地灵愈伤组织到成体的发展研究

地灵愈伤组织到成体的发展研究 河南科技大学本科生#毕业# 银条茎尖的脱毒组织培养和植株再生 摘 要 银条(Stachys floridana Schuttl .ex Benth)，又名地灵，系唇形科水苏属多年生蓄根草本植物，其地下根状茎圆状细长，肉质洁白，酷似白银，故名银条;据传是唐僧取经过程中所得，又被誉为“唐僧肉”。目前，全国人工种植面积很少，洛阳偃师县(市)是主要产地，约占全国产量的95%，仅春节左右大量上市，同时远销国内外，在市场上 [2]常供不应求。本研究通过对银条茎尖分生组织的培养条件、不同处理对提高茎尖再生植株脱毒率的效果进行了研究，并利用不同外植体探讨了银条再生快繁的适宜途径。 试验结果表明:银条的离体培养以MS作为基本培养基最为适宜，再生苗生长快速，植株健壮。茎尖分生组织培养在MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖4,+琼脂6.5g/L上，最适宜茎尖的培养;再生植株的脱毒率随茎尖切割长度的减小而提高，但过小的茎尖操作、培养困难，培养周期长，成苗率低。0.5mm大小的茎尖成苗率与脱毒率相对较高，较为适合;茎尖的重复切割培养与接种植株进行预热处理均有显著提高脱毒率的作用，但同时也降低了成苗率。 关 键 词:银条 茎尖培养 脱毒 植株再生 MS培养基 I 银条茎尖的脱毒组织培养和植株再生 STACHYS FLORIDANA MREISTEM CULTURE AND PLANTLET REGENERATION OF VENOM TISSUE REMOVAL ABSTRACT Stachys floridana, also known as Ling, Lamiaceae Stachys is a build root perennial herb, its underground rhizomes rounded slender, white meat, resembles silver, hence the name Stachys floridana; According to legend Journey to the West., also known as the "official told us. The planted area rarely, Luoyang Yanshi county (city) is the main producer, accounting for about 95% of national output, a large number of listed only around the Spring Festival, and sold at home and abroad, often in short supply in the market . In this study, on Stachys floridana apical meristem culture conditions, different treatments to improve the effect of shoot tips regenerated plants detoxification rate and different explants suitable way to explore the Stachys floridana renewable rapid propagation. The results showed:As the basic medium for many flower Betony culturation in vitro, MS was the best in all media include White, MA, B5 and Ne. The optimal medium fot the tip meristem culture was MS+6-BA0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+sucrose 4%, on which 6.5g/L plantlet ratio was produced. The results showed that the size of excised shoot tip was negative correlated with the virus-free rate of plantlet. Too smaller shoot tip make operation and regeneration difficult. The attempt of using 0.5 mm length shoot tip was successed .The virus-free rate could be increased markedly by using the tip meristem culturation technique together with the techniques such as cut of stem tip more than one times, higher temperature pre-treatment of the planr material. However the survival rate might be degraded. KEY WORDS: Stachys floridana，Stem tip culture， detoxication， Plant regeneration， Culture-medium II 河南科技大学本科生毕业论文 目 录 摘要 .............................................................................................................................. I ABSTRACT ............................................................................................................... II 录 ......................................................................................................................... III 目 符号说明 ................................................................................................................... IV 第一章 前 言 .............................................................................................................. 1 1.1 银条的研究 ........................................................................................................ 1 1.1.1银条的形态特征及生产现状 ....................................................................... 1 1.1.2 银条的食用价值 ........................................................................................ 2 1.2 茎尖脱毒的研究 ................................................................................................ 