沙丁胺醇人工抗原的合成与鉴定

·22· AnimalHusbandry＆VeterinaryMedicine2008V01．40No．10 沙丁胺醇人工抗原的合成与鉴定 刘宣兵1”，张改平h，邓瑞广1，侯玉泽2， 王自良3，刘庆堂1，游雷鸣1，柴书军1 (I．河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南郑州450002； 2．河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471003；3．河南科技学院动物科学学院，河南新乡453003) 摘要：通过沙丁胺醇(SAL)与琥珀酸酐的醇解反应制备SAL的琥珀酸衍生物。用EDC法将SAL琥珀酸衍生物偶联于载体蛋白BSA和OVA，合 成免疫原BSA—SAL和包被原OVA—SAL，用紫外扫描(uV)、SDS—PAGE进行鉴定；用BSA．SAL免疫BALB／C小鼠，间接ELISA测定多抗上清 (pAb)效价。阻断ELISA鉴定其敏感性，交叉反应试验鉴定其特异性。结果表明，BSA．SAL的uV与BSA、SAL的相比发生了改变；通过uV分 析，SAL—HS与BSA的分子结合比约为7．2：l；通过系列ELISA鉴定，获得了高价、敏感、特异的pAb，为SAL残留免疫学检测方法的建立奠定了 基础。 关键词：沙丁胺醇；人工抗原；合成；鉴定 中图分类号：$859．84 文献标识码：A 文章编号：0529-5130(2008)10．0022．05 Synthesisandidentificationofsalbutamolartificialantigen LIUXuan—bin91’2，ZHANGGai—pin91‘，DENGRui—guan91，HOUYu-ze2， WANGZi—liang’，UUQing-tan91，YOULei—min91，CHAIShu-junl (1．HenanKeyLaboratoryforAnimalImmunology，AgriculturalAcademyof HenanProvince，Zhengzhou450002，China； 2．FoodandBioengineeringCollege，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471003，China； 3．AnimalScienceCollege，HenanInstituteofScienceandTechnology，Xinxiang453003，China) Abstract：Salbutamol(SAL)succinatewa$preparedbymeansofthealeoholysisreactionbetweenSALfreebaseandsuceinieanhydride． SALsuccinateWasconjugatedtocarrierproteinBSAbythemethodofEDC，andthustheantigenBSA—SALforimmunizationWasobtmned． ThecoatingantigenOVA—SALWasobtainedinthesaRleway．UVandSDS-PAGEwereusedtoidentifySALartificialantigen．BALB／C micewereimmunized诵thBSA—SAL，thetitreofpolyelonalantibody(pAb)WasdetectedbyindirectELISA，thesensitivityofpAbWasi- dentifiedbyblockingELISAandthespecificityofpAbWasidentifiedbythemethodofcross—reactiontest．Theresultsshowedthatcompared withBSAandSAL，UVspectrogramofBSA-SALhaschanged；theconjugationratioofSAL·HStoBSAWasabout7．