PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌

中国农业科学 2006,39(5):990-996 Scientia Agricultura Sinica 收稿日期：2005-05-30；接受日期：2006-03-07 基金项目：河北农业大学科研基金项目（2005-01） 作者简介：杨 洋，男（1979-），河北秦皇岛人，硕士研究生，研究方向为有害微生物检测与控制。Tel: 0312-7528192; E-mail: lanxingpijiu@yahoo.com.cn。 通讯作者张伟（1963-），男，河北保定人，教授，研究方向为有害微生物检测与控制。Tel:0312-7528422; E-mail:zhangwei631126@yahoo.com.cn PCR 检测乳品中金黄色葡萄球菌 杨 洋 1，张 伟 1，袁耀武 1，钟晓英 2 ，马 雯 1 （1河北农业大学食品科技学院微生物检测研究室 保定 071001；2 河北省保定市疾病预防控制中心 保定 071000 ） 摘要: 【目的】利用 PCR 技术,无需增菌，直接检测乳品中的金黄色葡萄球菌。【方法】通过溶剂提取的方法 从人工样品中提取模板，以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因（nuc）为靶基因，经过 PCR 扩增得到 279 bp 的产物。 经过 DNA 测序证实该产物为目的扩增产物。采用 PCR 方法实际检测了乳品中的金黄色葡萄球菌，同时，与国标 GB 4789.10 — 94 方法及两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌测试片 Petrifilm RSA.Count Plate 及 Baird-parker+RPF Agar 进行了比较。【结果】PCR 方法的灵敏度高，全脂乳和脱脂乳检测的检出限为 10 CFU/ml， 奶酪检测的检出限为 55 CFU/g，可在 6 h 内完成对乳品中金黄色葡萄球菌的检测，比目前普遍采用的先增菌再进 行 PCR 检测的方法缩短了 12～24 h。与国标方法相比，PCR 方法的符合率为 94.3％，敏感性为 100％。【结论】采 用溶剂提取制备模板的方法可有效的用于 PCR 直接检测(无需增菌)乳及乳制品中的金黄色葡萄球菌。 关键词：PCR；检测；乳品；金黄色葡萄球菌 Detection of Staphylococcus aureus in Dairy Products by Polymerase Chain Reaction Assay YANG Yang 1, ZHANG Wei1, YUAN Yao-wu1, ZHONG Xiao-ying2, MA Wen1 ( 1 College of Food Science and Technology, Laboratory for Microorganism Detection Agriculural University of Hebei, Baoding 071001; 2 Baoding Center for Disease Control and Prevention in Hebei Province, Baoding 071001) Abstract: 【Objective】A uniplex polymerase chain reaction(PCR) assay was developed for direct detection of Staphylococcus aureus without enrichment in dairy products. 【Method】A solvent extraction procedure was successfully modified for extraction of Staphylococcus aureus DNA from artifically contaminated whole milk, skim milk and cheese. Primer targeting the thermostable nuclease gene (nuc) was used in the uniplex PCR. A DNA fragment of 279 bp was amplified. PCR product was confirmed by DNA sequencing. In this study, the uniplex PCR, GB 4789.10–94, Perifilm RSA. Count Plate, and Baird-parker + RPF Agar were compared. 【Result】The detection limit of the uniplex PCR is 10 CFU/ml of whole milk, skim milk and 55 CFU/g cheese. The developed methodology allows detection of Staphylococcus aureus in dairy products in less than 6 h, the time of this developed PCR assay is 12-24 h less than the time of general PCR assay with enrichment method, and the coincidence rates of PCR is 94.3%, the sensitivity of PCR is 100%.【Conclusion】The solvent extraction procedure is an effective method for PCR assay of Staphylococcus aureus in milk and milk products. Key words: PCR; Detection; Dairy products; Staphylococcus aureus 0 引言 【本研究的重要意义】金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）是一种普遍存在于自然界中 的人兽共患病菌。