天然类胡萝卜素生物合成与生物技术应用_王伟杰

细胞生物学杂志 Chinese Journal of Cell Biology 2006, 28: 839-843 http://www.cjcb.org 收稿日期：2006-03-02　　接受日期：2006-07-21 国家自然科学基金(No.30370989, No.30671449)、浙江省科技厅农 业重点项目资助 *通讯作者。Tel: 13216172048, E-mail: chjxu@zju.edu.cn 天然类胡萝卜素生物合成与生物技术应用 王伟杰　徐昌杰* (浙江大学园艺系，农业部园艺植物生长发育与生物技术重点开放实验室，杭州310029) 摘要　　类胡萝卜素是重要天然食用色素族群之一，它不仅可为食品添色，还具有较高营养 保健价值。类胡萝卜素广泛存在于高等植物、藻类、少数微生物和部分动物体内，但不同生物在 合成途径细节及所积累的类胡萝卜素种类方面存在较大的差异。通过优化培养条件、转基因和水 解酶辅助提取等生物技术手段提高了类胡萝卜素产量，降低了生产成本，从而使天然类胡萝卜素 制品得到更广泛的应用。 关键词　　天然食用色素；类胡萝卜素；天然来源；生物合成；生物技术 随着人们生活水平的提高，食品外观品质已成 为消费者选购食品的重要指标，因此作为食品颜色 重要来源的色素添加剂便越来越受重视。食用色素 分天然和人工合成两类，人类利用色素经历了从天 然到人工合成再逐渐回到天然的过程。天然食用色 素因为有着自然的色泽、很多种类具有抗癌保健功 效，市场前景广阔。据估计，2000年全球天然色 素贸易额达2.5亿美元[1]。 类胡萝卜素在天然食用色素中用量居第二位, 种 类众多，最常见的有胭脂树橙、藏红花色素、红 辣椒色素、番茄红素、混合胡萝卜素、万寿菊色 素、玉米黄素、虾青素和角黄素等。我国除红辣 椒色素外，其他类胡萝卜素食用色素的生产多数尚 处于空白或起步阶段。除了能为食品添色外，类胡 萝卜素天然色素还具有较高营养和保健价值，几乎 所有类胡萝卜素均有抗氧化、增强免疫力、防止紫 外线损伤、抗心血管疾病和抗癌等功能；b 胡萝卜 素和a 胡萝卜素还是VA前体；b 胡萝卜素、叶黄 质和玉米黄素对防治眼疾有着独特的功效[2~4]。因 而，对天然类胡萝卜素的来源、生物合成和生物技 术的应用等开展研究具有重要意义。 1 天然类胡萝卜素的来源 类胡萝卜素广泛存在于高等植物、藻类、少 数微生物和部分动物体内，种类繁多，目前已发现 750种[5]。 不少天然类胡萝卜素以高等植物为重要来源。 胭脂树橙来自胭脂树(Bixa orelana L.)种子[6]; 藏红花 素来自藏红花(Crocus sativus L.)柱头[7]，红辣椒色 素来自红辣椒果实；番茄红素主要来自番茄果实； 天然混合胡萝卜素主要来自棕榈油[7]; 叶黄素则以万 寿菊(Tagetes erecta L.)花瓣为主要来源[3]; 玉米黄素主 要来自玉米籽粒和枸杞(Lycium barbarum L.)果实[3]。 微藻主要用于 b 胡萝卜素和虾青素的商业生 产。目前应用杜氏藻特别是盐生杜氏藻(Dunaliella salina Teod.)生产b胡萝卜素已十分普遍[3,4,8]，应用 雨生红球藻(Haematococcus pluvialis Flot et Will)生产 虾青素已经商业化[9]，绿球藻(Chlorococcum sp. strain MA-1)在积累虾青素的同时，还能积累相当量 的角黄素[10]。 真菌主要用于 b胡萝卜素、虾青素和番茄红素 的生产。深红酵母[Rhodotorula rubra (Demme) Lodder][11]，三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora Thaxt.)[12] 和布拉克须霉(Phycomyces blakesleeanus Burgeff)[7]都 能积累较丰富的 b胡萝卜素；三孢布拉氏霉还能生 产番茄红素[12]; 由法夫酵母(Phaffia rhodozyma Miller) 生产虾青素已取得了专利[7]。 