2：1；thehish·titer， sensitiveandspecificanti—SALpAbhasbeenproducedinseraofimmunizedBALB／Cmice，whichmadeitpossibletoestablishimmunoas· sayofSALresiduesinfeedandanimalfood． Keywords：salbutamol；artificialantigen；synthesis；identification 沙丁胺醇，又名舒喘宁、索布胺、阿布叔醇等， 化学名为4-羟基-5-羟甲基一OL-(叔丁胺)甲基苯乙醇 胺，分子式C。，H：。NO，，常用其硫酸盐。临床上常用 于治疗支气管哮喘、哮喘性支气管炎和肺气肿患者的 支气管痉挛等呼吸系统疾病⋯。沙丁胺醇(SAL)摄 人量过大时对心血管系统和神经系统会产生明显的刺 激作用，引起的症状有：肌肉颤抖、心悸、心慌、头 疼、目眩，严重者恶心、呕吐等。由于SAL对动物 收稿13期：2008—04—10 基金项目：“十一五”国家科技支撑(2006BAK0"2A21)。 作者简介：刘宣兵(1982一)，男，硕士。 ·通讯作者。 具有促进骨骼肌生长，减少脂肪蓄积作用，因而被国 内外不少养殖场非法用作饲料添加剂，其残留严重危 害着人们的身体健康和生命安全旧J。因此，各国政 府都严禁SAL用作饲料添加剂，我国农业部发布的 《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》明确规定 沙丁胺醇等B一兴奋剂被禁止所有用途，禁用所有食 品动物(农牧发[2002]193号)。目前，SAL的残 留检测主要依靠理化检验方法，如高效液相色谱 (HPLC)、毛细管区带电泳法(CE)、液．质联用 (LC—MS)、气-质联用(GC-MS)等，由于理化检验 仪器昂贵、样品前处理复杂、繁琐费时、不能现场操 作等，限制了其广泛应用。免疫学方法由于具有 万方数据 畜牧与兽医2008年第40卷第10期 ·23· 灵敏、快速、特异、简便等优点，近年来在国内外兽 药、农药残留检测领域已被广泛应用[32。本研究旨 在为SAL残留免疫学检测方法的建立和拥有自主知 识产权检测产品的开发奠定基础。 1材料与方法 1．1试剂 硫酸沙丁胺醇，盐酸克伦特罗，莱克多巴胺， Sigma产品，纯度≥99．O％；肾上腺素、去甲肾上腺 素、异丙肾上腺素，上海禾丰制药有限公司产品；牛 血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)，Pierce 产品。 1．2实验动物 SPF级6～8周龄雌性BALB／C小鼠购自郑州大 (SAL) O lI R—c—OH+ CH，CH2HN=C=N一(cH2)， l (SAL琥珀酸衍生物) (EDC) +H2N—R———+ 2 (BSA) (偶联产物) 0 学医学院实验动物中心，本实验室饲养。 1．3人工抗原合成 将80mg硫酸沙丁胺醇加入10mL甲醇中，室温 下磁力搅拌使之溶解，加入45mg琥珀酸酐，磁力搅 拌使之反应72h。将反应后的溶液放在通风橱中使甲 醇挥发12h，再放在真空干燥箱中烘干，即得沙丁胺 醇琥珀酸衍生物(SAL—HS)HJ。称取(SAL—HS) 20mg溶于2mLpH4．8的tris—HCI缓冲液中，加入 EDC40mg，搅拌反应12h。称取BSA20mg溶于 2mLtris．HCI缓冲液中，将BSA溶液逐滴加入上述 反应液中，室温下磁力搅拌反应24h。反应结束后， 装入透析袋4℃透析72h，期间换液(PBS)6—9 次。即成免疫抗原(BSA-SAL)。合成路线见图l。 包被抗原(OVA—SAL)的制备同免疫抗原。 无水—五芦HO O O II I| H乒一。一C一(CH2)2一C--OH Nil—C(CH，)， (琥珀酸酐) (s^L琥珀酸衍生物) HcI 下1I I 一1I一心一曲=二善刑一咀k一1一^ LH， 1 II H1c 0 f中间产物1 II ／cH， +伽#心HrM叫呱L一＼CH，， (副产物腮) 图1 EDC法合成BSA-SAL路线图 1．4人工抗原鉴定 uV鉴定：用PBS配制SAL-HS和BSA溶 液，取一定量的BSA—SAL溶于PBS，用Braford法口j 测定其蛋白质的浓度，据此浓度调节BSA·SAL溶液 中蛋白质的浓度与BSA标准溶液一致，在波长200— 400nm范围内进行紫外扫描，参照杨利国№1所述方 法计算BSA与SAL．HS的分子结合比。 SDS-PAGE鉴定：参照文献[7]介绍的方法配 制各种电泳溶液，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为 10％，浓缩胶电压70V，分离胶电压85V，上样量 为20汕，考马斯亮蓝染色5～6h后，置脱色液中过 夜脱色。