2 1.2.1 脱毒效果的.......................................................................................... 2 1.2.2脱毒材料的保存快繁 ................................................................................... 3 1.3 银条的研究现状 ................................................................................................ 4 1.3.1银条茎尖玻璃化法超低温保存及其植株再生 ............................................ 4 1.3.3银条加工中烫漂护色工艺的研究 ................................................................ 6 6 1.3.4 银条根茎膨大过程中生理生化变化的研究 ............................................. 1.4 本研究的目的和意义 ....................................................................................... 7 第二章 实验部分 ........................................................................................................ 8 2.1 试验方案的 ................................................................................................ 8 2.2 材料与方法 ........................................................................................................ 8 2.2.1 材料及处理 ................................................................................................. 8 2.2.2 仪器与试剂 ............................................................................................... 8 2.2.3 主要溶液及配制 ........................................................................................ 9 2.2.4 实验设计与管理 ...................................................................................... 10 2.2.5 实验指标的测定原理及方法 .................................................................. 10 2.2.6 数据的处理与分析 .................................................................................. 10 2.3 结果与分析 .................................................................................................... 10 2.3.1 比较不同培养基对愈伤组织诱导的影响 ................................................. 10 2.3.2 不同处理对茎尖分生组织脱毒效果的影响 ............................................ 11 2.3.3 比较不同激素对生根的影响 .................................................................. 12 2.4讨论 .................................................................................................................. 12 2.5 结论 ................................................................................................................ 13 参考文献 ................................................................................................................... 15 致 谢 ......................................................................................................................... 18 附 录 ......................................................................................................................... 19 英语文献 ................................................................................................................... 20 III 银条茎尖的脱毒组织培养和植株再生 符号说明 缩略词 中 文 2,4-D 2,4-二氯苯氧乙酸 6-BA 6-苄氨基嘌呤 MS MS培养基 NAA 1-萘乙酸 IBA 吲哚丁酸 EDTA 乙二胺四乙酸 IV 河南科技大学本科生毕业论文 第一章 前 言 银条(Stachys floridana Schuttl .ex Benth)，又名地灵，系唇形科水苏属多年生蓄根草本植物，其地下根状茎圆状细长，肉质洁白，酷似白银，故名银条;据传是唐僧取经过程中所得，又被誉为“唐僧肉”。银条作为功能性食品具有很高的药用价值，对治疗高血压、高血脂和肥胖等常见疾病有着显著疗效。近年来，我国专家首次发现银条内含有丰富的水苏糖，并证明其水苏糖的含量比国际上通用的大豆原料提取的含量要高出2,3倍，而水苏糖能迅速改善人体消化道内环境，调节微生态平衡，可软化血管、降低血脂、改善血液循环具有独特的功效，还具有润肺、益肾之功效，其益寿延年的作用非常显著，是目前国际上非常畅销的保健 [1]药品之一。银条还具有独特的食用价值，其肉质脆嫩，无纤维、可盐渍和凉拌等，风味独特，2001年6月上海APEC会议，六国首相品尝后称其为“世界奇菜”。银条主产于华北和新疆等地，处于半野生状态，喜温暖和湿润的气候，对土壤要求较严格，需有水而不湿、有沙而不松的沙白土。目前，全国人工种植面积很少，洛阳偃师县(市)是主要产地，约占全国产量的95%，仅春节左右大量上市，同时远 [2]销国内外，在市场上常供不应求。 1.1 银条的研究 1.1.1银条的形态特征及生产现状 偃师银条根系较浅(地上茎直立。株高59,70 cm。叶对生。叶卵圆形，绿色。花紫色。轮伞花序。花期5,6月份。地下有膨大的根状甸甸茎，根状茎侧生有具鳞叶。质地细密、嫩脆多汁、色白、味甘。果实为小坚果，含1粒种子，黑色。 [9]卵圆形或长卵圆形。 偃师银条现种植面积400hm ，产量1万t，占国内银条产量的95 以上，每667m 银条能为当地农民带来4000~6000元收入。