应用细菌生产的类胡萝卜素主要是虾青素和角 黄素。如盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium)的虾 青素产量达265 mg/g，富盐菌属细菌(Haloferax ale- xandrinus)的角黄素产量达2.2 mg/g[13]。此外，细 菌[尤其是欧文氏菌(Erwinia uredovora)]类胡萝卜素 合成基因被广泛应用于植物类胡萝卜素合成的遗传 调控，创造出高含量总类胡萝卜素或单一种类的植 物产品[2,14,15]。 840 ·综述· 动物不能合成类胡萝卜素，但由于某些动物以 含有类胡萝卜素的植物、藻类或真菌为食物，于是 在体内富集了类胡萝卜素，因而也成为人类获取天 然类胡萝卜素色素的又一来源，如虾青素可从虾蟹 类甲壳中提取便是典型的例子。 2 天然类胡萝卜素的生物合成途径 上文已述，细菌、真菌、微藻和高等植物均 可合成类胡萝卜素，而且不少类胡萝卜素为所有生 物所共有，但不同生物在合成途径的细节及所积累 的类胡萝卜素种类方面仍存在较大的差异。从图1 可见，细菌与酵母、霉菌的类胡萝卜素合成途径基 本一致，主要区别在于八氢番茄红素的合成和番茄 红素的环化在细菌中由两个酶(Crt B和Crt Y)负责， 而在酵母和霉菌中仅需一个双功能酶(酵母中为Crt YB，霉菌中为Car RA或Car RP)即可完成。高等 植物类胡萝卜素合成的分工相对较细，如细菌、酵 母和霉菌中仅需一个酶就可完成八氢番茄红素向番 茄红素的转化，而在植物中则需PDS、ZDS和 CRTISO三个酶共同参与(图1)。有些植物特化出特 有的类胡萝卜素合成途径，如胭脂树的降胭脂树素 和胭脂树素合成、藏红花的藏花酸和藏花素合成、 红辣椒的辣椒红素和辣椒玉红素合成均是典型的实 例(图1)。虾青素的合成在植物中十分罕见，目前 仅见侧金盏花属(Adonis)植物可积累该类胡萝卜素的 报道[16]。微藻在生物分类学上列入低等植物(图1中 的植物包括微藻)，但其类胡萝卜素合成兼具微生 物和高等植物的特点，表现在既可合成高等植物特 有的 a胡萝卜素和叶黄质，又能合成微生物普遍合 成的角黄素和虾青素(图1)。 3 生物技术在天然类胡萝卜素生产中的研 究进展 3.1 通过优化培养条件提高原材料类胡萝卜素含量 图1　天然类胡萝卜素色素的生物合成途径[2,6,15~23] A O R：醛氧化还原酶；B A D H：胭脂树素醛脱氢酶；B C H：胡萝卜素 b 环羟化酶；B K T：b 胡萝卜素转酮酶；C a r：类胡萝卜 素；CCS：辣椒红素/辣椒玉红素合成酶；Crt：类胡萝卜素；CRTISO：类胡萝卜素异构酶；ECH：胡萝卜素 e 环羟化酶；LBCY： 番茄红素 b 环化酶；L C D：番茄红素裂解双氧化酶；L E C Y：番茄红素 e 环化酶；n B M T：降胭脂树素羧基甲基转移酶；N X S： 新黄质合成酶；P D S：八氢番茄红素脱饱和酶；P S Y：八氢番茄红素合成酶；Z C D：玉米黄素裂解双氧化酶；Z D S：z 胡萝卜素 脱饱和酶；ZEP：玉米黄素环氧酶；UDPG-GT：尿嘧啶核苷二磷酸糖(UDPG)葡萄糖基转移酶。 841王伟杰等：天然类胡萝卜素生物合成与生物技术应用 选用类胡萝卜素含量较高的原材料可降低类胡 萝卜素生产的成本，同时有更多的研究工作集中于 如何通过改善生长条件提高原材料类胡萝卜素含量。 在众多培养条件中，光往往是首要考虑的因 子。合适光强和照光时间可促进微藻、真菌和细菌 类胡萝卜素合成，白光可使盐生杜氏藻 b胡萝卜素 和雨生红球藻虾青素产量均上升4倍[24]。光照一方 面通过促进培养物生长间接起作用，但更多情况下 则是由于光在转录和翻译水平上诱导了类胡萝卜素 合成酶类的活性，虽然诱导机制尚不完全清楚，但 有可能与光照下积累的活性氧有关[24]。促进类胡萝 卜素合成与促进生长的最佳光照条件有时并不完全 相同，此时需要选择合适光照条件并对影响生长的 其他因子进行优化[24]。