根据条带分子量的大小变化计算偶联率埔J。 1．5多抗血清(pAb)制备 用BSA．SAL免疫6周龄BALB／C小鼠3只，免 疫剂量为50p,g·0．2mL／只，背部皮下分4—6点注 射。首免，用无菌PBS溶解BSA—SAL，与等量FCA 混合，充分乳化；加强免疫，用无菌PBS溶解BSA- SAL，与等量FIA混合，充分乳化，首免后4周进 行，共免4次，每次间隔2～6周，最后1次免疫后 30d断尾采血分离血清。 1．6 pAb鉴定 1．6．1效价测定 采用间接ELISA测定pAb效价，基本程序参照 Tijssen的方法归】。第l步，用OVA．SAL包被，包被 z 入F R2 一HN—O¨¨C— Rl 万方数据 ·24· AnimalHush．dry&VeterinaryMedicine2008V01．40No．10 浓度2pg／mL，包被量每孔50汕，37℃温育2h， PBST洗板6次(下同)；第2步，用5％猪血清封 闭，每孔250耻L，37oC温育1h，洗板；第3步，加 多抗血清(pAb)，每孔50汕，用封闭液倍比稀释， 设阴性对照(NC)和空白对照(BC)，37℃温育 15min，洗板；第4步，加GaMIgG．HRP，1：l000用 封闭液稀释，每孔50灿，37℃温育30min，洗板； 第5步，加酶底物TMB显色，每孔50斗L，室温反应 5min；第6步，终止显色反应，每孔加入终止液 50斗L，用酶标仪读OD450值；第7步，结果判断，以 待测孑LOD4w值≥NCOD4．so值的2．1倍(P／N>12．1)， 判为阳性。 1．6．2敏感性鉴定 采用阻断ELISA鉴定其敏感性。阻断ELISA测 定抗血清对SAL的50％抑制浓度(IC∞)，并以IC∞ 作为敏感度，操作步骤与间接ELISA的区别在于第3 步加OD4．so值为1．0的小鼠血清50斗L和不同浓度的 SAL50恤L作抑制剂。 1．6．3特异性鉴定 采用交叉反应试验鉴定其特异性。交叉反应试验 选择SAL及其同类物克伦特罗、莱克多巴胺、肾上 腺素、去甲。肾上腺素、异丙。肾上腺素，用阻断ELISA 测定各竞争物的IC∞，以pAb对SAL的Ic∞与各竞争 物的Ic卯之比的百分数为其交叉反应率(CR％)。 2 结果 2．1人工抗原的鉴定结果 2．1．1UV鉴定结果 BSA、SAL—HS的最大吸收峰在278nm，BSA与 SAL—HS偶联后，两者的峰叠加，表明偶联成功；依 据朗伯．比尔定律，推算出BSA．SAL的分子结合比约 为1：7．2。见图2。 2．1．2SDS—PAGE鉴定结果 BSA的泳动速度大于BSA-SAL，说明BSA—SAL 的分子量大于BSA，证明SAL-HS与BSA已成功偶 联；用紫外凝胶成像系统分析软件分析得出，BSA— SAL的分子量为6．87×104，BSA的分子量为6．62× 104，BSA与SAL的分子结合比约为1：7．5，与UV鉴 定结果基本一致。见图3。 图2 lISA、SAIL—I-IS和BSA-SAIL的紫外扫描光谱 MarkerBSABSA—SAL KD 97．4一’●—■● 66．2一_●—●_ 43．0一—一 图3 BSA-SAL偶联物的SDS·PAGE鉴定 2．2 pAb鉴定结果 2．2．1间接ELISA效价测定结果 空白孔为PBS，阴性对照孔为各小鼠的空白血 清。表1可知，免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到 了1：104，说明获得了较好的免疫效果，其中1号小 鼠效价最高为1：2．56X104。 表1 pAb效价测定 2．2．2pAb敏感性鉴定结果 mL范围内，3只小鼠的阻断ELISA曲线呈良好的线 由图4可知，抑制剂SAL在(3l一4000)ng／性关系，其中抑制效果最好的是l号小鼠。将 万方数据 畜牧与兽医2008年第40卷第10期 ·25· OD450。值转化为B／Bo％，再对loglo[SAL／30]进行 回归分析，1号小鼠的线性回归直线方程为Y=一 30．98x+80．613。相关系数尺2=0．9907，符合线性 关系的判定标准。从曲线可以计算出1号小鼠的Ic∞ 为292．9ng／mL．均低于其它小鼠。 l∞ 90 80 70 誉60 参50 40 30 20 t0 O O 0．5 1．0 1．5 2．