口蹄疫病毒P1_2A基因真核表达载体的构建_龚真莉

口蹄疫病毒 P1+ 2A 基因真核表达载体的构建 龚真莉1, 2 ,刘湘涛2 ,刘 磊1 ,尚佑军2 ,尹双辉2 ,田 宏2 ,郑海学2 ,陈国栋2 ( 1. 甘肃农业大学动物医学院,甘肃 兰州 730070; 2. 中国农业科学院兰州兽医研究所, 甘肃 兰州 730046) 摘要: 通过 RT- PCR方法获得了口蹄疫病毒 O型, 编号为 OF3 毒的 P1+ 2A 区的目的基因,并将其克隆到克隆载 体 pMD18- T 上,再根据表达载体 pQE- Tr isystem 的特性及酶切位点合适的表达引物. 由表达引物通过 PCR 技 术从克隆载体上扩增出带有特定酶切位点的目的片段,再对载体和目的片段进行酶切处理,处理后由 T4 DNA 连接酶将 二者连接. 通过 PCR 及酶切鉴定,结果证明口蹄疫病毒目的基因片段已被正确克隆到表达载体 pQE- T risy st em 上. 关键词: 口蹄疫病毒; P1+ 2A 基因; pQE- T risy stem 中图分类号: Q 785 文献标识码: A 文章编号: 1003-4315( 2006) 01-0008-04 Construct ion of eukaryon expression vectors for P1+ 2A genes of foot-and-mouth disease virus GONG Zhen-li 1, 2 , L IU Xiang- tao 2 , LIU Lei 1 , SH ANG You-jun 2 , YIN Shuang-hui 2 T IAN Hong2 , ZHENG Ha-i xue2 , CHEN Guo-dong 2 ( 1. Colleg e of Veterinar y Medicine, Gansu Ag r icultural Universit y, L anzhou 730070; 2. Lanzhou Veterinar y Research Insist ute, Chinese Academy o f Ag ricultural science, Lanzhou 730046, China) Abstract: T he ant igen DNA fragments of FMDV P1+ 2A genes w ere obtained through RT-PCR meth- od. Then the f ragments w ere cloned into the cloning vectors, pMD18-T vectors. Due to the char acteristic of the eu-expression vector, pQE-Trisystem, and its enzyme sites, the appropriate primers w er e designed. U- sing the expression primers cloned the aimed DNA fragements w hich contain the r ight enzyme sites w ere amplif ied. T he expression vectors and the aimed fragements w ere digested respect ively, and then, they w ere ligated by the T 4 DNA lig atease. T hr ough PCR, rest rict ion analysis and DNA sequencing, the po sit iv e clo- ning plasm id pQE+ P12A was found. Key words: foot-and-mouth disease virus; P1+ 2A gene; pQE-Trisystem 口蹄疫( fo ot-and- mouth disease, FMD)是由口 蹄疫病毒( fo od and mouth disease virus, FMDV)引 起的偶蹄动物急性、高度接触性传染病,被国际兽疫 局列为 A 类传染病之首,严重危害畜牧业的生产, 是世界各国检疫和防疫的重点对象.多年来, 许多国 家为了预防和控制该病, 都投入了大量人力、物力和 财力,然而该病仍在世界范围内广泛流行[ 1~ 5] . FM DV是小RNA病毒科FMDV病毒属的成员 , 其 作者简介: 龚真莉( 1981- ) ,女,甘肃兰州人,在读硕士研究生,主要 研究方向为病毒分子生物学. E - mail: gongzhl i@ tom. com 资助基金: 国家 863高技术研究发展( 2003AA241110) . 通讯作者: 刘湘涛( 1962- ) ,男, 湖南衡阳人,主要从事动物病毒学 研究. E- mail: hnx iangtao@ hotmail . com 收稿日期: 2005- 08- 24 基因组为单股正链 RNA, 约有 8 500 个核苷酸, 其 中只有 1 个开放阅读框 P1区编码病毒的前体聚蛋 白.