另外, 短波长蓝光对雨生红 球藻虾青素合成具有促进作用，与营养缺乏措施 结合可使虾青素含量高达76 mg/cm3 (细胞干重的 5.2%)[25]; 紫外线可使巴德威藻(Dunaliella bardawil Ben-Amotz et Avron)总类胡萝卜素、b胡萝卜素、 叶黄质、玉米黄素和堇菜黄素含量均上升2倍以 上[26]。 温度是决定培养物生长速率的又一关键因子， 除了对生长的影响，温度对类胡萝卜素合成，尤其 是所积累的类胡萝卜素组成具有直接的作用，如低 温可使巴德威藻和粘红酵母[Rhodotorula glutinis (Fres.) Harrison]积累更高比例的b胡萝卜素[24]。温 度对类胡萝卜素总含量也有影响，但随物种不同而 有差异，如法夫酵母在低温下总类胡萝卜素含量可 提高50%而鲁氏毛霉[Mucor rouxii (Calmette) Wehmer] 和雨生红球藻则在高温下积累更多的类胡萝卜素(数 倍至十余倍)[24]。然而，这些低温和高温通常不利 于生长，同时，人为创造这些温度环境使生产成本 大大增加。 与光照和温度类似，不少环境因子对培养物生 长和类胡萝卜素含量的效应也往往相左，如雨生红 球藻在缺氧、营养胁迫和高盐浓度下藻体积累较高含 量的虾青素(达98 mg/g)，但这些条件对生长不利[27]。 因而，需要综合考虑培养物生长量和类胡萝卜素含 量确定最佳培养条件。对盐生杜氏藻的培养条件 (光、温、流速、起始接种浓度等)进行综合优化， 可使培养物干重日增80 g/m3，其中类胡萝卜素含 量达10%[8]。 化学抑制剂对类胡萝卜素合成的调控有较多研 究，其中最为人所熟知的是番茄红素 b环化酶抑制 剂可促进番茄红素的合成和积累, 但离大规模产业应 用尚有较大距离[24]。此外，重金属离子和三羧酸代 谢途径中的有机酸可刺激类胡萝卜素合成，但多数 仍停留在研究阶段[24]。 3.2 应用转基因技术提高原材料类胡萝卜素含量 多数细菌和真菌不能合成类胡萝卜素，植物类 胡萝卜素的积累具有物种特异性，但是通过转基因 技术可使本不会积累的类胡萝卜素在这些生物体内 积累，拓展了人类获取天然类胡萝卜素的来源。 通过将欧文氏菌和一种海洋细菌(Agrobacterium aurantiacum)类胡萝卜素合成基因导入大肠杆菌或酵 母使其积累类胡萝卜素已有大量报道，其中大肠杆 菌积累 b胡萝卜素或玉米黄素已高达1.5 mg/g干 重，酵母积累番茄红素和虾青素分别达7.8 mg/g干 重和0.4 mg/g干重 [14, 28]。近来, 韩国研究者将多个 类胡萝卜素合成关键基因或调控基因导入大肠杆 菌，并优化了培养条件，先后获得了菌体番茄红素 含量高达4.7 mg/g干重[29]和22 mg/g干重[30]的转基 因菌种。值得一提的是，应用基因剔除技术并结合 转基因，美国研究者通过不同的途径获得了菌体番 茄红素含量高达18 mg/g干重的菌种[31]。对这些合 成关键基因和正负调控基因进行优化组合，有望获 得更高积累量的新菌种，从而使应用大肠杆菌生产 番茄红素具有诱人的商业前景。 植物方面，法国研究者分离了藏红花素合成的 关键基因CsCCD和CsZCD[20]，为通过转基因使其 他生物合成该色素打下了基础。该研究小组同时获得 了控制胭脂树橙合成的三种关键酶基因LCD、nBMT 和BADH，通过原核表达在大肠杆菌内实现胭脂树 橙的积累。成熟番茄果实富含胭脂树橙合成的前体 番茄红素，因而将上述三个基因导入番茄可望为天 然胭脂树橙的生产提供又一种理想来源[6]。 通过转基因还打破了植物物种间积累类胡萝卜 素种类的特异性，积累辣椒红、辣椒玉红素、虾 青素和海胆紫酮的烟草、积累 b胡萝卜素的“黄金 稻米”已先后获得[14,15]。最近，“黄金稻米2”也 已问世，其类胡萝卜素含量是一代的23倍，其中 b 胡萝卜素含量达31 mg/g, 占总类胡萝卜素的84%[32]， 为黄金稻米的进一步实用化迈出了可喜的一步。 