偃师银条种植面积受市场销售量影响较大，产品销售旺时，种植面积达700hm ，产量2万t，常年种植面积400hm 左右，产量1(1万t左右。偃师银条集中种植在城关乡、三化乡，城关乡的后庄、 1 银条茎尖的脱毒组织培养和植株再生 东寺庄、西寺庄等沿河一带生产的银条质最好，被定为“河南省无公害农产品种植基地”。偃师市银条加工企业现有14家，有5家银条生产企业通过IS09001国际质量体系认证。其中西银公司等三家企业在国家商标局注册了商标，并获国家化管理委员会和河南省质监局颁发的“无公害产品标志”证书，产品销往北京、上海、广州等32个大中城市，出口到日本、韩国、新加坡、泰国、俄罗斯等8个国家和地区。在第二届中西部国际博览会上，偃师银条获2项金奖，5家参展企业 [8]的产品被抢购一空，签订订单1万t。 1.1.2 银条的食用价值 银条菜富合蛋白质、脂肪、碳水化合物和氨基酸，是食用和药用兼备的名特蔬菜品种。对人体有多种保健效果，延年益寿作用明显，在《中国蔬菜品种志》中已有详细的记载。河南偃师地区的“偃师银条”最为有名，具有悠久的食用历史。它富含一种被世界食品医药界誉为“健康宝贝”和“超强双歧因子”的物质-水苏糖。作为天然四糖的水苏糖，简单的结构表示为半乳糖-半乳糖-葡萄糖-果糖。是功效最优越的益生元，是已获得美国FDA认证的寡糖产品。添加水苏糖的食品，因为具有抗衰老、健康防病的功效，日渐风靡于日本和欧美市场。据现代科学测定:银条富含糖类、酚类、维生素C、粗蛋白、氨基酸、有机酸等物质，对软化血管、 [6]降低血脂、改善血液循环具有独特的疗效。 1.2 茎尖脱毒的研究 1.2.1 脱毒效果的检测 银条(Stachys floridana Schutt1(ex Benth()为我国传统蔬菜之一，具有广阔的市场开发前景，其肉质根茎中含有的水苏糖(80 g?kg DM)是一种能显著促进双歧杆菌增殖的功能性低聚糖，被誉为“超强双歧因子”。传统上，以根茎无性繁殖而致的病毒积累与传播给生产带来严重影响。进行离体诱导条件下的种茎生产，不仅能解决种性退化和病害蔓延的问题，而且能节约繁种用地。已有报道阐述了 [30]银条离体快繁的条件和激素互作对其根茎离体诱导的影响。 2 河南科技大学本科生毕业论文 在一个植物体内，病毒易于通过维管系统而移动，但在分生组织中不存在维管系统。病毒在细胞间移动只能通过胞间连丝，速度很慢，难以赶上活跃生长的茎尖;在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性高，竞争抑制了病毒的复制;在茎尖 [16]存在高水平内源生长素，也可能抑制病毒的增殖。主要步骤:(,)茎尖的剥离:此步是技术关键，一般在解剖镜下操作。2-3cm的茎段，剥去大叶，水冲洗1h左右，酒精快速消毒，无菌条件下5%漂白粉溶液(或其他消毒剂)消毒7-10min，无菌水清洗，解剖镜下剥取茎尖。(2)切取茎尖的大小虽然切取茎尖越小，带有病毒的可能性就越小，但组织培养中，切取的茎尖太小，则不易成活。不同种类 [14]的植物和不同病毒，切取的最适茎尖大小也不同。(3)组织培养常用基本培养基是MS培养基或White培养基，它有较高浓度的无机盐，对促进组织分化和愈伤组织生长有利;植物生长调节的种类和配比依培养种类和生长时期来调整。 1.2.2脱毒材料的保存快繁 银条的离体培养以MS作为基本培养基最为适宜，再生苗生长快速，植株健壮。茎尖分生组织培养在MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖4,+琼脂6.5g/L上，成苗率可达74.1,，最适宜茎尖的培养;经指示植物法、电镜观察检测，再生植株的脱毒率随茎尖切割长度的减小而提高，但过小的茎尖操作、培养困难， [13]培养周期长，成苗率低。0.5mm大小的茎尖成苗率与脱毒率相对较高，分别为71.4,、30.0,，较为适合培养;茎尖的重复切割培养与接种植株进行预热处理均有显著提高脱毒率的作用，但同时也降低了成苗率。植株在42?高温下，经15d热处理后，0.5mm大小茎尖切割培养成苗率与脱毒率分别达到50.0,、57.1,，重复切割培养3次后则分别为28.6,、87.5,。为减小操作难度，缩短周期，银条植株经42?，15d热处理后，切取0.5mm大小茎尖进行一次培养较为适宜。 不同生育时期的外植体愈伤组织的诱导能力不同，刚展开的幼嫩叶片、粗壮的幼嫩茎段及花蕾长度在0.5 cm左右时的花药最适宜愈伤的诱导，诱导率最高。幼嫩茎段与花药在MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 1.5mg/L+IAA 0.5mg/L培养基上，幼嫩叶片在MS+6-BA 2.5mg/L+NAA 1.5mg/L+IAA 1.0mg/L上，愈伤组织诱导效果最好，愈伤生长快速，颜色鲜艳，继代培养不褐化。愈伤组织不定芽的分化中，花药诱导形 3 银条茎尖的脱毒组织培养和植株再生 成的愈伤难以形成不定芽;叶片与茎段诱导的愈伤可以在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.8mg/L+GA_3 2.0mg/L上分化形成不定芽，诱导分化率分别为71.4,、78.6,。 对幼嫩叶片、幼嫩茎段与茎尖进行不定芽的直接诱导与增殖，发现银条叶片组织未能再生;茎尖、茎段组织直接诱导较大不定芽的再生率较低，平均每个外植体最多可诱导不定芽5,7个。而通过茎段先诱导出不定芽芽团，再进行芽的伸长这一途径，每个外植体诱导的不定芽数平均可提高到14.3个，且芽团经5次继代增殖再生能力没有衰退表现，再生植株生产潜力非常巨大，是一条较优的再生途径。茎段不定芽芽 团诱导培养基为添加6-BA 5.0mg/L的MS培养基;增殖培养基为MS+6-BA 4.5mg/L;不定芽伸长培养基以MS+6-BA1.5 mg/L+NAA 0.4mg/L较好。 对不同温度、光照条件、以及蔗糖、6-BA浓度对离体培养条件下银条根 状茎诱导的影响进行研究表明:全黑暗的培养条件是银条根状茎诱导的必需因子，短日照与长日照均促使甸旬茎发育成侧枝;高浓度蔗糖有利于根状茎的诱导，单独使用低浓度的蔗糖(3%)不能诱导根状茎产生而形成黄化的侧枝，再添加 6-BA 5..0mg/L后虽然可以形成根状茎，但单株产量很低。6-BA对根状茎形成具有明显的促进作用，能增加根状茎数，提高单株产量。银条根状茎的 诱导温度以20?为宜，提高温度会降低根状茎数。 再生苗在1/2 MS+N AA o.5mg/L十活性炭0.3%上生根效果最好，将生根的完整植 株移栽到消过毒的1细沙:1黏土的基质上，成活率高达 [23]95.8%。 1.3 银条的研究现状 1.3.1银条茎尖玻璃化法超低温保存及其植株再生 为长期稳定保存银条种质,建立了玻璃化法超低温保存其茎尖的技术体系。选择继代4次的银条无菌壮苗,5?低温驯化14d;剥取5mm的茎尖,在含有0.5mol.L-1蔗糖的MS(无Ca2+)液体培养基预培养1d;25?条件下经改良MS+2PVS2装载20min;在-20?,95%乙醇浴中以PVS2脱水处理4h;更换新鲜的PVS3后投入液氮,保存24h后取出冷冻管在40?水浴中化冻1min;以含有1.2mol.L-1蔗糖的改良MS(无Ca2+)溶液洗涤2次,每次10min;冻存后的茎尖相对存活率超过70%。将冻 4 河南科技大学本科生毕业论文 存后的茎尖转接到再生培养基上,暗培养20d后转入正常光照条件下培养,存活率达63.7%;继续培养得到正常分化和生长的再生植株,生根后可移栽成活。 1.3.2关于银条的茎尖分生组织的脱毒及再生 以“二细一粗”银条作为研究试材，对银条茎尖分生组织的培养条件、不同处理对提高茎尖再生植株脱毒率的效果进行了研究，并利用不同外植体探讨了银条再生快繁的适宜途径。目的是获得脱毒种株并进性大量、快速的繁殖，以解决生产中银条由于结籽率低，且难以培养成苗，长期以根状茎进行无性繁殖所造成的病毒累积的问题，并为进一步进行银条的营养利用、生理代谢、生物育种研究奠定基础。试验结果表明: 银条的离体培养以MS作为基本培养基最为适宜，再生苗生长快速，植株健壮。