0 loglo[SALdilution／30(ne／mL)】 图4 pAb对SAL的阻断ELISA抑制曲线 2．2．3pAb特异性鉴定结果 由表2可知，SAL抗血清对克伦特罗有106％的 交叉反应性，对莱克多巴胺等其他B一兴奋剂无交叉 反应。 表2SALpAb与SAL类似化合物的交叉反应 化合物 ／。：嚣篙，淼 3讨论 3．1关于SAL半抗原的设计 由于沙丁胺醇属于小分子物质，分子量为 239．4，所以很难具备2种抗原表位，即T细胞表位 和B细胞表位。而诱导机体产生免疫反应，必须同 时具备2种表位¨01。针对以上情况，在制备药物抗 原免疫动物制备抗血清中，必须将药物本身与载体偶 联，这样免疫动物才会产生针对药物的抗体。载体蛋 白与小分子半抗原偶联后形成新的大分子物质，使偶 联物产生了新的T细胞表位和B细胞表位，因而能 够为抗原递呈细胞识别与捕获，进而将半抗原的T 细胞表位递呈给相应的T细胞克隆并使之活化。在 活化的T细胞辅助下，与新的B细胞表位结合的B 细胞克隆活化、分裂、增殖，并分泌针对新的B细 胞表位的抗体⋯1。因此应用BSA-SAL免疫小鼠可使 小鼠脾脏产生针对小分子SAL的大量克隆。 3．2关于SAL人工抗原的制备方法 SAL属于苯酚型B一兴奋剂，本身并没有合适的 基团可直接连接到载体蛋白上，必须先将羟基转换成 羧基才能与载体蛋白偶联。根据SAL3个羟基的活泼 性不同，在无水条件下，SAL酚羟基邻位的羟甲基可 与琥珀酸酐发生醇解反应，生成SAL的琥珀酸衍生 物。通过将SAL琥珀酸单酯化，在SAL苯环上添加 一个羧基碳链。用碳化二亚胺法，可将SAL琥珀酸 衍生物上的羧基与载体蛋白上的氨基通过缩水反应连 在一起，生成SAL与载体蛋白的偶联物¨2—31。也可 采用混合酸酐法，将SAL琥珀酸衍生物与氯甲酸异 丁酯发生取代反应，所得产物与载体蛋白上的氨基偶 联，生成SAL与载体蛋白的偶联物。本研究通过比 较2种方法，采用的是用碳化二亚胺法。 3．3 关于SAIL多抗血清的交叉反应性 多抗的交叉反应性表示多抗与竞争物结合的结构 特异性，是揭示参与反应混合物与其交叉结合的重要 化学参数。本试验结果表明，抗SAL多抗除对SAL 具有特异性反应外，对克伦特罗也具有极高的抑制 率，其交叉反应性达106％，而对其他一些结构类似 物有很低的抑制作用。造成抗SAL多抗对CL和SAL 有同样高的抑制作用的原因目前还没有搞清楚，可能 是CL和SAL两者的结构太相似，而具有相同或相似 的抗原表位。据Degand报道，抗SAL抗血清对克伦 特罗有很高的交叉反应率(115％)，可以同时检测 SAL和CL。 本研究成功合成了SAL人工抗原，免疫BALB／C 小鼠制备出高价、敏感的pAb，为抗SAL单克隆抗体 (mAb)的进一步研制、免疫学分析方法的建立以及 食品残留的快速检测等奠定了研究基础和技术贮备。 参考文献： [1] 陈新谦，金有豫．新编药物学[M]．14版．北京：人民卫生 出版社，1999． [2] RicksCA，BakerPK，DalrympleRH．Useofrepartitioningagents toimpmveperformanceandbodycompositionofmeatanimals[J]． ReciprocalMeatCorffProe，1984，37：5-11． [3] ShermaJ．Currentstatusofpesticideresidueanalysis[J]．JAOAC Int，1997，80(4)：283-287． [4]DegandC，Bernes·DuyekaertsA．Determinationof15-agonistsinU- finebyanenzymeIrlllnun·-oassaybasedontheU$eofananti·-&dbuta-- mol¨tisemm[J]．AnalyticaChimieaAeta，1993，275：241-247． 【5] 汪家政，范明．蛋白质技术[M]．北京：科学出版社， 2002：42-47． 万方数据 ·26· AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine2008V01．40No．10 奶牛良种登记和个体选配PDA设备的设计与开发 闫坤伦1，魏晓莉2，张永根h (1．东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨150030； 2．