转基因技术的应用不仅可拓宽类胡萝卜素的天 然来源，同时也可大幅提高原先所积累的类胡萝卜 素的含量，后一方面的研究在植物上尤其突出。植 物产品不仅可作为天然类胡萝卜素生产的原材料， 842 ·综述· 同时本身就是食品或者食品加工的原材料，因而提 高植物类胡萝卜素含量可直接改善食品外观品质并 使食物具有更高的营养价值。 应用转基因技术已成功地获得了类胡萝卜素含 量提高50倍的油菜籽、果肉总类胡萝卜素含量提高 2~4倍的番茄、果肉 b胡萝卜素含量提高3~10倍的 番茄以及玉米黄素和总类胡萝卜素含量分别提高130 多倍及近6倍的马铃薯块茎[14,15]。后来，Ducreux 等[33]将欧文氏菌crtB基因导入马铃薯，使块茎类胡 萝卜素总量提高3~5倍，叶黄质提高19倍，b 胡 萝卜素从检测不到提高至占总类胡萝卜素的近1/3， 块茎颜色更为金黄。应用RNA 干扰技术调控类胡 萝卜素代谢也开始有成功例子，Davuluri等[34]应用 该技术成功抑制了植物光形态发生调控基因DET1 的表达，使得番茄果实番茄红素和 b胡萝卜素含量 分别提高1倍和7倍，同时黄酮类物质含量也提高 1倍以上。 3.3 天然类胡萝卜素提取工艺的新发展 提取工艺的改进使得色素产品的产量和质量都 有了很大程度的提高,其中超临界CO2萃取法和水解 酶辅助提取法极具商业价值和应用前景。超临界 CO2萃取法利用处于超临界状态(物质介于液态和气 态之间的中间状态)下的CO2流体具有强溶解能力的 特点进行类胡萝卜素的抽提，得率很高且不存在有 机溶剂残留问题，也很环保，应用十分广泛。生 物技术对类胡萝卜素提取工艺的改进也有贡献，其 中水解酶辅助提取法就是一例，该法最早应用于番 茄红素的提取。在微碱性条件(pH=7.9~9)下，番茄 自身的酶可降解番茄果汁和果肉组织中的果胶质和 纤维素，使得番茄红素易于提取[35]。采用细胞壁水 解酶和纤维素酶等多种水解酶对红辣椒果实进行处 理，然后再用酒精提取，可使类胡萝卜素得率高达 83%[36]; 应用纤维素酶和蛋白酶法提取万寿菊类胡萝 卜素，得率可达97%[37]; 应用优化方法，Navarrete- Bolanos等[38]仅需5 h即可提取万寿菊类胡萝卜素， 产率达到29.3 g/kg干重。从虾蟹壳中提取虾青素往 往效率不高，近年来德国采用酶解技术使得提取效 率得到了明显提高[39]。 4 小结与展望 食用色素包括天然和人工合成两类，尽管后者 因价格相对较低还有着它的市场，随着研究的深 入，原先使用的很多种类的人工色素都被证明有害 健康。随着人们生活水平的日益提高，食品营养与 安全问题广受重视，色素添加剂也不例外，使用天 然色素是解决这一问题的最佳。国内天然色素 需求量日趋加大，世界天然色素市场每年也有着 5%~10%增长[1]，我国天然色素产业将迎来发展壮 大的最佳时机。 我国自然生物资源丰富，天然色素的来源广 泛，但除焦糖色素，其他天然食用色素的研究和开 发利用都很落后，尤其是生产成本高的特点阻碍了 它的发展。筛选低廉原材料生产天然类胡萝卜食用 色素是一项相当重要的工作，例如，柑桔加工废弃 物尤其是果皮富含多种类胡萝卜素，但尚较少得到 利用。同时，特色材料应予充分重视，如枸杞富 含其他植物组织中较缺乏的玉米黄素[3]，而玉米黄 素正是人体眼睛必不可少的两大类胡萝卜素之一， 但目前枸杞类胡萝卜素的生产尚未形成规模。 天然类胡萝卜素生物合成途径及其调控在近几 年取得了巨大突破，不但合成主链途径已经清楚， 部分降解途径(胭脂树和藏红花色素的合成途径)也得 到阐明(图1)。同时，类胡萝卜素合成所需的骨架 物质异戊烯焦磷酸(IPP)的合成途径也逐渐为人们所 了解，酵母和霉菌的IPP来自甲羟戊酸(MVA)途 径，细菌和植物则来自2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4- 磷酸(MEP)途径[40]。将MVA途径中的关键酶基因与 欧文氏菌基因一并导入大肠杆菌，因IPP的供应能 力增强最终创造了积累番茄红素高达22 mg/g干重的 菌种[30]。