由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食 物中毒是个世界性卫生问题，近年来，由金黄色葡萄 球菌引起的食物中毒越来越多，据美国疾病控制中心 报告，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒居第二位， 占整个细菌性食物中毒的 33%，加拿大则高达 45%。 中国每年发生此类中毒事件也非常多。金黄色葡萄球 5期 杨 洋等：PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌 991 菌作为一种重要的食源性致病菌，它对食品加工业及 人们健康存在着潜在的危害。由于传统检测方法，检 测时间长，检测程序繁琐，因此，急需建立一种快速 有效的检测方法。【前人研究进展】Wilson 等[3]利用 PCR 从脱脂乳中检测出 105CFU/ml 的金黄色葡萄球 菌，但灵敏度（105CFU/ml）较低，其原因可能 是由于提取的 DNA 中含有 PCR 反应干扰因子。 Brakstad 等[4]利用 PCR扩增金黄色葡萄球菌的 nuc基 因来检测营养肉汤培养基中的金黄色葡萄球菌，灵敏 度达到 10CFU/ml，但从血样品中提取金黄色葡萄球菌 的 DNA进行扩增时，其灵敏度降为 103CFU/ml。这可 能是从血样品提取的 DNA中含有 PCR反应干扰因子 所致。食品的成分极为复杂，有些成分干扰 PCR反应， 可导致 PCR检测灵敏度的下降。其中脂肪成分被认为 是降低PCR检测灵敏度的主要因素之一[5]。Mclauchlin 等[6]报道从奶酪中提取的 DNA 中含有 PCR 反应干扰 因子，影响 PCR检测。【本研究切入点】以上研究均 不能有效的消除 PCR反应干扰因子，制备出高纯度的 模板。乳及乳制品中的抑制因子主要为脂肪、金属离 子、蛋白质等。所以如何有效消除干扰因子，成为试 验的关键[5]。【拟解决的关键问题】因而本研究采用 溶剂提取的方法来消除脂肪等因素的抑制作用，制备 出高纯度的模板，以耐热核酸酶的基因 nuc 为靶序 列[1, 3, 4, 9]，进行 PCR扩增，从而达到快速检测（无需 增菌）的目的。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种及其来源 菌种接种于营养肉汤培养基 中，37℃，振荡过夜培养至菌悬液浓度达到 109CFU/ml （表 1）。 表 1 供试菌种及其来源 Table 1 The bacteria used in experiment 编号 No. 菌种 Bacteria 来源 Source 1 表皮葡萄球菌 Staphylococcus epidermids－ATCC26069 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 2 木糖葡萄球菌 Staphylococcus xylosus－ ATCC29971 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 3 白色葡萄球菌 Staphylococcus albus－1.184 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 4 中间葡萄球菌 Staphylococcus intermedius－1109 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 5 大肠杆菌 Escherichia coli－ATCC25922 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 6 大肠杆菌 E.coli－ATCC35401 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 7 伤寒杆菌 Salmonella typhimurium－ATCC14028 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 8 伤寒杆菌 Salmonella typhimurium－5007-1 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 9 痢疾志贺氏菌 Shigella dysenteriae－1.1869 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 10 弗氏志贺氏菌 Shigella flexneri－1.1868 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 11 鲍氏志贺氏菌 Shigella boydii－ATCC9209 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 12 宋内氏志贺氏菌 Shigella sonnei－ATCC9290 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 13 甲型溶血性链球菌 Streptococcus hemolytis-α－32205 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 14 乙型溶血性链球菌 Streptococcus hemolytis-β－32204 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 15 单核增生李斯特氏菌 Listeria monocytogenes－ATCC35152 