从蛋白质组学探讨壮骨止痛方治疗骨质疏松症的作用机理_杨军

收稿日期:2012 － 07 － 18 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30873291) ;湖南省中医药 科技资助项目(2008032) 作者简介:杨军(1971 －) ，甘肃兰州人，男，讲师、主治医师，博士， 研究方向:中医老年病的研究。 通讯作者:雷晓明(1975 －) ，湖南永州人，男，副教授，研究方向:老 年病学的中西医结合研究。 以造成作用途径和作用机制的不同。课题组的前期研究表 明，黄芪、丹参、牡丹皮配伍，对血管内皮细胞损伤具有保护 作用。这些研究结果提示，复方中的君药与佐使药，即黄 芪、丹参、牡丹皮配伍，可以有针对性地改善肾脏供血的病 理改变。免疫复方中有 3 味臣药，配伍作用复杂，必定对整 个组方的功效有较大影响。因此，本研究基于前期研究结 果，在固定君药和佐使药的条件下，对比不同臣药配伍前后 的药效作用，考察臣药间配伍对组方的药效作用影响，揭示 免疫复方的药味配伍作用。 小蓟与白花蛇舌草合用，表现出抗血管内皮细胞损伤 的协同作用，可能与其所含的黄酮和环烯醚萜类成分具有 抗炎、调节免疫、改善凝血等活性作用有关［6］。抗炎和改 善肾脏供血，可以帮助肾脏清除炎性环境，加速免疫复合物 转运，从而降低免疫复合物所引起的肾脏损伤。处方中其 他臣药配伍虽然没有表现出明显的抗血管内皮细胞损伤的 交互作用，但免疫损伤性肾炎的病理机制复杂，除血管内皮 细胞损伤，还涉及免疫复合物沉积、肾小球系膜细胞增生、 细胞间质增加等，因而还需要从其他角度，综合研究免疫复 方中药味的配伍作用，才能科学阐明免疫复方的药味配伍 机制。 参考文献 ［1］ 谭洪华，李霞，薄爱华． 川芎嗪抗免疫性肾损伤机制的研究 ［J］．中成药，2007，29(8) :1229 － 1230． ［2］ 刘树锋，蔡大勇，李澎涛，等．优化甘参复方抗肝纤维化组分 配伍的研究［J］．中华中医药杂志，2005，20(6) :373 － 375． ［3］ 张君，郭振武，董娜，等． 消斑愈肾剂治疗小儿紫癜性肾炎的 临床研究［J］． 中国中西医结合杂志，1994，14(5) :298 － 301． ［4］ 张君，王莉，郑学民．消斑愈肾颗粒剂对实验性 IgA 肾病大鼠 治疗作用的实验研究［J］． 中国中西医结合杂志，2003，23: 112 － 115． ［5］ 胡兴江，贺庆，程翼宇，HPLC － MS 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Abstract:Objective:To study the mechanism about Zhuanggu Zhitong Formula treating OP based on proteomics． Methods:Bilateal OVX in rats was performed as osteoporosis model． Rats were randomly divided into three groups:control group，OP model group and Zhuanggu Zhitong Formula group． The pathology of bone was examined after 13 weeks． In the present proteomie study，we characterized the protential effects of OVX and Chinese medicine on protein expression in rat 1932 第 30 卷 第 11 期 2 0 1 2年 1 1 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 11 Nov． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 2392 学 刊 bones． Using two dimensional electrophoresis，mass spectrometry and Marx science Ltd database，we elementarily identi- fied three variational proteins． Conclusions:Two proteins were identified as proteins similar to Annexins A1，Protein