茎尖分生组织培养在MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖4,+琼脂6.5g/L上，成苗率可达74.1,，最适宜茎尖的培养;经指示植物法、电镜观察检测，再生植株的脱毒率随茎尖切割长度的减小而提高，但过小的茎尖操作、培养困难，培养周期长，成苗率低。0.5mm大小的茎尖成苗率与脱毒率相对较高，分别为71.4,、30.0,，较为适合培养;茎尖的重复切割培养与接种植株进行预热处理均有显著提高脱毒率的作用，但同时也降低了成苗率。植株在42?高温下，经15d热处理后，0.5mm大小茎尖切割培养成苗率与脱毒率分别达到50.0,、57.1,，重复切割培养3次后则分别为28.6,、87.5,。为减小操作难度，缩短周期，银条植株经42?，15d热处理后，切取0.5mm大小茎尖进行一次培养较为适宜。 不同生育时期的外植体愈伤组织的诱导能力不同，刚展开的幼嫩叶片、粗壮的幼嫩茎段及花蕾长度在0.5 cm左右时的花药最适宜愈伤的诱导，诱导率最高。幼嫩茎段与花药在MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 1.5mg/L+IAA 0.5mg/L培养基上，幼嫩叶片在MS+6-BA 2.5mg/L+NAA 1.5mg/L+IAA 1.0mg/L上，愈伤组织诱导效果最好，愈伤生长快速，颜色鲜艳，继代培养不褐化。愈伤组织不定芽的分化中，花药诱导形成的愈伤难以形成不定芽;叶片与茎段诱导的愈伤可以在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.8mg/L+GA_3 2.0mg/L上分化形成不定芽，诱导分化率分别为71.4,、78.6,。 对幼嫩叶片、幼嫩茎段与茎尖进行不定芽的直接诱导与增殖，发现银条叶片组织未能再生;茎尖、茎段组织直接诱导较大不定芽的再生率较低，平均每个外植体最多可诱导不定芽5,7个。而通过茎段先诱导出不定芽芽团，再进行芽 5 银条茎尖的脱毒组织培养和植株再生 的伸长这一途径，每个外植体诱导的不定芽数平均可提高到14.3个，且芽团经5次继代增殖再生能力没有衰退表现，再生植株生产潜力非常巨大，是一条较优的 [24]再生途径。 1.3.3银条加工中烫漂护色工艺的研究 郭香凤，史国安以银条为实验材料，以成品的褐变度为指标，对银条加工中烫漂护色工艺参数进行了研究。实验结果表明:在95?烫漂温度下，烫漂3(0min，最佳褐变抑制剂组合为0(05, L-cys、0(05, VC、1, CA，产品的外观色泽洁白;不同抑制剂抑制银条褐变作用的顺序是CA>L-cys>VC。单独使用各种物理和化学抑制措施时，在95?温度下， 热烫3(0min，或分别在烫漂水中添加1, CA、0(05, L-cys、1, 亚硫酸氢钠时护色效果显著。单独使用抗坏血酸对银条护色 [20]效果不显著。鉴于亚硫酸氢钠的副作用， 建议银条加工过程中应避免其危害。银条采后加工过程中发生的褐变主要是由酶促褐变引起的。单独或复合使用烫漂、 [3]柠檬酸、L(半胱氨酸等酶促褐变抑制措施对防止银条的褐变是有效的。 1.3.4 银条根茎膨大过程中生理生化变化的研究 张书玲，刘建凤以银条为材料，探讨了银条根状茎中维生素C(VC)、抗坏血酸氧化酶(AAO)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)在其根茎膨大时期含量的积累变化。结果表明:在根茎开始膨大60 d后，VC含量最高达61 rag,100g;AAO酶活性在根茎膨大后30 d达最大值0(147 rag,g;SOD和POD酶活性在银条根茎膨大后75 d达到最高值为9(O5 U,mg和l3(6O [9]nmol?min-1?g-1;PPO在根茎膨大过程中出现上升一下降一上升的趋势。 银条根茎含有丰富的VC，特别是在根茎膨大中后期VC含量达到最大值。根据各国对成年人推荐的VC日摄人量，每日只需食用100~200 g的银条就能满足人体的需要。VC含量在根茎膨大后75 d出现稍微下降现象，可能是因为霜降后地上部分开始枯死导致。所以，在霜降前(10月中下旬)采收银条会含有较高的VC。同时抗坏血酸氧化酶(AAO)和抗坏血酸过氧化物酶是VC代谢过程中主要的氧化分解酶u 。在植物细胞内，VC的含量受这2个酶的影响。所以VC的含量和抗坏血 [1]酸氧化酶的活性大致相反而不会完全相反。 6 河南科技大学本科生毕业论文 植物在生命过程中会产生活性氧(包括过氧化氢、超氧阴离子、羟自由基和单线态氧等)，而组织衰老的机理多归于超氧自由基引起的膜脂氧化与过氧化的损害。SOD、POD是植物抗氧化酶系统中2种重要的酶。它们在活性氧的清除、抑制膜脂过氧化等植物抗逆生理方面发挥作用。随着银条根茎的生长，在膨大后60 d(11月上旬)，银条的SOD和POD活性迅速上升，可能是因为霜降以后，天气逐渐变冷，在逆境下植物产生更多的氧自由基，加剧膜脂过氧化，SOD和POD酶活性的上升，是植物细胞对低温逆境的一种保护性应激反应。另外，PPO能催化各种酚类物质氧化成为醌，再聚合成黑色素，并随时间的延长而逐渐变黑，是果蔬的储 [27]藏和加工过程中引起褐变的主要酶类，从而降低果实色泽和品质。银条在生长的不同成熟期PPO的活性不同，在膨大后30,45 d(9月下旬至l0月上旬)时PPO [2]的活性较低，随后缓慢上升，可以利用这个时期加工银条，以提高其抗褐变作用。 1.4 本研究的目的和意义 通过对银条茎尖分生组织的培养条件、不同处理对提高茎尖再生植株脱毒率的效果进行了研究，并利用不同外植体探讨了银条再生快繁的适宜途径。目的是获得脱毒种株并进性大量、快速的繁殖，以解决生产中银条由于结籽率低，且难以培养成苗，长期以根状茎进行无性繁殖所造成的病毒累积的问题，并为进一步进行银条的营养利用、生理代谢、生物育种研究奠定基础。 银条栽培历史悠久，自唐代以来偃师开始了银条种植，由于运输加工条件限制，种植面积较小，主要集中在伊河与洛河的夹川地带。改革开放之后，随着加工运输条件的改善，偃师市开始大面积种植银条，成为当地农村经济支柱产业。银条富含一种被世界食品医药界誉为“健康宝贝”和“超强双歧因子”的物质-水苏糖。作为天然四糖的水苏糖，简单的结构表示为半乳糖-半乳糖-葡萄糖-果糖。是功效最优越的益生元，是已获得美国FDA认证的寡糖产品。添加水苏糖的食品， [5]因为具有抗衰老、健康防病的功效，日渐风靡于日本和欧美市场。据现代科学测定:银条富含糖类、酚类、维生素C、粗蛋白、氨基酸、有机酸等物质，对软化血管、降低血脂、改善血液循环具有独特的疗效。经过研究，让广大人民群众更好的了解银条这种有益于身体健康的食品，，使偃师银条成为百姓餐桌上的普通菜 [22]肴，带动偃师银条产业发展。 7 银条茎尖的脱毒组织培养和植株再生 第二章 实验部分 2.1 试验方案的设计 本研究选取银条幼茎和幼叶的外植体获得愈伤体系，供试材料银条(Stachys floridana Schutt1(ex Benth()采自河南省洛阳市偃师东四庄。以“二细一粗”银条作为研究试材，对银条茎尖分生组织的培养条件、不同处理对提高茎尖再生植株脱毒率的效果进行了研究，并利用不同外植体探讨了银条再生快繁的适宜途径。目的是获得脱毒种株并进性大量、快速的繁殖，以解决生产中银条由于结籽率低，且难以培养成苗，长期以根状茎进行无性繁殖所造成的病毒累积的问题，并为进一步进行银条的营养利用、生理代谢、生物育种研究奠定基础。 2.2 材料与方法 2.2.1 材料及处理 2012年11月期间挖掘河南省偃师市东四庄新鲜银条根状茎和叶片，取室内栽植银条“二细一粗”品种植株的幼嫩茎尖 (1cm左右)，去掉较大叶片，用体积分数 0.5,的次氯酸钠溶液消毒7min，无菌水冲洗3,5次，在双筒解剖镜无菌条件下切茎尖分生组织 (0.3-0.5mm)，迅速接种于添加不同生长调节剂的培养基上，进行茎尖培养试验。 将茎尖培养形成的无菌苗的较大茎尖 (0.3-0.5cm)与切割成带两片叶的单节茎段，分别转接于茎 尖增殖与根状茎诱导培养基上，进行茎尖增殖与根状茎诱导试验。 