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 16 单核增生李斯特氏菌 Listeria monocytogenes－ATCC35152 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 17 蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus－ATCC11778 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 18 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis－ATCC6051 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 19 小肠结肠炎耶尔森氏菌 Yersinia enterocolitica－52001 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 20 副溶血性弧菌 Vibrio parahaemolyticus－20001 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 21 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus－ATCC6538 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 22 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus－ATCC6538 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 23 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus－1.800 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 24 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus－1.1476 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 25 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus－26003-21 中国医学细菌保藏管理中心 CMCC 26 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus－ATCC25923 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 27 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus－ATCC13565 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 28 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus－ATCC14458 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 29 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus－ATCC8095 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC 30 另有 52株金黄色葡萄球菌 Fifty-two strains of Staphylococcus aureus本实验室保存 Laboratory for Microorganism Detection Agriculural University of Hebei CGMCC: China General Microbiological Culture Collectio Center; CMCC：China Medical Culture Collection Center 992 中 国 农 业 科 学 39卷 1.1.2 培养基 营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、 Baird-Parker培养基，购自北京市陆桥技术有限公司； Petrifilm RSA. Count Plate 购自美国 3M 公司； Baird-parker+RPF Agar 购自法国梅里埃公司。 1.1.3 乳制品 全脂乳、脱脂乳和奶酪均购自当地超 市。 1.1.4 仪器及试剂 10×PCR buffer、dNTPs、 TaKaRa Taq、DNA Marker DL2000，购自大连宝生物 公司；引物（正向引物,反向引物）由大连宝生物 工程公司合成；溶葡萄球菌酶购自上海高科技术有限 公司；无水乙醇、石油醚、氯仿、氨水、糖原均为国 产分析纯产品。 PCR仪为Whatman T Gradient基因扩增仪，电泳 仪为北京市六一厂生产 DXY-33A 型电泳仪，凝胶成 像系统为华粤企业集团有限公司 UVIpro 凝胶成像系 统。 1.2 方法 1.2.1 乳制品人工污染 在人工污染金黄色葡萄球 菌前，全脂乳、脱脂乳和奶酪均按国标法检测证实不 含有金黄色葡萄球菌。（1）将金黄色葡萄球菌人工污 染到全脂乳和脱脂乳中，使样品中金黄色葡萄球菌的 浓度依次为 100、101、102、103、104、105、106、107、 108CFU/ml，直接提取人工污染脱脂乳和全脂乳中金 黄色葡萄球菌的 DNA。（2）奶酪人工污染金黄色葡 萄球菌的方法为：取 20 g奶酪在研钵中磨碎，加入 40 ℃ 2%柠檬酸钠 90 ml 混匀制成均质液，然后对奶酪 均质液人工污染的浓度依次为 100、101、102、103、 104、105、106、107、108CFU/ml，直接提取奶酪均质 液中金黄色葡萄球菌的 DNA。 