前体聚蛋白经裂解可形成 4 种结构蛋白( VP1、 VP2、VP3、VP 4 ) , 其中, VP 1 和 VP 3 是主要免疫性 抗原, VP 2 和 VP4 是对免疫有一定辅助作用的酶. 早期的研究表明, 结构蛋白 VP1 是诱导中和抗体的 主要成分,它暴露在病毒颗粒的表面,对胰蛋白酶敏 感,经胰蛋白酶处理的病毒粒子可失去对感细胞的 感染性.近年来, 随着研究的深入, 已经明确了 VP1 上有 3个保守的氨基酸序列( RGD) , 它具有与细胞 受体结合的主要功能, 是病毒感染细胞的关键[ 1, 2] . VP1 基因变异率最高,且 VP1 基因中关键氨基酸的 点突变可以改变病毒的抗原性. 该高变区不仅 对 FMDV遗传变异有指导意义,而且对新型疫苗的 2006 年 2 月 第 1期 8~ 11 甘 肃 农 业 大 学 学 报 JOURNAL OF GANSU AGRICULTURAL UNIVERSITY 第 4 1 卷 双 月 刊 研制及疾病的预防和控制也很重要. 因此, 多年来, 在 FMD 分子流行病学调查、疫源的追踪、毒株分 型、基因苗的研制、诊断方法的建立等领域, VP1 基因均得到众多研究人员的关注[ 6~ 1 4] . 尽管衣壳蛋白中仅 VP1 能诱导动物产生中和 抗体,但 VP1、VP2、VP3、VP4 这 4种结构多肽都具 有免疫原性. P 1编码区决定着病毒的抗原性和血清 型,是研究分子流行病学、毒株演化关系和基因工程 疫苗的基础[ 6, 8, 11] . 本研究旨在利用反转录 PCR ( RT - PCR) 技 术,扩增得到 FMDV 流行毒株的 P1+ 2A 区的基因 片段,构建其真核表达载体,获得重组质粒 pQE- T ( QY- P12A) ,并进一步在真核细胞( BHK - 21)中 高效表达口蹄疫病毒结构蛋白和部分非结构蛋白, 为研制口蹄疫基因工程疫苗奠定基础. 1 材料与方法 1. 1 毒种 FMDV- OF3( 1999)由本试验室保存. 1. 2 载体及菌种 克隆载体 pMD18- T 购自大连宝生物公司, JM 109菌株由本保存.表达载体 pQE- Tr-i system 和 M15菌株购自美国 QIAGEN公司. 1. 3 主要试剂 限制酶、T 4 DNA 连接酶购自美国 Promega 公 司, RNA 提取试剂盒购自美国 QIAGEN 公司, AM V 反转录酶, Taq 酶, DNA 凝胶回收试剂盒均 购于大连宝生物工程有限公司, 其他试剂均为分析 纯试剂. 1. 4 引物设计和合成 参考国外已发表的 FMDV 基因序列进行设计, 构建克隆载体的引物序列如下: P1 5. GGAATGGAAAGCCAAGGT T CA 3. P3 5. AAGT TCGCCCTA ACGT CGGAGA A 3. P4 5. GACAT GT CCTCCTGCATCT GGT T- GA 3. 根据表达载体的酶切位点设计的引物序列为: P12A - exp - up 5. AGTGAAT TCCACCA T- GGGAGCCGGACAAT CCAGT C3. P12A - exp- low 5. T AAGGT ACCAGGGT- T GGACT CCACGT3. 其中 P12A- exp- up5. 端加有 Eco RI 酶切位 点(下划线处) , P12A- exp- low 5. 端加有 K pn I 酶 切位点(下划线处) .引物均由大连宝生物公司合成. 1. 5 FMDV RNA的提取 按 QIAGEN公司的 RNA 提取试剂盒说明,从 乳鼠传代的 MF3组织毒中提取. 1. 6 目的基因的获得 将提取的总 RNA 用引物 P4 , 在 AMV 反转录 酶的作用下于 42 e 反转录 1~ 2 h, 制备 cDNA. 以 cDNA 为模板, P 1 , P3 为引物扩增出 P12A 基因.扩增条件为: 95 e 5 m in; 94 e 1 min; 55 e 1 m in; 72 e 2 m in. 30个循环后 72 e 延伸 10 min. PCR产物用 1 %的琼脂糖凝胶电泳鉴定. 1. 7 克隆载体的构建 片段鉴定 PCR 产物中大小符合的 DNA 片段 经胶回收试剂盒回收目的基因, 将获得的目的基因 片段直接连入 pMD18- T 载体并转化 JM 109感受 肽细菌.经蓝白斑筛选挑选白斑, 以酶切和 PCR方 法鉴定阳性克隆, 并送去宝生物公司测序. 1. 8 表达重组载体的构建 将测序结果正确的重组质粒分别用两条表达引 物进行 PCR扩增,回收后得到的目的基因 P12A 经 Eco RI 和 K pn I双酶切.并用同样的酶双酶切表达 载体,使其形成线性化的载体. 使用 T4 DNA 连接 酶对上述酶切产物 P12A 和 pQE- Tr isystem 进行 粘端连接.