2.2.2 仪器与试剂 (1)仪器:高压灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台、烧杯、试管、酒精灯、镊子、剪刀、滤纸、锥形瓶、培养皿、移液管(5、1、0.5ml)、玻璃棒、微波炉、棉线、牛皮纸、分析天平、玻璃板、广口瓶、解剖刀、铅笔 (2)试剂:80%乙醇溶液、大量元素(母液?):25ml、大量元液(母液?):0.5 mg/L、 8 河南科技大学本科生毕业论文 有机溶液:0.5 mg/L、EDTA:0.5 mg/L、FeSO4溶液:0.5 mg/L、肌醇:0.05g、蔗糖:15g、琼脂:7g、NAA(萘乙酸1mg/ mL):5 mL、6-BA(6-苄基嘌呤0.1 mg/ mL):1mL、IBA、2,4-D 2.2.3 主要溶液及配制 (1)配制1.0 mol/L的NaOH溶液，用以调节培养基的PH值至5.8-6.0。 (2)按照MS基本培养基配方配制MS、1/2 MS和1/4 MS 3种大量元素含量不同的培养基。其中，MS基本培养基配方见表2-1。 (3)分别配制NAA、IBA植物生长调节剂母液(用NaOH溶液助溶)，用以设置不同激素组合。 表2-1 MS基本培养基配方 母液 药品名称 浓度(mg/L) 扩大倍数 NHNO 33 000 43 KNO 38 000 3 大量元素 CaCl?2HO 8 800 20 22 MgSO?7HO 7 400 42 KHPO 3 400 24 KI 166 HBO 1 240 33 MnSO?4HO 4 460 42 ZnSO?7HO 1 720 42微量元素 400 NaMoO?2HO 50 242 CuSO?5HO 5 42 CoCl?6HO 5 22 FeSO?7HO 5560 42 铁盐 100 Na-EDTA?2HO 7460 22 肌醇 20000 烟酸 100 盐酸吡哆醇(维生素B) 100 6有机成分 100 盐酸硫胺素(维生素B) 100 1 甘氨酸 400 9 银条茎尖的脱毒组织培养和植株再生 2.2.4 实验设计与管理 取室内栽植银条 二‘细一粗’品种植株的幼嫩茎尖 (1cm左右)，去掉较大叶片，用体积分数 0.5,的次氯酸钠溶液消毒7min，无菌水冲洗3,5次取室内栽植银条 二‘细一粗’品种植株的幼嫩茎尖 (1cm左右)，去掉较大叶片，用体积分数 0.5,的次氯酸钠溶液消毒7min，无菌水冲洗3,5次，在双筒解剖镜无菌条件下切茎尖分生组织 (0.3—0.5cm)，迅速接种于添加不同生长调节剂的培养基上，进行茎尖培养试验。 将茎尖培养形成的无菌苗的较大茎尖 (0.3—0.5cm)与切割成带两片叶的单节茎段，分别转接于茎 尖增殖与根状茎诱导培养基上，进行茎尖增殖与根状茎诱导试验。 基本培养基为Ms，蔗糖30g?L，琼脂6(5g?L (pH5(8)，培养温度26 28~C，光照强度 2000—3000lx，光照时间14h,d。根状茎诱导试验除光照处理外均培养在黑暗条件下，培养温度 20?。其它条件同茎尖培养。 2.2.5 实验指标的测定原理及方法 (1)叶、茎段愈伤组织诱导率及其生长状态 (2)每克愈伤组织生芽数(个/g)、每克愈伤组织生根数(个/g)及其各自生长状态 (3)生根速度及其生物形态 2.2.6 数据的处理与分析 采用方差分析(P<0.05)和LSD进行数据处理和分析，计算结果以均数?标准差(x?S)表示，检验水准α,0.05。其中，小写字母表示5%显著差异，大写字母表示1%极显著差异。 2.3 结果与分析 2.3.1 比较不同培养基对愈伤组织诱导的影响 经筛选，诱导茎尖的最适培养基为MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 1.0mg/L，叶的愈 10 河南科技大学本科生毕业论文 伤组织诱导率可达96,，茎段愈伤组织诱导率可达92%;而使用MS+ NAA 1mg/L+6-BA 0.2mg/L时虽然也可达到90,，但是有30%茎段同时会出现不定芽。同时发现银条的外植体对2,4-D敏感，超过0.5 mg/L即可导致褐化。进一步的实验表明淡黄色疏松的愈伤组织更适合器官分化。 表2—1 不同外源激素对银条的茎尖和茎段等外植体愈伤组织的诱导 Table2 The effects of different external hormones on the induction of embryo callus of cotyledon and hypocotyls 生长素(mg/L) 细胞分裂茎尖愈伤组织诱茎段愈伤组织生长状态 Auxin 素(mg/L)导率 诱导率 Growth status Cytokinin Frequency of Frequency of callus induction callus induction 2,4-D NAA 6-BA of leaf (%) of stem section (%) 0 1 0.1 96 92 绿色疏松，生长较快 0.5 0 0.2 45 39 淡黄色疏松，易褐化 0 0.5 0.2 87 90 绿色疏松，30%茎段直接分化到芽 1 0 0.2 2 1 快速膨大后褐化 0 0.5 0.1 53 60 黄褐色疏松，易褐化 0 0.5 0 24 19 淡黄色疏松，生长缓慢 0 2 0.5 28 20 绿色致密，生长缓慢，80%茎段生 芽，玻璃化 注:基本培养基:MS培养基;下表同。 Note: The basic medium : MS, the same as below 2.3.2 不同处理对茎尖分生组织脱毒效果的影响 经筛选，诱导茎尖的最适培养基为MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 1.0mg/L，说明银条的愈伤组织对 6-BA较敏感，低浓度的细胞分裂素即可实现芽分化的目的。 11 银条茎尖的脱毒组织培养和植株再生 表2—2不同外源激素对茎尖分生组织脱毒效果的影响 The effect of different external hormones on the differentiation of organs 激素组合(mg/L) 芽生长状态 每克愈伤组织 根生长状态 每克愈伤组织 Combination of 生芽数(个/g) The growth 生根数(个/g) The growth hormones No. of bud status of bud No. of root status of root per gram per gram 0.5NAA+1.06-BA 5 6 ，，， ，， 0.5NAA+0.56-BA 3 12 ，， ，，， 0.5NAA+2.06-BA 4 1 ，， 0.2NAA+1.06-BA 3 7 ，， ， 0.2NAA+0.56-BA 2 10 ， ，， 1NAA+0.56-BA 5 18 ，， 0.52,4-D+1.06-BA 0 7 ， 1 IBA+0.56-BA 2 7 ， ，，，代表诱导速度快，健壮，，，次之，，代表诱导速度慢且发育迟缓 2.3.3 比较不同激素对生根的影响 分别将芽转接至无附加激素的MS和MS+IBA0.2 mg/L的生根培养基上，其中附加低浓度IBA(<0.2 mg/L)的培养基的生根速度较快，根系较粗壮，但是叶片易卷曲;而无附加激素的MS的生根速度较慢，但是叶片色深，无卷曲，易于炼苗。 2.4讨论 (1)不同培养基对愈伤组织的影响 银条的离体培养以MS作为基本培养基最为适宜，再生苗生长快速，植株健壮。茎尖分生组织培养在MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖4,+琼脂6.5g/L上，成苗率可达74.1,，最适宜茎尖的培养;经指示植物法、电镜观察检测，再生植株的脱毒率随茎尖切割长度的减小而提高，但过小的茎尖操作、培养困难，培养周期长，成苗率低。 (2)不同处理的茎尖脱毒效果 12 河南科技大学本科生毕业论文 再生植株的脱毒率随茎尖切割长度的减小而提高，但过小的茎尖操作、培养困难，培养周期长，成苗率低。0.5mm大小的茎尖成苗率与脱毒率相对较高，分别为71.4,、30.0,，较为适合培养;茎尖的重复切割培养与接种植株进行预热处理均有显著提高脱毒率的作用，但同时也降低了成苗率。 2.5 结论 银条的离体培养以MS作为基本培养基最为适宜，再生苗生长快速，植株健壮。茎尖分生组织培养在MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖4,+琼脂6.5g/L上，成苗率可达74.1,，最适宜茎尖的培养;经指示植物法、电镜观察检测，再生植株的脱毒率随茎尖切割长度的减小而提高，但过小的茎尖操作、培养困难，培养周期长，成苗率低。