disul- fide － isomerase A3． These proteins have been demonstrated to be postmenopausal proteins． These results can provide valuable experimental evidences for the research of the molecular mechanism of Zhuanggu Zhitong Formula treating OP． Key s:Zhuanggu Zhitong Formula;proteomics;OP;two － dimensional electrophoresis 骨质疏松症(OP)是以骨量减少，骨小梁变细、断裂、数 量减少，皮质骨多孔、变薄等骨的微观结构退化为特征，以 致骨的脆性增高及骨折危险性增高的一种全身性骨病［1］， 多发生在绝经后妇女、老人和多种慢性疾病患者。雌激素 在西医临床治疗该病中为主要用药之一，，壮骨止痛方是根 据中医传统医理，在临床治疗该病疗效显著，为探明治疗途 径以及微观机理，本实验实用蛋白组学的方法，从分子生物 学的角度研究该方的作用机制。 1 材料和方法 1． 1 材料和试剂 1． 1． 1 实验动物 SPF级 30 只 3 月龄雌性 SD大鼠，体重 (250 ± 10)g 左右，由湖南省中医药大学实验动物中心提 供。合格证号:SCXK(湘)2009 － 0004，购进大鼠后在湖南 中医药大学 SPF级实验室进行适应性饲养。 1． 1． 2 试剂 丙烯酰胺，甲双叉丙烯酰胺，Tris － base， SDS，巯基乙醇，Triton x － 100，Urea，TEMED，过硫酸氨和考 马斯亮 G －250 等购自上海生物工程技术服务有限公司; 两性载体电解质和甘氨酸购自北京经科试剂公司;三氟乙 酸(TFA)为日本东京化成工业株式会社产品;碘乙酰胺，购 自 Sigma公司;乙氰(CAN)为国产色谱纯;其它试剂均为国 产分析纯试剂。 1． 1． 3 壮骨止痛方药液 壮骨止痛方全方提取液(提取 有中南大学药学院按流程提取) ，灌胃时全方药物为 油相和水相混合物。 1． 1． 4 主要设备 基质辅助激光解吸电离一飞行时间质 谱系统(MALDI － TOF － MS)为美国 Applied Biosystems 公 司产品，圆盘电泳槽和高压稳压稳流电源(北京六一仪器 厂产品)、普通台式离心机(上海安亭科学仪器厂)、低温高 速离心机(Beckman公司)。 1． 2 动物造模 SPF级 SD雌性大鼠购进后在动物房中适应性饲养 3 ～ 5 天，随机分为假手术组，模型组，壮骨止痛方组。术前 常规用 2%戊巴比妥钠(0． 2mL /100g)麻醉动物，模型组动 物切除双侧卵巢，假手术组仅进行手术操作，只切除部分脂 肪，但保留卵巢，术后各组动物用青霉素抗炎治疗 7 天;壮 骨止痛方组在消炎 7 天后开始灌胃，假手术组和模型组则 每天用等量生理盐水，每日灌胃 1 次，共灌胃 13 周。 1． 3 大鼠股骨组织蛋白样品的提取和处理 实验大鼠在最后一次灌胃后，禁食 24h，用 2%的戊巴 比妥钠(0． 2mL /100g)腹腔注射，麻醉后将大鼠仰卧固定于 手术架上，用碘伏消毒手术部位，用手术剪剪开腹腔后，采 集标本，取大鼠左后肢股骨，剔除附着的肌肉筋膜，保留骨 膜，生理盐水冲洗后，将骨放入 1． 5mL 的 Eppendorf 管，标 记后置冻盒中，在 － 70℃冰柜中保存备用;也可直接取用新 鲜股骨提取蛋白质样品，取 0． 5g 新鲜骨，放在盛有液氮的 研钵里研磨粉碎，并缓慢加入 3mL样品提取液，放在 4℃冰 箱中裂解提取蛋白质过夜，约 14h 后取出。然后 12000r / min离心 30min，取上清液体放人 0． 01 MPBS中透析 24hrs， 取样品，加入 10 倍体积 － 20℃预冷的丙酮，－ 20℃冰箱中 静置 2h，10000r /min 离心 10min，保留沉淀，4℃中丙酮挥 发，加入 5 倍上清体积的裂解液，2h 后 10000r /min 离心 10min上样。 1． 4 双向电泳 用 pH 8 ～ 10 的两性电解质配制 IEF 胶条。第一向预 电泳 200V 30min，300V 30min，400V 2h，上样后电压 400V 12h后调到 600V 6h。电泳结束后用考马斯亮蓝 G －250 染 色。使用 ImageScanner 2D Platinum 6． 0 图像分析软件，对 凝胶进行系统扫描，进行图像分析。 1． 