按产品说明及要求的方法将连接产物转 化 M15细菌,在含有卡那霉素( 25 mg/ mL)和氨苄 青霉素( 100 mg/ mL)抗性的 LB 平板上筛选, 挑选 克隆后, 摇菌过夜培养, 提取质粒. 采用 PCR、酶切 等方法鉴定, 得到阳性重组质粒, 命名为 pQE+ P12A. 2 结果 2. 1 病毒基因组的 RT - PCR扩增 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳, 得到大约 2 250 bp左右的条带, 与预期一致.如图 1(第 1泳道) . 2. 2 P12A基因的 PCR扩增、转化与鉴定 将 PCR扩增的基因片段经胶回收纯化,并克隆 至 pMD18- T 载体, JM 109感受肽细胞转化,经筛 选获得一株阳性重组质粒.以阳性克隆重组质粒为 模板,用 P1、P 2 引物, 扩增 P12A 基因片段,琼脂糖 凝胶电泳,可见约 2 250 bp 条带(图 1, 第 3泳道) , 与预期结果一致. 并用载体一端的酶 Eco R I 酶切 电泳鉴定, 获得片段大小符合的条带( 5 000 bp 左 右) (图 2, 第 1 泳道) . 后经测序证明获得了目的基 9第 1 期 龚真莉等: 口蹄疫病毒 P1+ 2A 基因真核表达载体的构建 因. 2. 3 表达重组载体的鉴定 将获得的重组表达载体进行 PCR扩增,扩增产 物经电泳得一条约 2 250 bp的特异性条带(图 2, 第 4泳道) .以 Eco R I 单酶切,电泳得约 8 000 bp条带 (图 2,第 3泳道) ,以 Eco R I, Kp n I 双酶切,电泳可 得目的基因(约 2 250 bp)及载体(约 5 800 bp)的条 带(图 2,第 2泳道) .证明重组真核表达载体已成功 构建. 图 1 扩增产物 图 2 P12A基因重组质粒的 PCR 鉴定和酶切鉴定 Fig . 1 Agarose gel electrop ho resis of F ig . 2 Rest riction analysis and PCR identification PCR products of r ecombinant plasmids contain the P12A gene 注: M 1 : DN A Marker DL2 000 M 1: DNA Marker KE co T 14 I digest ; M 2 : DNA Marker DL15 000 3 讨论 目前世界大多数国家(包括我国)采用灭活疫苗 接种来预防 FMD, 并证明是有效可行的, 但这些传 统疫苗具有热不稳定, 仅能诱导血清型特异性免疫 反应, 保护效力短及为保证生产和运输中的安全而 造成的高成本等缺点, 尤其是近年来欧洲口蹄疫的 爆发可能与疫苗中未完全灭活的病毒或病毒从疫苗 生产地逃逸有关 [ 10, 12] .因此, 世界各国的研究者正着 力于研制更为安全有效的新型疫苗, 其中包括基因 工程亚单位疫苗、可食疫苗、合成肽苗、蛋白质载体 疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗等,虽然 各种新型疫苗都有其优缺点,且取得了许多成果,但 在免疫效力和生产投资方面与常规疫苗相比仍存在 很多的不足,尽管如此,由于新型疫苗的安全性远胜 于常规疫苗, 所以研制和应用新型疫苗仍是今后口 蹄疫研究和防治的重要内容.近年来,随着分子生物 学技术的飞速发展, FMD基因工程疫苗不断涌现, 取得了一些喜人的进展. 我国在这方面的研究尚处 于起步阶段,还没有研发出理想的 FMD 新型疫苗. 目前已有外源基因在原核细胞中的表达成功的例 子, 但是许多在细菌中合成的外源蛋白或因折叠方 式不正确,或因折叠效率低下,使得外源蛋白的活性 都比较低.由于存在以上种种困难, 发展在哺乳动物 细胞中表达外源基因的方法就应运而生, 而利用病 毒作为载体表达外源基因又是一种新的思路, 它不 但克服了这一缺点而且可使外源基因在哺乳动物细 胞中得到高效表达, 表达产物的理化和生物学特性 与天然产物相似, 且表达量高, 细胞培养简单, 适合 规模化生产.因此,近年来越来越多的研究人员开始 关注真核表达载体系统, 并取得了理想的结果.目前 国际上已有利用病毒载体研制成功的亚单位疫苗, 效果十分理想, 国内也正在开展这方面的研 究[ 6, 13, 14] . 本实验所选用的表达载体位 pQE- Tr iSy stem 载体,它源于杆状病毒,是一种重组蛋白在昆虫细胞 中表达的稳定的穿梭载体, 其中含有一个 T5 启动 子、一个 CMV 启动子(它可以增强和介导早期细胞 融合反应)、一个 p10启动子和一个终止密码子, 一 个 LA C操纵子, 一个 RBS(核糖体结合位点)和一个 组氨酸标记,这不仅利于表达产物的筛选, 并且可以 在哺乳动物, 大肠杆菌和杆状病毒感染的昆虫细胞 中表达 6组氨酸标签蛋白,利于病毒抗原蛋白的纯 化及筛选.