植物和细菌MEP途径中的限速酶[即1-脱 氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)]也已确定，增强 DXS基因的表达可促进类胡萝卜素合成[2,29]。另 外，对影响类胡萝卜素合成的正负调控基因的研究 也开始取得进展，大肠杆菌正调控基因主要是转录 因子，而负调控基因功能缺失可提高类胡萝卜素合 成所需的前体或辅因子的含量[29,31]; 植物类胡萝卜素 合成负调控基因(DET1)也有发现[34]。然而，类胡 萝卜素合成及调控方面仍有许多问题有待进一步研 究，如多数植物阿朴类胡萝卜素形成途径尚不清 楚，对类胡萝卜素合成的调控基因及其作用机制了 解不多，植物转基因产品的类胡萝卜素含量提高倍 数比较有限；新发现的众多类胡萝卜素合成关键基 因及调控基因仍有待在细菌、酵母和霉菌中进行更 高效的组合，更多调控基因有待发现和应用等。 相信随着分子生物学研究进展和生物技术进 步，在深入理解各种天然类胡萝卜素合成代谢及其 843王伟杰等：天然类胡萝卜素生物合成与生物技术应用 调控分子机制的基础上，应用转基因技术可进一步 拓宽天然类胡萝卜素提取的原材料范围并提高其类 胡萝卜素含量，同时结合生长条件和提取技术的优 化，可降低生产成本，使天然类胡萝卜素得到更加 广泛的应用。 参考文献 (References) [1]Downham A et al. 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Key words natural food colorants; carotenoids; natural resources; biosynthetic pathways; biotechnology Received: March 2, 2006 Accepted: July 21, 2006 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30370989, No.30671449) and the Science and Technology Project of Zhejiang Province *Corresponding author. Tel: 13216172048, E-mail: chjxu@zju.edu.cn [15]朱长甫等。植物生理与分子生物学学报, 2004, 30: 609 [16]Cunningham FX et al. Plant J, 2005, 41: 478 [17]Armstrong GA. Annu Rev Microbiol, 1997, 51: 629 [18]Velayos A et al. Eur J Biochem, 2000, 267: 5509 [19]Lohr M et al. Plant Physiol, 2005, 138: 490 [20]Bouvier F et al. Plant Cell, 2003, 15: 47 [21]Jin E et al. J Microbiol Biotechnol, 2003, 13: 165 [22]Arrach N et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98: 1687 [23]Verdoes JC et al. Appl Environ Microbiol, 2003, 69: 3728 [24]Bhosale P. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 63: 351 [25]Lababpour A et al. J Biosci Bioeng, 2004, 98: 452 [26]Salguero A et al. 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