5 质谱样品的制备 比较 3 组双向电泳图谱，找到差异蛋白，从胶上切下， 切成 1mm大小，置于 0． 5mL的 Eppendorf管中，进行质谱分 析。 1． 6 质谱分析 质谱样品使用美国基质辅助激光解吸电离 －飞行时间 质谱系统 MALDI － TOF － MS 进行分析，采用反射模式，离 子源加速电压 1 为 20000V，加速电压 2 为 23000V，N2 激光 波长 337nm，脉冲宽度 3ns，离子延迟 2000nsec，真空度 4 × 10 －7pa，质谱信号单次扫描累加 50 次，用标准 Marker 峰作 为外标校正质谱峰，正离子谱测定，获得肽质量指纹图谱。 1． 7 数据库的查询 通过 Matrix science公司网站提供的 Mascotwizard软件 进行，具体按照(http / /www． matrix science． com /cgi / search． fromselecthtml)进行查询，查询条件:分子量、等电点未作限 定，肽片断分子量的误差范围 100ppm，未水解的酶位点数 为 1，蛋白种属选择大鼠，Mass values 选择为 MH +，选择 Monoisotopic，固定修饰选择为 Carbamidomethyl(C) ，可变修 饰不选。 2 结 果 2． 1 卵巢切除术后骨质疏松模型造模成功的检查 通过骨密度、生物力学、病理学检测显示:模型组和假 手术组相比较，腰椎骨密度明显下降，骨小梁稀疏、破坏，髓 腔扩大，梁髓比明显下降，右胫所能承受的最大压力下降， 说明大鼠去卵巢后不仅有骨量的减少，还有骨强度的下降， 这些特征与绝经后骨质疏松的生理改变类似，说明本实验 中的病理模型复制成功。 2． 2 大鼠骨组织蛋白双向电泳图谱的比较 假手术组、模型组及壮骨止痛方组股骨蛋白的双向电 泳图谱如插页Ⅰ图 1 所示。从插页Ⅰ图 1 可见，3 张图谱 2932 第 30 卷 第 11 期 2 0 1 2年 1 1 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 11 Nov． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 2393 学 刊 非常相似，蛋白点主要集在 pI5 ～ 7 和 Mw 10 ～ 100KD 区 域。从整个图谱来分析，肉眼可辨别大约 320 多个蛋白点， 且蛋白点之间区分比较清晰，可以对其进行蛋白质表达的 差异分析。对模型组、全方组、假手术组股骨组织蛋白双向 电泳图谱比较，从中发现了 2 个差异明显的蛋白，它们的序 号是 10 号、20 号，分别命名为 P1、P2，其分子量依次约为 39kD，57kD;采用双向电泳图谱分析软件(Ge － nomic So1utions Investigator HT Analyzer version 2． 02)对差异蛋白 的相对含量进行分析，结果见表 1 所示。 表 1 大鼠股骨组织蛋白双向电泳 各组图谱相对表达量的比较 蛋白序号 模型组 假手术组 全方组 P1 12527 51742 59804 P2 4172 9528 9873 2． 3 MALDI － TOF － MS肽质量指纹图谱分析 对 2 个差异蛋白进行 MALDI － TOF － MS分析，得到各 自的肽质量指纹图谱，如插页Ⅰ图 2 所示，从图谱中可见，2 个蛋白肽质量指纹图谱信号较强，基线平稳，适合进一步数 据库检索鉴定。根据得到的肽质量指纹图谱数据，通过 Marx scienee 网站提供的 Mascot wizard 软件查询与之相匹 配的蛋白，搜索结果见表 2。由搜索结果可看出，P1 为膜联 蛋白 A1，P2 为蛋白质二硫键异构酶 A3。 表 2 P1、P2 在数据库搜索的结果 蛋白序号 Top Score Matched Peptide Description PI /MW(KD) P1 55 4 Annexins A1 6． 79 /39 P2 104 8 Protein disulfide － isomerase A3 5． 88 /57 3 讨 论 根据 2 － DE以及质谱分析结果，以及它们质和量的不 同，找到了相对应的蛋白质，下面就两种蛋白加以论述。 P1 与之相对的蛋白是 Annexins A1，即膜联蛋白 A1 型，膜联蛋白是一类结构相关钙依赖的脂结合蛋白超家族， 约占细胞总蛋白的 2%，在细胞中参与膜转运及膜表面一 系列依赖于钙调蛋白的动，包括囊泡运输、胞吐作用中的膜 融合，信号转导及钙离子通道的形成，并调控炎症反应、细 胞分化和细胞骨架蛋白间的相互作用等是 Annexins 蛋白 家的重要一员，又称为 lipocotin I，calpactin I。