第十五章重组干扰素生产工艺

nullnull第一节 干扰素概述 第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 第三节 干扰素的发酵工艺过程 第四节 干扰素的分离纯化工艺过程 第十五章 重组人干扰素生 产工艺null第一节 干扰素概述 干扰素生产工艺干扰素概述null 干扰素的发现 1957年，英国病毒生物学家Alick Isaacs和瑞士研究人员Jean Lindenmann，在利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时了解到，病毒感染的细胞能产生一种因子，后者作用于其它细胞，干扰病毒的复制，故将其命名为干扰素。干扰素生产工艺干扰素概述 1980-1982年，科学家用基因工程在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素，从每1升细胞培养物中可以得到20-40毫升干扰素。从1987年开始，用基因工程方法生产的干扰素进入了工业化生产，并且大量投放市场。两种病毒感染同一种细胞或机体时，常常发生一种病毒抑制另一种病毒复制的现象null 概念：（interferon，IFN） 机体受到病毒感染时，免疫细胞产生的一组结构类 似、功能接近的细胞因子 功能：干扰病毒在细胞内的增殖 根据干扰素蛋白质的氨基酸结构、抗原性和细胞来源，可将其分为：IFN-α、IFN-β、IFN-γ 干扰素-α有24种亚型，其中包括干扰素-α2a、干扰素-α1b、 干扰素-α2b、干扰素-α2c等 上市重组干扰素: α-2a、α-2b、α-1b、β-1b，γ干扰素生产工艺干扰素概述null干扰素的理化性质 143～166aa； MW:18 ～ 40 ku； pI:6.5 ～ 7.5； 乙醚、氯仿敏感 容易吸附介质。IFN α结构NC干扰素生产工艺干扰素概述null 广谱抗病毒活性（rhuIFNα） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。 直接抗肿瘤活性（rhuIFNα） 白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ） 多发性硬化症（rhuIFNβ）干扰素生产工艺干扰素概述null 体外诱生干扰素制备工艺： Sendai病毒诱导人白细胞 1989年：IFNα-n3，批准上市 产量低：1g IFNα，需要3亿ml人血白细胞 来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵 潜在的血源性病毒污染的可能性路 线 1 干扰素生产工艺干扰素概述null 人源转化细胞系培养生产工艺：1999年：IFN α-n1/Wellferon, 批准用于临床。 优点：首次实现大规模商业化生产。 缺点：活性低，退出临床应用。 路 线 2 干扰素生产工艺干扰素概述null 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b； 1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b； 2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。 路线 3 干扰素生产工艺干扰素概述null 上市产品： rhuIFNβ-1a 1996，Avonex(Biogen) 2002，Rebif(Serono) 表达产物：166 aa糖基化蛋白，22.5 ku 工艺特点：分泌表达，产量低，成本高，过程严格 路 线 4 动物无限细胞系培养生产工艺：干扰素生产工艺干扰素概述null 路 线 5 基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺： 宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putida） 上市产品：IFN α-2b/Alferon安福隆 表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子结构 和生物活性 工艺特点： 发酵周期短：几个小时 无需变性、复性过程，获得有活性产品 纯化过程：淘汰抗体亲和层析干扰素生产工艺干扰素概述null第一节 干扰素概述 第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 第三节 干扰素的发酵工艺过程 第四节 干扰素的分离纯化工艺过程 第十五章 重组人干扰素生 产工艺null第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏干扰素生产工艺假单胞杆菌的构建与保藏null第一步：干扰素α-2b基因的克隆 第二步：表达载体的构建 第三步：工程菌的构建 干扰素生产工艺假单胞杆菌的构建与保藏null 制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA，反转录酶合成cDNA、 PCR，基因连接质粒， 转化E.coli，筛选鉴定克隆。 测序：编码人IFNα-2b基因序列，501bp，165aa。