1.2.2 DNA提取[10] 步骤如下：（1）将 1 ml无水 乙醇、1 ml氨水和 1 ml石油醚分别加入到 5 ml人工 污染金黄色葡萄球菌的全脂乳、脱脂乳和奶酪均质液 中，混匀。 （2）混合物以 12 000×g，离心 10 min。弃去上 清液，沉淀用 300 µl 10 mmol·L-1 TE（pH 7.8）溶解后， 加入 5 µl 10 mg·ml-1溶葡萄球菌酶，37℃温育 1 h，期 间不断剧烈振荡。然后加入 50 µl 10%的 SDS，煮沸 5 min。 （3）将等体积的氯仿加入上述混合液中，充分振 荡混匀，17 000×g 离心 10 min，弃沉淀，保留上清 液。 （4）将上清液移入一新的离心管中，用 0.1倍体 积 2.5 mol·L-1乙酸铵（pH 5.4），2.5倍体积预冷无水 乙醇和 5 µl 10 mg·ml-1糖原沉淀 DNA，混合物 17 000 ×g，离心 20 min。DNA沉淀干燥后用 100 µl灭菌双 蒸水溶解，备用。 1.2.3 PCR 引物序列引自文献[1, 4]，由大连宝生 物公司合成。正向引物： 5′-GCGATTGATGGTG ATACGGTT-3′，目的扩增产物大小为 279 bp；反向引 物：5′-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3′。 PCR 反应体系：总反应体系 50 µl。包括 5 µl 10×PCR buffer，4 µl dNTPs混合物，0.5 µl 40 µmol正 向引物，0.5 µl 40 µmol反向引物，0.25 µl（5 U·µl-1） Taq，模板 2 µl，水 37.75 µl。PCR扩增程序：PCR反 应采用冷启动。94℃预变性 4 min，再按 94℃1 min→52℃0.5 min→72℃1.5 min进行 35个循环，最后 72℃延伸 3.5 min。电泳检测：取 5 µl PCR产物在 2% 琼脂糖凝胶上进行电泳，利用凝胶成像系统观察结果 并成像。PCR产物鉴定：大连宝生物工程公司对 PCR 扩增产物进行 DNA测序。 1.2.4 PCR 方法与其它快速检测金黄色葡萄球菌方 法比较 （1）本研究利用 PCR 直接检测乳品中金黄 色葡萄球菌方法与两种快速检测致病性金黄色葡萄球 菌的培养基及 GB 4789.10–94 方法进行比较，确定 PCR直接检测乳品中金黄色葡萄球菌方法的特异性、 符合率、灵敏度。（2）所采用的两种快速检测致病性 金黄色葡萄球菌的培养基分别为：Petrifilm RSA.Count Plate是由美国 3M公司生产的薄膜型快速检测金黄色 葡萄葡萄球菌的计数平板；Baird-parker+RPF Agar 是 由法国梅里埃公司研制生产的 Baird-parker 琼脂加兔 血浆纤维蛋白原的金黄色葡萄球菌检测计数平板。这 两种快速检测培养基的接种方法均按生产商所提供的 使用说明进行操作。共检测乳品 35 件，其中鲜牛奶 20件、UHT灭菌乳 5件、奶粉 5件、奶酪 5件。将 4 种检测方法作对比，确定 PCR直接检测乳品中金黄色 葡萄球菌方法的符合率、敏感性。计算公式分别为： 敏感性=真阳性数/（真阳性数+假阴性数） 符合率=（真阳性数+真阴性数）/被检总数 2 结果与分析 2.1 引物特异性 从所有供试菌株中提取 DNA进行 PCR扩增检测 引物特异性（图 1）。由图 1 可知，只有金黄色葡萄 球菌才可特异扩增出靶基因，其余菌种均未扩增出任 何产物。因此该引物特异性强，可用于 PCR检测金黄 色葡萄球菌。 5期 杨 洋等：PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌 993 A：1. 表皮葡萄球菌; 2. 木糖葡萄球菌; 3. 白色葡萄球菌; 4. 中间葡萄球菌; 5. 大肠杆菌; 6. 大肠杆菌; 7. 伤寒杆菌; 8. 伤寒杆菌; 9. 痢疾志贺氏菌; 10. 阴性对照; 11. 金黄色葡萄球菌; 12. 阳性对照; 13. DNA Marker 2000; 14. 弗氏志贺氏菌; 15. 鲍氏志贺氏菌; 16. 宋内氏志贺氏菌; 17. 甲型溶血性链 球菌; 18. 乙型溶血性链球菌; 19. 单核增生李斯特氏菌; 20. 单核增生李斯特氏菌; 21. 蜡样芽孢杆菌; 22. 枯草芽孢杆菌; 23. 小肠结肠炎耶尔森氏菌; 24. 副溶血性弧菌. B：1. Marker DL 2000；2～21. 金黄色葡萄球菌；22. 阴性对照；23. 阳性对照；24. Marker DL 2000. C：1. Marker DL 2000 ；2～ 21. 金黄色葡萄球菌；22. 阴性对照；23. 阳性对照；24. Marker DL 2000. D：1～9. 为金黄色葡萄球菌;10. 阴性对照; 11. 阳性对照; 12. Marker DL 2000; 13～23. 为金黄色葡萄球菌 A: 1. Staphylococcus epidermids；2. Staphylococcus xylosus；3. Staphylococcus albus；4. Staphylococcus intermedius；5. Escherichia coli；6. Escherichia coli； 7. Salmonella typhimurium；8. Salmonella typhimurium；9. Shigella dysenteriae；10. Negative control；11. Staphylococcus aureus；12. Positive control ； 13. Marker DL 2000；14. Shigella flexneri；15. Shigella boydii；16. Shigella sonnei；17. Streptococcus hemolytic-α；18. Streptococcus hemolytis-β；19. Listeria