0.5mm大小的茎尖成苗率与脱毒率相对较高，分别为71.4,、30.0,，较为适合培养;茎尖的重复切割培养与接种植株进行预热处理均有显著提高脱毒率的作用，但同时也降低了成苗率。植株在42?高温下，经15d热处理后，0.5mm大小茎尖切割培养成苗率与脱毒率分别达到50.0,、57.1,，重复切割培养3次后则分别为28.6,、87.5,。为减小操作难度，缩短周期，银条植株经42?，15d热处理后，切取0.5mm大小茎尖进行一次培养较为适宜。 不同生育时期的外植体愈伤组织的诱导能力不同，刚展开的幼嫩叶片、粗壮的幼嫩茎段及花蕾长度在0.5 cm左右时的花药最适宜愈伤的诱导，诱导率最高。幼嫩茎段与花药在MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 1.5mg/L+IAA 0.5mg/L培养基上，幼嫩叶片在MS+6-BA 2.5mg/L+NAA 1.5mg/L+IAA 1.0mg/L上，愈伤组织诱导效果最好，愈伤生长快速，颜色鲜艳，继代培养不褐化。愈伤组织不定芽的分化中，花药诱导形成的愈伤难以形成不定芽;叶片与茎段诱导的愈伤可以在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.8mg/L上分化形成不定芽，诱导分化率分别为71.4,、78.6,。 对幼嫩叶片、幼嫩茎段与茎尖进行不定芽的直接诱导与增殖，发现银条叶片组织未能再生;茎尖、茎段组织直接诱导较大不定芽的再生率较低，平均每个外植体最多可诱导不定芽5,7个。而通过茎段先诱导出不定芽芽团，再进行芽的伸长这一途径，每个外植体诱导的不定芽数平均可提高到14.3个，且芽团经5次继代增殖再生能力没有衰退表现，再生植株生产潜力非常巨大，是一条较优的再生途径。茎段不定芽芽 团诱导培养基为添加6-BA 5.0mg/L的MS培养基;增殖培养基为MS+6-BA4.5mg/L ; 13 银条茎尖的脱毒组织培养和植株再生 不定芽伸长培养基以MS+6-BA 1.5mg/L+NAA0.4mg/L较好。 对不同温度、光照条件、以及蔗糖、6一BA、CCC浓度对离体培养条件下银条根 状茎诱导的影响进行研究表明:全黑暗的培养条件是银条根状茎诱导的必需因子，短 日照(8扮d)与长日照(14扮d)均促使甸旬茎发育成侧枝;高浓度蔗糖有利于根状茎的 诱导，单独使用低浓度的蔗糖(3%)不能诱导根状茎产生而形成黄化的侧枝，再添加 6一BA 5.Om留L十CCC 50Om留L后虽然可以形成根状茎，但单株产量很低。6一BA与CCC 对根状茎形成具有明显的促进作用，能增加根状茎数，提高单株产量。银条根状茎的 诱导温度以20?为宜，提高温度会降低根状茎数。 再生苗在1/2 Ms+N AA o.sm留L十活性炭0.3%上生根效果最好，将生根的完整植 株移栽到消过毒的1蛙石:1珍珠岩的基质上，成活率高达95.8%。 14 河南科技大学本科生毕业论文 参考文献 [1] 乔琦, 苗艳芳, 郭大勇等. 洛阳地区特色物药的GAP实践和发展[J]. 时珍国医 国药, 2007, 142(7): 1634-1635. 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C.植物和环境科学，约翰内斯堡,PO Wits2050，南非。 D.德国生态模型.莱比锡哈雷环境研究,UFZ中心。 E.通信作者: Email: B.Lamont@curtin.edu.au 摘要:我们在南澳大利亚西部物种丰富的桑地兰兹研究山龙眼物种生态学和保护的山龙眼物种25年。通过土地测算栖息地的丧失了研究他们对保护的最大的影响及在过去的50年中的影响地位。确定在灌木林保护管理的最佳条件，需要详细的正在考虑的物种的认识，包括种群特征，消防制度，生长条件和与其他物种的相互作用。那里的人口已支离破碎，单株种子产量也下降。集团最脆弱的火灾，疾病，虫害的变幻莫测，杂草和气候变化是非孵豆芽，而不是与种群灭绝的，到目前为止仅限于非发芽的种。最近的短的间隔火灾似乎在景观尺度上的影响不大，可能是因为他们是罕见的和片状的。火灾的时间间隔超过50年25–也能导致局部灭绝。高达200的可行的种子在山龙眼父母需要更换南长时条件差(低火后降雨，商业切花采收)和种子库的研究这个尺寸要花12年时间才能达到。种子生产是很少受到传粉昆虫，但年际季节和资源可用性的影响是重要的。预烧死的植物是为下一代的种子源当火灾发生的差。收获的种子播火后有多以表彰他们为濒临灭绝的物种。由于人类赤裸的地区结果在理想的条件下对植物的生长和结实。然而，在B / B南的情况下，扰动人类已培育杂交，威胁到这两个物种的遗传完整性，而细质土壤不适宜的定植或康复。在夏季–秋水的可用性是至关重要的，提出了一个问题，如果保护管理在该地区的降雨量下降的趋势继续下去。我们的模拟模拟表明，三山龙眼共生概率最大时，火是围绕一个平均随机13年，并在火倾向与火灾 20 河南科技大学本科生毕业论文 后招聘成功的景观变化。模拟结果表明，生存的前欧洲频繁的火灾场景的新技术表明不发芽的山龙眼不能南澳大利亚西部。然而，我们要充分发掘的长距离扩散的保护意义种子，最近的研究表明在B. Hookeriana超过2.5公里。 引言:本文综述了保护生物学的山龙眼在南澳大利亚西部的植被火灾发生。这。区域包含67(80%)的84种山龙眼扇子狭义(眼科;Thiele和拉迪吉斯1996，这也列出机构名称)。其中，64只限于地中海气候地区的南澳大利亚西部边界的定义。两种延伸到干旱地区(B，B Ashbyi Elderiana)和B景程是东280公里对埃斯佩兰斯(泰勒和料斗1988)。山龙眼通常是在广泛的物种丰富的植物的南澳大利亚西部最突出的分类群。所谓的南部和北部的包含59个物种只有五种常见的。在南澳大利亚西部的山龙眼是多年生木本植物，从根茎匍匐植物有所不同，如B.第，单茎树高度的10米，如B.茅。百分之六十的物种被杀害时，他们的冠冕燃烧和依靠更换在火灾后植被恢复的幼苗，而其余的植物不同程度(拉蒙特和马克1995)。一些山龙眼释放它们的种子一旦成熟，但大多数(和本次审查的重点)保留他们的视锥细胞的变化直到木质卵泡刺激程度开的火(拉蒙特和康奈尔1996)。 本文总结了我们的工作在过去的25年在这一地区的生态学和保护生物学的山龙眼。我们的目的是确定的生物和非生物的约束在试图确定山龙眼保护现状在野外，选择有效的管理。我们问下面的问题: (1)栖息地丧失的威胁保护是什么程度; (2)有什么限制开花和种子的产生; (3)的关键是如何在种群生存力的消防制度和遗传多样性; (5)疾病是多么的重要，杂草和路边生境种群生存力; (6)在何种程度上气候和基板的限制物种分布; 答案是试图通过案例研究和仿真模型。我们强调我们的建模工作，试图确定保持人口的关键和最佳条件活力。在每个自然历史的详细调查物种提供的人口和环境数据要支持这些模型。在整个审查我们参考“最佳”和“最小”(关键)火在系到各种人口行为的时间间隔我们的上下文中使用的术语“最佳“全民健身(1992)，所指的情况最大的遗传贡献的平均个人未来的几代人(即平均防火间距，平均产生 21 银条茎尖的脱毒组织培养和植株再生 最大的人口增长)。最小的火间距是指火灾之间低于平均回报的时间间隔当地的人口灭绝很可能在50年非。 栖息地面积和领域的消失 天鹅沿海平原是主要的栖息地和山龙眼恰逢一个高种群密度和高度破碎化景观。1986，在山龙眼林地55%已被清除(料斗和伯布里奇1989)。只有7%的原来的281 000公顷，是目前保护区。幸运的是，山龙眼往往发生在最贫穷的土壤(砂和红土)，这些地区被清除的过去农业。开放的“光”的土地，在第二次世界大战后，和特别是北部和南部的世纪60年代和70年代，导致了直接威胁，从土地手续与疾病和外来杂草的传播。有罕见的山龙眼变得更加稀少。八拔克西木属类群列为罕见的而受到威胁，其中四只有人口总数?1000厂(拉蒙特1996)。B. Cuneataa.S.George百合，B.巴克斯特的前r.br。B和B，第少花是乔治人口已经失去的，破碎的或严重降低大小(植物和占有面积数)通过植被清除(LamontetL。1991个，1993个;Witkowski和拉蒙特1997)。 