第一步：干扰素基因的克隆(RT-PCR)ATGTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGGTTGCCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCACACGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTCGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTCAGGAAATACTTCCAAAGAATCACCTCTACTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAATGA干扰素生产工艺假单胞杆菌的构建与保藏null 转化腐生型假单胞杆菌 筛选高表达、稳定遗传的工程菌 获得原始菌种 第二步：工程菌构建 干扰素生产工艺假单胞杆菌的构建与保藏null 具有宿主菌的特征： 细菌：革兰氏阴性菌，有荚膜，无芽孢，杆状。 菌落：直径2.5-3.0 mm，灰绿色半透明状，粘稠。 生化特性:Ser —，L-Val、D/L-Arg和L-Thr为碳源。 工程菌的特征：SmR、TcR、ApR 具有生产干扰素能力：干扰素生产工艺假单胞杆菌的构建与保藏null QC：菌种特性、生产能力、质粒稳定性 菌种检查合格后，方可投产。干扰素生产工艺假单胞杆菌的构建与保藏null主菌种库 或上一代 工作菌种 库 Ependorf 管 干扰素生产工艺假单胞杆菌的构建与保藏null第一节 干扰素概述 第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 第三节 干扰素的发酵工艺过程 第四节 干扰素的分离纯化工艺过程 第十五章 重组人干扰素生 产工艺null第三节 干扰素的发酵工艺过程干扰素生产工艺发酵工艺过程null干扰素生产工艺发酵工艺过程null 取保存工作种子批菌种，室温融化 摇瓶活化培养：30℃，pH7.0，250 r/min，18±2h 检测：OD值和发酵液杂菌检查。1、摇瓶培养 干扰素生产工艺发酵工艺过程null 接种：接入30L种子罐，接种量10% 培养：30℃，pH7.0 控制：级联调节通气量和搅拌转速 DO为30%，3～4h，OD>4.0 检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。2、种子罐培养 干扰素生产工艺发酵工艺过程null 接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量 10%。 控制：级联调节通气量和搅拌转速。 前4h：30℃，pH7.0，DO为30% 4h后：20℃，pH6.0，DO为60%，5～6.5h 终点控制：OD值达9.0±1.0，5℃冷却水快 速降温至15℃以下 检测：发酵液杂菌检查3、发酵罐培养 干扰素生产工艺发酵工艺过程null 连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。 菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。 检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、 质粒结构一致性、质粒稳定性。4、菌体收集 干扰素生产工艺发酵工艺过程null 指数期：1.5-3.5hr左右 产物合成期：4hr左右最大。1、菌体生长与产物合成的关系 干扰素生产工艺发酵工艺过程不相关或非偶联型null 种子培养基：C/N比较低的培养基 发酵培养基：C/N比较高的培养基 pH控制：加入缓冲体系2、培养基的配制 干扰素生产工艺发酵工艺过程null DO：高时，产物明显提高；同时质粒的稳定性提高 策略：加大转速，增加通气量，必要时用纯氧3、DO控制 干扰素生产工艺发酵工艺过程null 温度：要考虑菌体生长和产物的积累 策略：前期控制在30℃，保证菌体快速生长，后期控制在 20℃积累产物，同时防止产物降解4、温 度 干扰素生产工艺发酵工艺过程null 菌体生长：pH 6.8 产物积累：pH 6.0 策略：两段培养 5、pH 值 干扰素生产工艺发酵工艺过程null机械除泡和消泡剂共同使用6、泡沫控制 干扰素生产工艺发酵工艺过程null第一节 干扰素概述 第二节 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 第三节 干扰素的发酵工艺过程 第四节 干扰素的分离纯化工艺过程 第十五章 重组人干扰素生 产工艺null第四节 干扰素的分离纯化工艺过程分离纯化工艺干扰素生产工艺null蛋白质分离纯化的目标是增加制品的纯度或比活性，即增加单位蛋白质的含量或生物活性。设法除去变性的和杂蛋白，并且希望所得到蛋白质的产量和纯度最高值。分离纯化工艺干扰素生产工艺null 菌体裂解 预处理 初级分离分离纯化工艺干扰素生产工艺null 裂解缓冲液：纯化水，2℃～10℃（pH7.5） 使用保护剂：EDTA、DTDE、PMSF 破碎-20℃菌体：2厘米 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。