊果酸含量进行了测定 ,为进一步进行新制剂 开发和质量控制提供科学依据。 1　仪器、试剂与样品 W aters高效液相色谱仪 (Delta600泵 , 2487检 测器 ) ;M ilennium 色谱工作站 ;齐墩果酸与熊果酸 化学对照品购自中国药品生物制品检定所 ;裸花紫 珠药材采自海南省五指山区 ,由本所鉴定 ;乙腈、甲 醇为色谱纯 ,其它均为分析纯试剂。水为自制纯化 水。 2　试验方法与结果 2. 1　色谱条件与系统适用性 色谱柱 : L ichrospher C18 ( 250 mm ×4. 6 mm , 5μm) ,流动相 :乙腈 -甲醇 - 3. 5 %乙酸胺水溶液 (69∶10∶21) ,流速为 1 mL /m in,检测波长为 215 nm , 柱温 30 ℃,进样量 20μL。在此条件下 ,取裸花紫 珠供试品溶液、齐墩果酸与熊果酸对照品溶液分别 进样 ,所得色谱图见图 1A、B,齐墩果酸与熊果酸能 有效分离。 a. 齐墩果酸 (O leanolic acid) b. 熊果酸 (U rsolic acid) 图 1　齐墩果酸与熊果酸对照品 (A)、裸花紫珠 (B )的 HPLC色谱图 2. 2　供试品溶液的制备 取本品 60～65 ℃干燥 ,粉碎成粗粉 ,精密称取 约 0. 3 ～0. 5 g,置烧瓶中加乙醇 30 mL,加热回流提 取 2次 ,每次 1 h,合并乙醇提取液 ,滤过 ,滤液置蒸 发皿中 ,再以 30 mL乙醇分次洗涤药渣及滤器 ,洗 液并入蒸发皿中 ,水浴蒸干乙醇 ,残渣以石油醚 (60 ～90 ℃)浸洗 2次 ,每次 25 mL, 2 m in,倾去石油醚 , 残渣加甲醇适量多次洗涤 ,洗液定量转移至 10 mL 量瓶中 ,加甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,用 0. 45μm微孔 滤膜滤过 ,取续滤液作为供试品溶液。 2. 3　线性关系考察 2. 3. 1　齐墩果酸线性关系考察 　精密称取齐墩果 酸 8. 19 mg (纯度 99. 6% ) ,置于 25 mL量瓶中 ,加 甲醇至刻度 ,摇匀 ,得齐墩果酸对照品溶液的储备 液。精密吸取该对照品溶液的储备液 2. 5、4. 0、5. 0、715、10 mL分别置于 10 mL量瓶中 ,加甲醇稀释 至刻度 ,摇匀 ,各精密进样 20μL,按前述 HPLC条 件测定 ,以对照品溶液浓度 ( C )对峰高度 (H )进行 回归 ,回归方程为 : H = 285C - 6 712, r = 0. 999 6,结 果表明齐墩果酸在 81. 6～326. 3μg/mL ( 1. 63～ 6. 53μg)范围内呈良好的线性关系。 2. 3. 2　熊果酸线性关系考察 　精密称取熊果酸对 照品 12. 75 mg (纯度 98. 0% )于 25 mL量瓶中 ,加 甲醇至刻度 ,摇匀 ,得熊果酸对照品溶液的储备液。 精密吸取该对照品溶液的储备液 0. 6、1. 2、1. 6、 214、3. 0、3. 6 mL分别置于 5 mL量瓶中 ,加甲醇稀 释至刻度 ,摇匀 ,各精密进样 20μL,按前述 HPLC 条件测定 ,以对照品溶液浓度 (C )对峰高度 ( H )进 行回归 , 回归方程为 H = 178C - 212, r = 0. 999 7,结 果表明熊果酸在 60～360μg/mL (1. 20～7. 20μg) 范围内呈良好的线性关系。 2. 4　精密度试验 吸取同一供试品溶液依法分别重复进行 5次 测定 ,记录峰高度值测得熊果酸、齐墩果酸 5次连 续进样变异系数分别为 1. 6%、1. 6% ,表明连续进 样重复性良好。 2. 5　重现性试验 按样品测定法对同一样品分取 5份 ,同法处 理 ,分别以峰高度值计算齐墩果酸、熊果酸含量 , 结 果变异系数分别为 1. 7%、2. 2% ,表明重现性良好。 2. 6　稳定性考察 取同一供试品溶液分别在 1、4、6、8 h进行峰高 6 　海南医学院学报 Vol115 No11 Feb12009 值测定 ,测得 8 h内熊果酸峰高变异系数 RSD = 0198% ,齐墩果酸峰高变异系数 RSD = 1. 40% ,可 见供试品溶液在 8 h内稳定。 2. 7　加样回收率试验 采用 加 样 回 收 法 , 取 已 知 含 量 (熊 果 酸 7. 72 mg/g、齐墩果酸 1. 83 mg/g)的本品 ,精密称定 5份 ,每份约 0. 23 g ,分别精密加入熊果酸 1. 697 mg,齐墩果酸 0. 489 mg ,依法测定 ,回收率分别为 98111%、101. 