东北农业大学工程学院，黑龙江哈尔滨150030) 摘要：本研究利用实时嵌入式操作系统MicrosoftWindowsCE．NET，c#，eMbeddedVisualC++4．0，SQLServerCE数据库，设计开发以PDA(Per- sonalDigitalAssistant)技术为手段的奶牛个体选配电子设备一掌中宝。本设备主要具有以下三种功能：(1)在现场实现奶牛基本资料的采集和录 入；(2)对奶牛体型外貌按加拿大评分标准现场评分；(3)对奶牛进行个体选配、系谱资料等遗传信息采集，配种员输入待改良的指标和与配 公牛冻精号。便可自动获取选配结果。在采集工作完成后可与台式计算机连接将数据保存在奶牛信息管理系统内。 关键词：奶牛；PDA；个体选配；嵌入式系统 中图分类号：s818．9 文献标识码：A 文章编号：0529-5130(2008)lO一0026—05 Designingandempolderingofelitedairycattelregisterand individualapolegamyPDAdevices YANKun—lunl，WEIXiao—li2，ZHANGYong．genl’ (1．CollegeofAnimalScienceandTechnology，NortheastAgriculturalUnirersity，Harbin150030，China； 2．CollegeofEngcering，NorthestAgriculturalUniversity，Harbin150030，China) Abstract：ElitedairycattleregisterandindividualplannedmatingPDAdevicesthroughusingtheembeddedsystemMicrosoftWindows CE．NET。C#，eMbeddedVisualC++4．0，andSQLSever2000databaseWaSdesigned．TherewerethreefunctionsofthePDAdevices： (1)thebasicinformationoftheCOWWascollectedandinputindairyfarm；(2)bodytypeandappearanceofdairycattlewasscoredaccord- ingtotheCanadianstandardindairyfarm；(3)functionofindividualplannedmatingandpedigreeinformationcollecting，theimproved standardandsemennumberofbullwereinput．thePDAwouldgettheresultsofindividualplannedmatingautomatically．Thedatawillbe reservedinthedairyemileinformationmanagementsystemofthePCafterinformationacquisition． Keywords：dairycattle；PDA；individualplannedmating；embeddedsystem 随着相关的计算机软件在畜牧业中的发展和应 收稿日期：2007一11—20 项目基金：“十一五”国家科技支撑计划课题“东北农区奶业集 约化生产技术集成及产业化示范”。项目编号：2006BAD04A09。 作者简介：同坤伦(1981一)，男，在读硕士研究生。 ·通讯作者。 用，使奶牛生产和育种管理方面逐步实现“数字 化”。目前我国奶牛业迅速发展，为适应现代化牛场 发展的需要，相应的奶牛良种繁育技术系统应运而 生，发挥着巨大的作用⋯。但奶牛良种繁育技术系 统只能在固定环境中应用，不能在饲养现场对奶牛资 料进行数据收集和处理，降低了育种技术人员分析和 [6] [7] [8】 [9] 杨利国，胡少昶，魏平华，等．酶免疫浏定技术[M]．南京： 南京大学出版社，1998：252．258． 郭尧君．蛋白质电泳实验技术[M]．北京：科学出版 社。2．001． KampsHC。CatrlinRJ，SheffieldC。融a1．Analysisofhapten· cMlnierproteinconjugatesbynondemauringgeleleetrophoresis[J]． JournalImmunologicalMethods，1993。