目前尚不清 楚 AnnexinAl确切生理功能，但认为与膜聚集、细胞信号传 导、凋亡、肿瘤分化等重生理病理过程相关联［2］。Damazo 等［3］通过观察比较 Annexin A1 基因缺失及正常的新生小 鼠颅骨发育情况后发现，Annexin A1 基因缺失新生小鼠颅 骨发育异常，表现为膜内骨化延迟及骨缝闭合障碍。免疫 组化结果显示在颅骨发育的早期阶段，COX － 2 大量表达 及 AnnexinAl基因被激活，因此推测 Annexin A1 的表达对 于颅骨的正常发育十分重要，Annexin A1 可能通过调控成 骨细胞分化及激发影响 cPLA2 － COX － 2 系统中的某些成 分发挥作用。 另外膜联蛋白还参与信号传导，在钙离子浓度变化的 条件下发生细胞内定位的改变，以钙离子依赖的方式与浆 膜发生可逆性结合钙离子通道改变［4］，在本实验中，膜联 蛋白 A1 表达量和模型组相比较，没有较大的变化，但在淫 羊藿苷组表达量较高，说明该全方组在治疗骨质疏松时，发 挥膜联蛋白 A1 的细胞骨架、信号传导的作用较弱，但是单 体淫羊藿苷比较显效。 P2与之相对的蛋白是 Protein disulfide － isomerase A3， 即蛋白质二硫键异构酶 A3，PDI 存在于内质网管腔内，含 量丰富，占到细胞总蛋白的 0． 4%，它是一个非常特殊的多 功能蛋白，而且具有显著的非特异的多肽结合能力，这正是 一个蛋白质分子可能成为分子伴侣必备的重要条件，考虑 到 PDI的这些特性，我们于 1993 年提出了“蛋白质二硫键 异构酶既是酶又是分子伴侣”的假说［5］，作为一种酶，蛋白 质二硫键异构酶能够催化蛋白质天然二硫键的生成、二硫 键的异构化和二硫键的还原。对于还原的蛋白质分子，在 温和的氧化条件下，蛋白质二硫键异构酶能够催化天然二 硫键的形成，这一过程分两步进行，首先是还原蛋白的氧 化，然后是蛋白质二硫键异构酶催化的巯基二硫键交换反 应;对于含有错接二硫键的氧化的蛋白质分子，在温和的还 原条件下，蛋白质二硫键异构酶可以催化二硫键的异构，蛋 白质二硫键异构酶的测活反应就利用了这一特性。所有这 些催化反应，都可被看成是巯基二硫键的交换，最终的产物 被认为是热力学稳定的产物［6］，从而为机体代谢提供能 量;作为分子伴侣，蛋白质二硫键异构酶可以和一些 ATP 依赖型蛋白酶以及与之密切有关的蛋白发生作用，ATP 酶 部分首先以类似分子伴侣作用的方式与底物结合，并调整 底物的构象，然后用肽酶活力降解底物这两个过程都依赖 于 ATP当具有肽酶活力的肽链不存在时，底物则以有活力 的重折叠形式被释放，在这过程中，蛋白质二硫键异构酶起 着去折叠的活力作用［7］。 在本实验中，全方组的蛋白质二硫键异构酶表达含量 和模型组相比，数值增高，但是淫羊藿苷组和己烯雌酚组的 表达量则下降，说明该方能够提高该蛋白的活力，增加机体 供给能量，从而改善骨质疏松症的症状。 参考文献 ［1］ 刘忠厚．骨质疏松学［M］．北京:科技出版社，1998:142． ［2］ Masaki T，Tokuda M，Ohnishi M，et al． Enhanced expression of protein kinase substrate Annexin in human hepatocellul ararcino- ma［J］． Hepatology，1996，24(1) :72 － 81． ［3］ Damazo AS，Moradi BN，Oliani SM，et al． Role of Annexin l gene expression in mouse craniofacial bone development［J］． Birth De- fects Res AClin Mol Teratol，2007，79(7) :524 － 532． ［4］ 倪晓光． 膜联蛋自 A1 的结构和功能及其与恶性肿瘤的关系 ［J］．癌症进展，2010，1(8) :63． ［5］ W C C，TSouC L，protein disfilide iosersase is both enzyme and chaperone［J］． faseb J，1993，15:1515 － 1517． ［6］ 唐建国．蛋白质二硫键异构酶 －种可能参与蛋白质生物合成 的酶［J］．生物化学与生物物理进展，1991，3(18) :174． ［7］ 王志珍．蛋白质二硫键异构酶既是酶又是分子伴侣［J］．科学 通报，1998，3(43) :1349． 3932