monocytogenes；20. Listeria monocytogenes；21. Bacillus cereus； 22. Bacillus subtilis；23. Yersinia enterocolitica；24. Vibrio parahaemolyticus. B: 1. Marker DL 2000; 2-21. Staphylococcus aureus; 22. Negative control; 23. Positive control; 24. Marker DL 2000. C: 1. Marker DL 2000； 2-21. Staphylococcus aureus； 22. Negative control；23. Positive control；24. Marker DL 2000. D: 1-9 .Staphylococcus aureus; 10. Negative control; 11. Positive control; 12. Marker DL 2000; 13-23. Staphylococcus aureus 图 1 金黄色葡萄球菌和非金黄色葡萄球菌 PCR 反应结果 Fig. 1 The detection result of Staphylococcus aureus and non-Staphylococcus aureus by PCR 2.2 PCR 检测乳品中人工污染的金黄色葡萄球菌 由图 2可知，除了含 100CFU/ml金黄色葡萄球菌 的全脂乳、脱脂乳、奶酪均质液样品外，其它人工污 染的样品（含 101～108CFU/ml金黄色葡萄球菌）均成 功检测出了金黄色葡萄球菌。由于奶酪中脂肪含量比 较高，采用本方法虽可移除大部分的抑制因子，但可 能仍有少量抑制因子存在，影响了 PCR 扩增，所以 图 2-C的电泳带不甚清晰。 由表 2 可知，全脂乳和脱脂乳的检出限为 10 CFU/ml，奶酪均质液的检出限为 10 CFU/ml。因为本 试验将 20 g奶酪经研磨后与 90 ml的 2%柠檬酸钠溶 液混合成 110 ml的奶酪均质液，进行人工污染，然后 进行 PCR检测。因此，经换算奶酪中金黄色葡萄球菌 的检出限为 55 CFU/g（10 CFU/ml×110 ml/20 g）。 表 2 人工污染后乳及乳制品中 PCR 检测金黄色葡萄球菌的检出限 Table 2 The lower detection limit of Staphylococcus aureus in dairy products after artificially contaminated by PCR 菌的浓度 Concentration (CFU/ml) 样品 Samples 108 107 106 105 104 103 102 101 100 全脂乳 Whole milk + + + + + + + + - 脱脂乳 Skim milk + + + + + + + + - 奶酪均质液 Cheese + + + + + + + + - + 表示 PCR检测结果阳性；- 表示 PCR检测结果阴性 + The detectionresult of PCR was positive; - The detectionresult of PCR was negative 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 A B D C 994 中 国 农 业 科 学 39卷 1. Marker DL2 000；2. 阳性对照；3. 阴性对照；4～12. 为金黄色葡萄球菌浓度分别为 108～100CFU/ml的全脂乳 PCR检测结果；13～21. 金黄色葡 萄球菌浓度分别为 108～100CFU/ml的脱脂乳 PCR；22～30. 金黄色葡萄球菌浓度分别为 108～100CFU/g的奶酪 PCR检测结果 1. Marker DL2000；2. Positive control；3. Negative control；the concentration of Staphylococcus aureus from lane 4 to lane 12 is 108 CFU/ml to 100CFU/ml respectively；The concentration of Staphylococcus aureus from lane 13 to lane 21 is 108 CFU/ml to 100 CFU/ml respectively；The concentration of Staphylococcus aureus from lane 22 to lane 30 is 108 CFU/g to 100 CFU/g respectively 图 2 人工污染的全脂乳（A）、脱脂乳（B）、奶酪均质液(C)中金黄色葡萄球菌 PCR 检测结果 Fig. 2 The detected result of Staphylococcus aureus by PCR in artifically contaminated whole milk (A) , skim milk (B) and cheese (C) 2.3 PCR 产物鉴定 大连宝生物工程公司对 PCR 扩增产物进行 DNA 测序。通过序列测定可知，PCR 扩增产物 DNA 序列 与文献报道[11]的靶基因序列的同源性达 99.6%，从而 证实 PCR扩增产物确为目的扩增产物（数据略）。 2.4 PCR 方法与其它检测金黄色葡萄球菌方法比较 为了验证本检测方法对实际乳品检测的效果，本 研究检测了从超市购买的 UHT 灭菌乳、奶粉、奶酪 和鲜牛奶等样品，共计 35件。该检测方法同时与 GB 4789.10—94 方法及两种快速检测致病性金黄色葡萄 球菌测试片比较。检测结果（表 3）表明，PCR 方法 的敏感性为 100%，符合率为 94.3%；Petrfilm RSA. Count Plate方法的敏感性为 100%，符合率为 97.1%； Baird-parker+RPF Agar方法的敏感性为 100%，符合率 为 97.1%。