初步研究可以在细菌的表达系统中进行, 10 甘 肃 农 业 大 学 学 报 2006 年 使用强 T5启动子, 它可以被 E. col i聚合酶所识别, 可在任何 E. coli菌株中进行蛋白的有效表达.如需 在哺乳动物或是昆虫细胞中表达, 例如获取翻译后 修饰, 可以使用同样的构建质粒而无需进行耗时的 亚克隆操作,它的多克隆位点上包括了 20种常用的 酶, 有利于目的片段的插入. 载体本身具有氨苄抗 性,用于对阳性克隆的筛选, 并具有 99 %的真核表 达载体所具有的 Kozak 序列, 该序列中含有 A TG 启动子,有利于翻译的高效启始, 同时也具有表达载 体所必须的转录终止区. 总之, pQE- T riSystem 载 体是一种真核表达系统所需的优秀载体. 通过以上表述, 本试验成功构建包含了 FMDV P1及 2A 基因编码区的穿梭载体,使下一步的原核 及真核表达成为现实,进而获得大量目的蛋白,为口 蹄疫亚单位疫苗的研制工作打下良好的基础,同时 也可作为诊断试剂使用. 参考文献 [ 1] 谢庆阁. 口蹄疫[ M ] . 北京: 中国农业出版社, 2004: 1~ 50 [ 2] 殷 震, 刘景华. 中国病毒学 [ M ] . 北京: 科学出版社, 1985: 395~ 415 [ 3] 林瑞庆, 罗满林, 黄毓茂, 等. O 型口蹄疫病毒 VP1 基 因的克隆与表达 [ J] . 华南农业大学学报 (自然科学 版) , 2004, 25( 1) : 92 ~ 95 [ 4] 张腾国, 刘在新,谢庆阁.口蹄疫病毒 RNA 聚合酶 3D 基因在毕赤酵母中的表达[ J] .中国兽医科技, 2004, 34 ( 1) : 8~ 11 [ 5] 冷青文, 郭慧琛,云 涛, 等.口蹄疫病毒多基因片段的 克隆及其杆状病毒表达载体的构建 [ J] . 中国兽医科 技, 2004, 24( 6) : 16~ 20 [ 6] 曹轶梅, 刘在新, 卢曾军, 等. 口蹄疫病毒非结构蛋白 3ABC 基因的克隆及 3AB 基因的原核表达[ J] . 中国兽 医学报, 2004, 24( 1) : 31~ 34 [ 7] 尤永进, 葛 艳,陈 波, 等.口蹄疫病毒非结构蛋白 3B 真核表达载体的构建及表达[ J] . 中国预防兽医学报, 2003, 25( 3) : 168~ 171 [ 8] 吴锦艳, 刘湘涛,胡永浩, 等.猪口蹄疫病毒对三种动物 细胞噬性的研究[ J] . 甘肃农业大学学报, 2005, 40( 3) : 306~ 310 [ 9] Fox G. T he cell attachment site on foot- and-mouth diease vir useu includes the amino acid sequence RGD ( arg inine-glycine-aspar tic acid) [ J] . J Gen V irol, 1989, 70: 625~ 637 [ 10] Beck E, Steohmaier K . Subtyping o f European foo t- and-mouth disease v ir us stra ins by nucleot ide se- quence determination [ J] . J Viro l, 1987, 61: 1621 ~ 1629 [ 11] M aur lcio G, Mateu M , Luz Valero , et al . Sy st emat ic replacement o f amono acid residues w ithin an A rg- G ly-Asp-Containing loop of foo t- and-mouth disease v ir us and effect on cell recognitio r [ J] . J Bio log ical chemistr y, 1996, 271: 12814~ 12819 [ 12] Mart ina L , Ew ald B, F rand W , et al . Po int mutat ions w ithin the BG-BH loop o f fo ot- and-mouth disease virus O1K af fect v ir us at tachment to tar get cells[ J] . J Vir- ol, 1997, 71: 1046~ 1051 [ 13] Mohapatra J K, Sanyal A , Hemadri D, et al . Sequence var iability in the st ruct ur al pr otein- encoding reg ion o f foot- and-mouth disease vir us sero type Asial field iso- lates[ J] . Res Vet Sci, 2004, 77: 153~ 161 11第 1 期 龚真莉等: 口蹄疫病毒 P1+ 2A 基因真核表达载体的构建