在南的地理范围的影响B.农业和矿业用地，并由不同的火灾频率，采用三线的证据调查:标本馆馆藏的记录，一个全面的实地调查现存种群的，与航空照片和卫星图像揭示土地清理火灾和最近的历史(米勒等人2007)。这些结果表明，物种范围收缩40%区，和26%个纬度，通过异常损失边缘群体自1960。此外，22%的剩余对B的原生灌木林南栖息地失去了在此期间通过清算农挖掘。灌丛面积以0.73%的速率下降每年在1960–1979至0.27%每年在1990–2001。在后者的清除率，和平均火灾频率(=平均B. Hookeriana生成时间)13.7年前，南栖息在每一代的3.7%损失率(米勒等人2007)。的另外10%个可能已丢失正如B. Hookeriana栖息地因为反复的火间隔8岁组1979和2002之间(包括2%个燃烧间隔,7年)。每面积占十八在自然保护区是保护，但一个大的，重矿物砂矿井内储备减少有效保护区16.3%。这些储备包括25%的已知的群体，作为两个最大的人群这75%个人，?。大部分剩余的人口发生在空置的公有土地，和一些小片段在路边保留植被。 在分散的物种低人口规模可能会影响种子每一个人。在罕见的再发芽的物种，B的古地，较大的人口的概率越大，个人植物会产生种子，即使他们花一样程度(拉蒙特等人。1993。8种植物种群的?没有设置种子。这可能是由于在传粉者访问或 22 河南科技大学本科生毕业论文 下降的可能性增加自交在什么可能是一个自交不亲和的物种。大多数的数量已经大大减小尺寸通过土地的清理。甚至人口众多储备和未开垦的耕地一次更大的，和我们的数据表明，单株种子的生产可能会增加，如果人口大。因此，这种保护现状物种将由具有更少的改进，更大的人群而不是许多小群体(其中许多只会本厂坚持直到死去)具有相同的整体许多植物。 开花和种子的产生 山龙眼主要授粉的鸟类，包括一个广泛的范围的食蜜鸟(吸蜜鸟科)(柯林斯和香料1986;拉蒙特和柯林斯1988)，或(很少)的哺乳动物(柯林斯和雷贝洛1987)。介绍了蜜蜂的常客，但在授粉的影响还没有被研究。没有物种完全由小型哺乳动物授粉，虽然蜂蜜的负鼠，T.Arsipes Rostratus，比国家更积极的点头B.B. Tricuspis(伍勒等人。1983;货车Leeuwen 1997)。由于持续的丰度和数量的选择限制的种子集除了最小的剩余人口。 开花通常发生3?5年后发芽，和初始种子设定发生在同样的或以下年(CowlingetL。1987拉蒙特和1988位巴克码;拉蒙特;等人。1991个;Witkowski等人。1991。成熟的植物发芽开花1.5–火灾后可以恢复3年后(拉蒙特1988;Leeuwen 1997;Dreschler等人。1999)，但再发芽的物种幼苗可能需要30年到20–开花期(雅培1985;拉蒙特和Van Leeuwen1988;拉蒙特等人。1993。B.狭小的植物发芽的r根据它们的时间火灾后5岁了，但其他一些再发芽的物种只有成为火宽容他们一旦开始开花(拉蒙特和van Leeuwen1988;n.恩赖特和拉蒙特的人。OBS。)。这套限制的最小防火间距为自己更换时，一些现存的植物被火。的物种，需要更长的时间成为火宽容比平均防火间距，和与火的成年人不完全生存，人口可能逐渐下降。在确定一个主要的缺点许多受保护策略是我们可怜的山龙眼时间长度的知识需要成为新的植物火宽容和开始开花和种子集。 开花和种子生产之间可能出现大幅波动没有与当前或以前的任何明确的关系，年今年的天气条件，活性或前茬作物大小(罩等。1987;拉蒙特和1988位巴克码;Witkowski等人。1991。一般来说，球果和种子生产升级随着时间的推移，遵循指数曲线(拉蒙特和巴克1988;拉蒙特等人。1991个;Witkowski等人。1991 1994。种子在15–20年在一些物种中的高原生产(罩和拉蒙特，1987;拉蒙特和van Leeuwen 1988;Witkowski等人。1991莱特等人。1996。跨年度系数从锥变 23 银条茎尖的脱毒组织培养和植株再生 异单株降低，卵泡每锥，以非败育种子每卵泡，表示增加内部，而不是年龄或环境，他们的生产控制(拉蒙特等人。1991。这意味着，跨年度的季节生长条件对种子生产的主要影响，但只有与(夏季)B.狭降雨到目前为止(恩赖特和拉蒙特1992年)。 在许多山龙眼，到花70%可能损坏或用幼虫/花蜜寻找鸟类删除。高达80%的贫瘠视锥细胞可能已经被感染的昆虫的幼虫和40%储存的种子破坏(史葛雅培1985;拉蒙特1982;和1988位巴克码;拉蒙特和巴雷特1988;拉蒙特和范莱文Witkowski等人1988。1991 1994。B.藤，与许多贫瘠的锥和每锥只有一个卵泡的平均，是通常从这些影响免疫。虽然清楚结果大大降低种子发布火灾后，长期影响是未知的。如果招聘苗是一个加权彩票(拉蒙特Witkowski 1995)，那么大一个物种的总的种子可用的贡献，更好的。这是不关键resprouters作为nonsprouters。在公元前尖，整个的黑凤头鹦鹉，Calyptorhynchus宽吻鳄，作为通过选择性破坏的一种有效的生物防治剂的花包含蛾的幼虫头(拉蒙特和van Leeuwen 1988;Van Leeuwen和拉蒙特1996)。因此，保护现状这种鸟可以为未来的长期影响这种罕见的物种。B. Tricuspis限制机器翻译莱苏尔国家公园，这一直是一个煤矿的索赔在过去，而黑凤头鹦鹉人口数量在稳步下降(D. A.桑德斯的人。通信)。 野花的获得 山龙眼大大有利于在野花传粉。的采摘的野花在澳大利亚西部的人数从550上升1981到1000 1990但已跌至自商业农业增长(Witkowski等人。1991 B;平静的1998)。B. Hookeriana是最的收获物种在南西部澳大利亚。重接的人群，相比可以忽略不计了，表明花生产通过选择的花朵平均减少30% 35%在9年期间(Witkowski等人。1994。有在树冠大小比例较大的减少(44%)，数肥沃的锥(54%)和可行的种子的单株57%。在13岁的植物导致摘花在60%的选择率在9年零种子生产(拉蒙特等人?2001) 这显着降低种子的可用性的影响火灾后已被建模为“好”到“穷人的招聘”招聘条件，取决于少数到多数种子是自更换所需的(拉蒙特et al.。2001。采摘不会产生延迟时可能发生的不下火危及自我替代良好的生长条件下，但这起火灾之间的间隔在0%选12年在30%和大于在恶劣的条件下50年20年40%(图1)。因此， 24 河南科技大学本科生毕业论文 实际的强度计算错误摘要在恶劣的环境下有严重的后果野生种群的保护。只有一个四人口岁的植物从16岁的植物产生了30%是对自我替代轨道”，表明总的来说，恶劣的生长条件下(拉蒙特等人。2001。由于生长环境有恶化趋势(包括年降水量)减少，谨慎已由环境保护部(12月，原名保护和土地管理部门，在平静的)设置年龄的第一选择(10年)和采摘的水平允许根据我们的研究，第一管理计划一个在澳大利亚本地植物物种。 Witkowski和拉蒙特(1996)量化的实质生态系统养分损失(地上植株氮含量29%，30%，P)通过野花的收获，并建议对30厘米长的花干，剥离之前离开销售应拆除现场。这个简单的措施35–57%降低生态系统养分损失。Witkowski和拉蒙特(1996一)表明，地上部P 50%和25%的N位于种子。这意味着在这些营养贫瘠的土壤(拉蒙特1995)，收获锥种子有更大的影响比养分循开花收获。虽然锥(减去种子)弥补地上部分干质量的28%，它只含有15%的氮9%，P含量(Witkowski和拉蒙特1996年)。自从手播种苗是一个建立的机会两个数量级大于释放自然火灾后(拉蒙特等人。1991个;Witkowski和拉蒙特1997)，有很多赞扬的种子(锥)用于收获保护计划。 气候和生长环境的变化 具有有限分布山龙眼，全球气候变化可能会导致灭绝。物种分布范围大，许多人口很可能成为当地灭绝。B.第(珍稀濒危)和B. Gardneri变种(广泛的)有着密切A.S.George加德纳相关的地下茎，匍匐灌木和灌木–健康林地。虽然有17和177的人口，活动中，大多数是小的残余(Witkowski和拉蒙特1997。B37×16公里的区域，用了9个月的雨季(普雷斯科特公式，巴特利特1975)。