PCR方法与 Petrfilm RSA. Count Plate方法 和 Baird-parker+RPF Agar方法的敏感性相同，检出率 均高于这两种方法，但符合率略低于这两种方法，分 析其原因可能是因为 PCR方法灵敏度高，且有时不能 区分样品中的死菌与活菌所致。 表 3 PCR 方法敏感性、特异性、符合率 Table 3 The sensitivity, specificity, and coincidence rates of PCR PCR Petrfilm RSA. Count Plate Baird-Parker + RPF Agar 国标法 Cultivation method样品 Samples 总数 Total + － + － + － + － 鲜牛奶 Milk 20 20 0 20 0 20 0 20 0 UHT乳 UHT milk 5 1 4 0 5 0 5 0 5 奶粉 Powdered milk 5 0 5 0 5 0 5 0 5 奶酪 Cheese 5 1 4 1 4 1 4 0 5 合计 Total 35 22 13 21 14 21 14 20 15 检出率 Detection rate (% ) 62.9 60 60 57.1 敏感性 Sensitivity (%) 100 100 100 符合率 Accordance rate (%) 94.3 97.1 97.1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 279 bp 21 20 19 18 17 16 15 14 13 3 2 1 30 29 28 27 26 25 24 23 22 3 2 1 279 bp C A 279 bp B 5期 杨 洋等：PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌 995 Petrfilm RSA. Count plate 及 Baird-parker+RPF Agar都在样品接种后 28～30 h观察结果，不必再做证 实试验，而 Baird-parker Agar检测，须在接种后 48 h 观察平板，并挑取可疑菌落转到营养肉汤中，再经 18～24 h后做血浆凝固酶或耐热 DNA酶试验进行证 实，前后须 80 h。美国 3M公司生产的 Petrifilm RSA. Count Plate 培养基和法国梅利埃公司生产的 Baird-Parker +RPF Agar 培养基检测乳品中的金黄色 葡萄球菌，与国标检测方法相比，时间可缩短一半， 但检测时间仍然较长。而 PCR方法从对样品的处理到 检测结束约需 6 h，大大缩短了检测时间，该方法对于 检测乳及乳制品中金黄色葡萄球菌是一种快速、有效 的方法。该方法省略了样品前增菌的过程，比目前采 用的先增菌再进行 PCR检测的方法，检测时间可缩短 12～24 h。更加符合快速检测的要求。 3 讨论 食品的成分极为复杂，有些成分为 PCR 反应抑 制因子，可导致 PCR检测灵敏度的下降。食品中的脂 肪成分被认为是降低 PCR 检测灵敏度的主要因素之 一 [5]。Wilson 等 [3]利用 PCR 从脱脂乳中检测出 105CFU/ml 的金黄色葡萄球菌，灵敏度较低，可能是 由于提取的DNA中含有 PCR反应抑制因子或是 PCR 反应条件没有优化到最佳所致。Mclauchlin 等[6]报道 从奶酪中提取的 DNA中含有 PCR反应抑制因子，影 响 PCR检测。Lantzetal等[7]利用多重 PCR技术检测猪 肉样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌，该方法对样品进行 增菌后，使检测灵敏度达到 102CFU/ml。Jinneman 等[8]利用多重 PCR扩增技术检测原料奶、牛肉等样品 中 E coli O157:H7的 DNA，也是利用增菌来提高检测的 灵敏度。虽然增菌提高了检测灵敏度，但也延长了检 测时间，一般可延长 12～24 h。 本研究无需增菌，直接从污染金黄色葡萄球菌的 乳品中提取 DNA，利用 PCR 技术对金黄色葡萄球菌 的 nuc基因进行扩增来检测该菌。该方法可直接从人 工污染的全脂奶、脱脂奶和奶酪中检测出金黄色葡萄 球菌，全脂奶检出限为 10 CFU/ml、脱脂奶检出限亦 为 10 CFU/ml、奶酪的最低检出限 55 CFU/g，整个检 测过程可在 6 h内完成，比目前普遍采用的先增菌再 进行 PCR检测的方法缩短了 12～24 h。其检测灵敏度 远高于导致食物中毒所需的金黄色葡萄球菌数[12]。该 方法对于检测乳及乳制品中金黄色葡萄球菌是一种快 速、有效的方法。而且还可以用来监测 HACCP 的危 害分析关键控制点，以监控在牛奶的收集过程以及产 品加工后金黄色葡萄球菌的污染情况。但在对实际样 品检测中还无法区分样品中的死菌与活菌，且需要专 门的仪器设备和专业人员操作。此外在推广 PCR方法 时还应尽量完善 PCR检测方法的标准，便于其推广使 用。 4 结论 4.1 本研究采用的DNA提取方法先用溶剂除去脂肪 等抑制因子，然后用溶菌酶和裂解细胞，采用醋酸铵、 冷乙醇和糖原沉淀核酸，可高效地从乳制品中提取金 黄色葡萄球菌的 DNA。 4.2 本研究利用 PCR 技术可直接检测乳制品中的金 黄色葡萄球菌，灵敏度高，全脂乳和脱脂乳检测的检 出限为 10 CFU/ml，奶酪检测的检出限为 55 CFU/g，可 在 6 h内完成对乳品中金黄色葡萄球菌的检测，比目 前普遍采用的先增菌再进行 PCR 检测的方法缩短了 12～24 h。 4.3 本研究建立的 PCR 检测方法与国标方法相比， 敏感性为 100%，符合率为 94.3%。 References [1] Kim C H, Khan M, Morin D E, Hurley W L, Tripathy D N, Kehrli M J, Oluoch A O, Kakoma I. 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