实验五、PCR基因扩增

nullPCR基因扩增PCR基因扩增一、实验目的一、实验目的通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术二、实验原理二、实验原理PCR是一种由引物介导的选择性体外扩增DNA的方法，由美国人B.Mullis于1983年发明 包括三个基本步骤: 变性（Denature）：目的双链DNA片段在94℃下解链 退火（Anneal）：两种寡核苷酸引物在适当温度（50℃ 左右）下与上的目的序列通过氢键配对 延伸（Extension）：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成 由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达106 倍nullnullnullPCR Cycle 1PrimersTaqTaqDouble stranded DNA templatenullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullFollowing n cycles of PCR there will be No(1+Y)n copies No initial number of targets Y efficiency of PCR reaction n cycle number1、PCR反应中的主要成份1、PCR反应中的主要成份引物 dNTP Mg2+ 模板 Taq DNA聚合酶 反应缓冲液 引物引物PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定 引物和选择目的DNA序列区域时遵循下列原则： 引物长度约为16～30bp 引物中G+C含量通常为40%～60%，可按Tm＝4(G+C)+2(A+T)粗略估计引物的解链温度 四种碱基应随机分布，在3’端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发 引物3’端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对 在引物内，尤其在3’端应不存在二级结构 两引物之间尤其在3’端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量 引物5’端对扩增特异性影响不大，可引入酶切位点或突变位点 引物不与模板结合位点以外的序列互补 简并引物应选用简并程度低的密码子 引物的浓度一般为0.1～0.5μmol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，引物浓度偏低则降低产量dNTPdNTPdNTP常用的浓度为20～200μmol/，而且4种dNTP的终浓度相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足而出现的错误掺入 dNTP浓度过高虽可加快反应速度，但会增加碱基的错误掺入率，同时会抑制Taq DNA聚合酶的反应活性；适当的低浓度会提高反应的精确度 注意协调Mg2+浓度和dNTP浓度之间的关系Mg2+Mg2+Mg2+浓度会影响Taq DNA聚合酶的活性、真实性，影响引物退火、解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等 通常Mg2+浓度范围为0.5～2mmol/L 在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度模板模板PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，单链分子、双链分子、线状分子或环状分子均可以作为模板 DNA （线状分子比环状分子的扩增效果稍好） 模板的数量和纯度均会影响PCR结果：一般反应中的模板数量为102 ～105 个拷贝。模板拷贝数过多可能会增加非特异性产物 模板DNA中的杂质也会影响PCR的效率Taq DNA聚合酶Taq DNA聚合酶早期PCR扩增是由大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段完成，但这种酶不耐热，所以每一轮循环在变性和退火后必须加入新酶 后来引入耐热的Taq DNA聚合酶，一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130min，95℃ 40min，97℃ 5min，因此PCR中变性温度不宜超过95 ℃ Taq DNA聚合酶的最适温度是72 ℃，连续保温30min仍具有相当的活性，一次加酶可满足PCR反应全过程的需要 纯化的Taq DNA聚合酶有5’→3’外切酶活性，而无3’→5’外切酶活性，不具有Klenow酶的3’→5’校对活性，因此在PCR中有错误掺入率，大约是每2×104个核苷酸中有一个，在利用PCR克隆和进行序列时尤为注意 Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30min掺入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。在100μL反应体系中，1.5～2U的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环 使用Taq DNA聚合酶浓度过高，可引起非特异性产物的扩增，浓度过低则扩增产物量减少反应缓冲液反应缓冲液一般含100mmol/L Tris·Cl （20℃下pH8.3-8.8）, 500mmol/L KCl和0. 1％的明胶，有时候还有适当浓度的Mg2+ Tris·Cl是一种双极性离子缓冲液，主要靠其调节pH，使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性 KCl有利于引物的退火，但浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性 明胶保护酶不变性失活 Mg2+影响Taq DNA聚合酶的活性，直接影响反应的特异性和扩增DNA的产率 反应液可加入5 mmol/L的二硫苏糖醇（DDT）或100μg/ml的牛血清白蛋白（BSA），它们可稳定酶活性2、PCR反应参数2、PCR反应参数变性(94度) 退火(55度) 延伸(72度) 循环次数 (30个循环)变性变性变性不完全，往往使PCR失败，因为未变性完全的 DNA双链会很快复性，减少DNA产量 一般变性温度与时间为94℃ 1 min。在变性温度下，双链DNA解链只需几秒钟即可完全，所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。 对于富含GC的序列，可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失退火退火引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度 实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。一般当引物中GC含量高、长度长并与模板完全配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性越高 有些反应可将退火与延伸两步合并，只用两种温度（如用60℃和94℃）完成整个扩增循环，既省时间又提高了特异性 退火一般仅需数秒钟即可完成，反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。通常退火温度和时间为37℃～55℃，1-2min延伸延伸延伸反应温度通常为72℃，接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75℃ Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20℃～85℃，引物延伸在退火时即已开始 延伸时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。一般反应 体系中，Taq DNA聚合酶每分钟约可合成1kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加。对很低浓度的目的序列，则可适当增加延伸反应的时间 扩增反应完成后，都需要一步较长时间（10～30min）的延伸反应，以获得尽可能完整的产物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要循环次数循环次数当其它参数确定之后，循环次数主要取决于DNA浓度 一般而言25～30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加 通常25～30轮循环扩增后，反应中Taq DNA聚合酶已经不足，如果此时产物量仍不够，需要进一步扩增，可将扩增的DNA样品稀释103～105倍作为模板，重新加入各种反应底物进行扩增，这样经60轮循环后，扩增水平可达109～1010三、仪器、材料与试剂三、仪器、材料与试剂PCR热循环仪 移液枪（配套枪头） DNA模板（质粒R-pGEX-4T-1，R指代外源基因） 2.5mmol/L dNTP（TaKaRa） 10×PCR缓冲液（TaKaRa） 25mmol/L MgCl2 （TaKaRa） 引物1、引物2（5pmol/μL） 引物1：5’-CGGAATTCATGGACGGTCAGA-3’ 引物2：5’-GCGTCGACTCATTCAGATTTGCG-3’ Taq DNA聚合酶（TaKaRa）四、实验步骤四、实验步骤PCR反应体系的配制，即在0.5mL Eppendorf管内配制25μL反应体系，按下准确加入各反应物nullPCR反应条件的设置，即在PCR热循环仪上设置程序，按程序设置的条件进行扩增 94 ℃预变性5min 94 ℃变性40sec 55 ℃退火50sec 72 ℃延伸50sec 72 ℃延伸8min 1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果（此步骤与下次实验PCR扩增产物的割胶纯化一起进行）重复30次实验分组实验分组2位同学一小组，全班共10小组，5个小组组成一个大组，采取混合加样分管的方法，减小操作误差。 每个大组混合加样，配不加模板的反应体系6管，分成23μL/管，每个小组单独加自己的模板（5组实验组），剩下的一管加2 μL无菌水作为模板（阴性对照）。五、思考题五、思考题PCR反应的基本原理是什么？ 典型的PCR反应体系由哪些组分组成，如何影响PCR反应？ 绘出电泳结果图，若实验结果可见拖尾现象或有几条区带，试分析是什么原因造成的？该怎样解决？？null返回null返回