1、菌体裂解 一定的pH条件下，细胞破裂，加入表面活性剂(SDS、Triton X-100 而获得。而pH 环境则由加入的强碱(NaOH) 或缓冲液 提供。在一定的pH 环境下，表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 分离纯化工艺干扰素生产工艺null 加絮凝剂聚乙烯亚胺：2℃～10℃，搅拌，对菌体碎片 进行絮凝。 加凝聚剂醋酸钙溶液：2℃～10℃,搅拌，对菌体碎 片、DNA等进行沉淀。 离心： 连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质 杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌，焚烧处理。2、预处理 菌体自溶、核酸、蛋白质及其它有机粘性物质造成的浑浊，如果不经过适当的预处理就直接进行过滤或离心沉降，不但速度极慢，甚至得不到澄清的蛋白质分离纯化工艺干扰素生产工艺null 盐析: 4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀静置过夜。 离心：连续流离心机，16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃。3、初级分离 分离纯化工艺干扰素生产工艺null 初级分离溶解粗干扰素 沉淀与疏水层析 阴离子交换层析与浓缩 阳离子交换层析与浓缩 凝胶过滤层析 无菌过滤分装 分离纯化工艺干扰素生产工艺null1、溶解粗干扰素 配制纯化缓冲液：超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 μm滤器和10 ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至2℃～10℃。 检查：缓冲液的pH值和电导值。 溶解：2℃～10℃，匀浆，完全溶解。分离纯化工艺干扰素生产工艺null2、沉淀与疏水层析 等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH 5.0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。 疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中， 除去非疏水性蛋白。 洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）。 分离纯化工艺干扰素生产工艺null2、沉淀与疏水层析 等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电导值40 mS/cm，2℃～10℃，静置过夜 超滤：1000 ku超滤膜过滤，除去大蛋白。 透析除盐：调整溶液pH 8.0，10 ku超滤膜，0.005 M缓冲液。电导值：液体通过离子运动运载电流的能力，电导率随温度的升高而升高，也受溶液自身所含离子的形状数量以及粘度的影响，这两个参数根据温度变化而变化，温度的变化伴随着电导率的变化。 mS/cm读作“毫西门子每厘米”分离纯化工艺干扰素生产工艺null3、阴离子交换层析与浓缩 0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）平衡树脂 盐浓度线性梯度5～50 mS/cm进行洗脱 配合SDS-PAGE收集干扰素峰 浓缩：调整溶液和电导，10 ku超滤膜，0.05M醋酸缓冲液（pH5.0）中透析。离子交换剂由大量带电荷的侧链和不溶性的树脂结合而成。DEAE（二乙胺乙基）等阴离子树脂侧链带正电荷，可与带负电荷的蛋白质结合；CM（氯化聚乙烯 ）等阳离子树脂侧链带负电荷，可与带正电荷的蛋白质结合。先用离子强度较低的缓冲液上样和洗脱，然后用离子强度高的缓冲液洗脱分离纯化工艺干扰素生产工艺null4、阳离子交换层析与浓缩 用0.1M醋酸缓冲液（pH 5.0）平衡树脂。 上样，相同缓冲液冲洗。 盐浓度线性梯度5～50 mS/cm进行洗脱 配合SDS-PAGE收集干扰素峰。 浓缩：10 ku超滤膜进行。分离纯化工艺干扰素生产工艺null5、凝胶过滤层析 洗涤液：0.15 M NaCl的0.01M磷酸缓冲液（pH7.0）清洗系统和树脂 上样，相同缓冲液进行洗脱。 合并干扰素部分分离纯化工艺干扰素生产工艺null6、无菌过滤分装 0.22 μm滤膜过滤干扰素溶液 分装 －20℃以下的冰箱中保存。分离纯化工艺干扰素生产工艺null7、检测项目 干扰素鉴别试验 干扰素效价测定 蛋白质含量，纯度测定，分子量 宿主残余蛋白、残余DNA 干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，N端序列 其他：热原，内毒素，残留抗生素分离纯化工艺干扰素生产工艺null思考题 （1）干扰素生产工艺路线有几条？有何特点？ （2）离子交换工艺的原理是什么？ （3）利用大肠杆菌和假单胞菌生产人干扰素--α2b 有什么区别？有什么优缺点？ （4）重组人干扰素--α2b的菌种库如何建立 ？ （5）重组人干扰素--α2b的纯化工艺过程。干扰素生产工艺