64% , 变异系数分别为 1. 04%、 1142% ,表明本方法回收率良好。 2. 8　样品的测定 取 3个批次的裸花紫珠样品制成供试品溶液 , 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各 20μL于 液相色谱仪中 ,测得齐墩果酸、熊果酸色谱峰高度 值 ,以外标法计算其含量。3批裸花紫珠样品中齐 墩果酸与熊果酸含量测定结果见表 1。 表 1　样品测定结果 ( % , n = 3 ) 编号 齐墩果酸 熊果酸 1 0. 110 0. 415 2 0. 135 0. 443 3 0. 183 0. 772 3　讨论 本试验结果表明裸花紫珠样品中齐墩果酸与 熊果酸含量比为 1∶3～4,含量分别约占药材的 0. 1% ～0. 2%和 0. 4% ～0. 8% ,含量的不同与采收季 节有关 ,其中 1、2号样品为夏季采收 , 3号样品为秋 季采收 ,提示本品秋季采收齐墩果酸与熊果酸含量 高。 本试验所测齐墩果酸与熊果酸为抗菌、消炎、 护肝降酶的活性成分 ,测定两者的含量对控制本品 质量有实际意义 ,但 2种物质相同分子的异构体 , 化学性质相似 ,达到基线分离难度很大。经系统适 用性研究 ,上述条件下两者基本达到分离 ,分离度 1. 49,但尚未完全达到基线分离 ,由于 2种成分的色 谱峰为正常峰 ,适用以峰高计算含量。经试验以峰 高计算 2种成分含量重精密度较好 ,变异系数均小 于 118% ,而以峰面积测定则精密度均较差 ,变异系 数大于 2. 5% ,故本试验测定齐墩果酸与熊果酸两 种成分的含量 ,以峰高计算更为准确可靠。 从诸多文献及中国药典记载 ,对熊果酸的提取 多用乙醚 ,乙醚对熊果酸属于微溶 ,所以要进行多 次提取才能提取完全 ,而且 ,由于裸花紫珠的用药 部位为植物的叶 ,叶背密被厚厚的绒毛 ,质轻 ,直接 用乙醚提取 ,药材浮在液面上 ,不利提取 ,并且提取 液与药材不能自然分离 ,需要过滤 ,乙醚挥散快 ,也 需要反复洗 ,更加大了乙醚的用量 ,不经济 ;因此改 用乙醇先行回溜提取 ,就可以克服上述不足 ;乙醇 提取物挥干溶剂后 ,以石油醚洗涤 ,除去脂溶性色 素杂质 ,以减少对色谱柱的污染 ;经对石油醚提取 液进行薄层色谱检测 ,齐墩果酸与熊果酸的均呈阴 性反应。 参考文献 1　王祝年 ,韩壮. 裸花紫珠的化学成分的研究 [ J ]. 热带亚 热带植物学报 , 2007, (4) : 359 (责任编辑 　李晶 ) (上接第 4页 ) 8　Rayder L , Ting I P. CAM 2idling in Hoya carnosa (A scl2 ep idaceae) [ J ]. Photosynth Res, 1983, 4: 2032211. 9　A len Y, Nakajima S, N itoda T, et al. Antinematodal activ2 ity of some trop ical rainforest p lants against the p inewood nematode[ J ]. Z Naturforsch, 2000, 55: 2952299. 10　Kyogoku M. TypeⅠallergy, Occupational sthma, analysis ofallergens, and heposensitization focused on Hoya ( sea squirt) asthma [ J ]. Immunilogy Fronier, 1994, 4: 3872 392. 11　Jyo I, Oka S. Immmunological and chem ical structure of Hoya ( sea squirt) antigen [ J ]. Igakuno Ayum i, 1991, 159: 5652568. 12　福建中医研究所中药研究室. 福建民间草药 [M ]. 福州 :福建人民出版社 , 1959. 20221.13　南宁市中医药研究所. 南宁市药物志 [M ]. 第 2辑. 南宁 :广西人民出版社 , 1960. 15.14　李采兰. 贵州民间药物 [M ]. 贵阳 :贵州人民出版社 ,1965. 301.15　洪敏俐 ,林向前. 球兰止咳糖浆制备及临床观察 [ J ]. 时珍国医国药 , 1999, 11: 8202821.16　宋立人. 现代中药学大辞典 [M ]. 北京 :人民卫生出版社 , 2001. 1837. (责任编辑 　李晶 ) 7张艳秋等. HPLC法测定裸花紫珠中齐墩果酸与熊果酸的含量