(164)：245-253． TijssenP．Practiceandtheory0fenzymeinnnunoassay[M]．Am- sterdam：Elsever。1985． [10] [12] [13] 陈继明，龚晓明，陆承平．T细胞表位研究进展[J]．中华微 生物学与免疫学杂志，1998。18(1)：78-82． CohenIR．Thecognitiveprinciplechallengesclonalseleetion[J]． ImmuneToday，1992。lI(13)：4414“． 李颖．沙丁胺醇单克隆抗体的制备与ELISA检测方法的初步 建立[D]．扬州：扬州大学，2006． 黄素文，周宏斌，赵秀玲，等．尿样中沙丁胺醇的检测[J]． 畜牧与兽医，2007，39(11)：49-51． 万方数据 沙丁胺醇人工抗原的合成与鉴定 作者： 刘宣兵， 张改平， 邓瑞广， 侯玉泽， 王自良， 刘庆堂， 游雷鸣， 柴书军， LIU Xuan-bing， ZHANG Gai-ping， DENG Rui-guang， HOU Yu-ze， WANG Zi-liang， UU Qing-tang， YOU Lei-ming， CHAI Shu-jun 作者单位： 刘宣兵,LIU Xuan-bing(河南省农业科学院动物免疫学重点实验室,河南,郑州,450002;河南 科技大学食品与生物工程学院,河南,洛阳,471003)， 张改平,邓瑞广,刘庆堂,游雷鸣,柴书 军,ZHANG Gai-ping,DENG Rui-guang,UU Qing-tang,YOU Lei-ming,CHAI Shu-jun(河南省农 业科学院动物免疫学重点实验室,河南,郑州,450002)， 侯玉泽,HOU Yu-ze(河南科技大学食 品与生物工程学院,河南,洛阳,471003)， 王自良,WANG Zi-liang(河南科技学院动物科学学 院,河南,新乡,453003) 刊名： 畜牧与兽医 英文刊名： ANIMAL HUSBANDRY & VETERINARY MEDICINE 年，卷(期)： 2008,40(10) 被引用次数： 1次 参考文献(13条) 1.陈新谦;金有豫 新编药物学 1999 2.Ricks c A;Baker P K;Dalrymple R H Use of repartitioning agents to improve performance and body composition of meat animals 1984 3.Sherma J Current status of pesticide residue analysis[外文期刊] 1997(04) 4.Degand C;Bernes-Duyckaerts A Determination of β-agonists in u-fine by an enzyme Imnun-oassay based on the use of on anti-salbuta-tool antiserum 1993 5.汪家政;范明 蛋白质技术手册 2002 6.杨利国;胡少昶;魏平华 酶免疫测定技术 1998 7.郭尧君 蛋白质电泳实验技术 2001 8.Kamps H C;Cadin R J;Sheffield C Analysis of haptencarrier protein conjugates by nondenaturing gel electrophoresis[外文期刊] 1993(164) 9.Tijssen P Practice and theory of enzyme intmunoassay 1985 10.陈继明;龚晓明;陆承平 T细胞表位研究进展[期刊]-中华微生物学和免疫学杂志 1998(01) 11.Cohen IR The cognitive principle challenges 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抗沙丁胺醇单克隆抗体制备与鉴定[期刊论文]-安徽农业科学 2011(10) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_xmysy200810006.aspx