B表明，B. Gardneri容忍更大范围的气候条件比B第，其中有一个很窄的预测范围(Witkowski和拉蒙特2006)。这些结果是不由于物种之间的生态特性不同，因为他们有类似的火灾后的生存和繁殖的活力，利率幼苗生长和土壤渗透，和易感性幼苗的食肉动物。 不发芽的山龙眼，尽管他们可能更大繁殖力，面临灭绝的风险更大的比，由于其更短的寿命。种群动态模拟的非发芽B. cuneatahas显示结果是高度敏感的(Burgman和降雨拉蒙特1992)。要继续在降雨率下降4%每十年，因为它已经在过去的85年，区域进行(匹塔克1988;珀斯气象局)，有50%的机会研究种 25 银条茎尖的脱毒组织培养和植株再生 群灭绝在接下来的50年。要减少降雨意味着较低的生产力，然后将火灾燃料少。没有建模已经做了检查贫穷的环境下生长的净效应(较低的种子店)较低的燃烧特性(着火间隔较长，零散的火灾)。 几个航拍溃疡菌已对山龙眼在确定在南澳大利亚西部沿海植物群落(采煤机1994。这些腐烂，主要品种的苹果，Cryptodiaporthe，造成了广泛的破坏大看台，特别是二月以来1991。爆发似乎是由一个持续4天的热浪引发并达到了创纪录的温度为47?C，可以忽略不计的降雨在那个夏天。对山龙眼，27的29种评估通过遗嘱和默里有症状溃疡，非发芽的物种之间的许多死去的植物。拉蒙特(1992)指出，最有可能死亡的种类最小的热，耐旱。B.蚴和B.冷饭团，限制到南部海岸，特别容易溃疡病的真菌。因为他们也在野花的青睐贸易，商业采摘这些物种的野生被禁止。到目前为止，溃疡病的真菌已不再是一个问题西南部其他地区，但分布较广泛，严重损伤的潜力依然。 杂草和杂交 草本杂草利用赤裸的地区建立。他们入侵的天然植被的道路和农场的土壤扰动或火灾后。至少有120种已经定居在山龙眼林地(Keighery 1989)，其最积极的是大草原的草(Ehrharta calycina)和野生燕麦(Avena spp.)。他们从本地物种竞争建立，特别是在火(贝格和拉蒙特1995)增加地面植物性。因为他们的进步是弱智的春季比秋季(片状)烧伤，霍布斯和安(1990)主张春季火灾杂草出没的地区占主导地位的山龙眼。 道路边缘增强的生长和生殖能力植物，这是由于显着较高的资源可用性(水分，养分，光)，可以缓冲残余山龙眼人口进一步下降，可能对灭绝。增加锥生产，卵泡每锥每果种子活力导致4–7倍种子店在路边B. Hookeriana比非路边的植物(拉蒙特等人。1994。同样的再发芽B.树，植物道路边缘有2.5倍大的冠和视锥，集3.1倍更多的种子和存储比没有路边的植物3.7倍更可行的种子(拉蒙特等人。1994 B)。 然而，这样的改变栖息地已被证明有助于杂交。假定的杂种B. Hookeriana B. Prionotes被确定在12B. Bookeriana的位于或靠近106人口人类活动干扰的网站(巷道，轨道，抛弃矿井，铁路线之间，但不在156原状)种群(拉蒙特等人。2003。形态和遗传标记证实，在选定的存在一个混合群干扰的栖息地，而没有中 26 河南科技大学本科生毕业论文 间体的存在在这两个物种的CO在原状植被发生。在12个地点在受干扰的栖息地物种的个体更有活力，更大的尺寸和更花比他们在原始植被同行。这些更肥沃植物也表现在开花季节和时间的转变。通过促进提早开花植物和B南B. Prionotes延长开花，人为干扰打破这两个物种之间的物候屏障。 因此，人为干扰促进杂交通过增加的基因流的机会减少种群间的分离，增加配子生产，特别是，通过促进有限的开花。普遍缺乏在形态和物候的渗入，而事实上，即使是混合群有一个中间混合指数，支持印象中，发病率高的杂交观察最近的一个现象。结合越来越多的机会杂交，这提出了逐步损失的可能性遗传完整性的父物种和选择有利于个人与更广泛的栖息地的耐受性比父母。 数量模型 山龙眼是一种理想的多年生木本植物在火灾易发环境统计过程研究。这是火灾中丧生，必须招募从种子到建立新的火灾后的人群，具有很强的晚熟，终身种子生产的证据仍然对植物直到植物死亡，和植物的结构是这样的，持久的(晚熟)水果可以老年年生产(拉蒙特1985。莱特等人。(1996)量化的种子生产，储存和损失(在衰变和自发释放国际火灾时期)B. Hookeriana和植物年龄估计可行的种子释放后，火就被最大化，通过使用基于非空间数值模型的方程。结果表明，在15–火间隔17年最大的种子供应，这被解释为代表的火政权的种改编。 现场的证据禁止。南表明平均100可行的种子必须产生一个新的植株但这一数字是受招聘条件后火，每招募更多的种子(200)如果需要降雨在火灾后的第一年是远远低于平均水平，和更少的(50)如果降雨量大大高于平均水平(莱特等人。1996。这反映了幼苗建立深厚的主根的需要保持与后退的土壤水分在第一次接触春夏季生长–(恩赖特和拉蒙特，1992年b)。的物种被证明是在当地灭绝的危险，如果火间隔不超过8–10年，反映出低的组合在年轻的植物种子贮藏(一厂开始生产达到4–5年)和降雨量的变化，对种子的影响每招。这些结果直观地合理作为指南在有关火灾政权的物种的管理，建议管理的火间隔的范围在10–20年。 影响的保护与管理模拟结果杂类草。B.狭南和一般与其他工人建立木本指南多年生植物，在火灾易发生态系统在南部的澳大利亚类似环境的其他地方，和火灾的时间间隔不超过10年可能有利于在火灾中丧生的同系物加利福尼亚(泽德勒等人。1983。这些结果与“拇指规则”的2×年龄最小的火间隔通过鳃和尼科尔斯提 27 银条茎尖的脱毒组织培养和植株再生 出的生殖成熟(1989)为在一般的植物。然而，种群动态的影响很长时间没有火提供了一些新的见解。T招聘与旧的水果的种子释放相关的和从植物衰老的空间的规定，Whereasb。狭可能因为增加的成年人的死亡率下降用高火强度(由于增加燃料负荷)和营养芽银行下降的活力。增加的栖息地碎片可能隔离区从火长时期。然而，很少有证据表明，长无火间隔将严重影响景观的北，这样长的时间间隔的影响可能这里是相对不重要的(短区间比较影响)在养护和管理背景。 该模型成功地复制所观察到的模式(湿润)剩余的未燃尽的洼地，而会发生火灾燃烧所有的植被上斜坡和沙丘。这火梯度与现场观测相一致与1984大野火燃烧模式和相关的1991(拉蒙特，N. Enright，人。OBS。)。结果表明，火灾中丧生的树湾最容易降低防火间距，和萌生灌木B.最敏感的。结果也有助于解释片状B. Prionotes分布，和其最近的扩展以及一些道路边缘(如品牌公路)，密切相关的模式提高资源的可用性和减少火灾的可能性。 一个阶段为基础的模型开发的种群B.第动力学(Dreschler等人。1999。灵敏度分析表明，人口增长率接近于零长作为火灾后死亡率和招聘是在常用的低界限。小群体(如10个人)下降较大的种群很快，由于Allee效应。以是可行的，一个人口规模应超过80?残个人，之后，人口规模的影响是微弱的。的随机火灾最佳间隔应该是10–15年，和火灾在固定的时间间隔应该是15–20年。损失成人的植物，由于人类的活动，如土地的清理，会增加死亡率，超出其自然的界限，不能得到补偿，由于这一物种的繁殖力低的。该物种从破坏中恢复过来的能力人是由少数的概率极低的限制产生的幼苗存活20年来第一次开花。在一个种群的80个人或更多，在优化假设，从10%的损失恢复要?150年。在悲观的假设，它永远不会发生。在一个剩下的10个人，10%的恢复要至少500年。手播火灾后可以提高繁殖力订单的大小和实现常住人口在第一年增加。环境的程度火灾发生频率的变化，对人口的影响较弱生长。保育当局应该更敏感的目标通过积极的管理因素在招聘阶段通过确保进一步的损失，成熟的植物通过土地的清理，停止。 火的历史，长距离扩散和新问题 对森林和灌丛火灾历史的出版物南澳大利亚西部由Ward等人。基于使用草树无损干分析的新方法(Xanthorrhoea属)，提出，这些生态系统都烧毁4–5年的火灾政权最近的修改前的欧洲移民和土地管理。在账户的基础上早期探险家，殖 28 河南科技大学本科生毕业论文 民者，人类学家和土著人民，它的假设是雨林可能更多的是打开(更多的草，小灌木)比他们现在(雅培2003;拉蒙特等人。2003 B)，一个国家通过频繁的故意燃烧的土著居民。如果是这样的话，那么这是难以调和的潜在的长期(至少千年)火灾频繁的与许多的持久性火灾中丧生的多年生木本植物与5岁的少年阶段或更长的时间，除非火灾是片状的，这些物种可能坚持在不经常烧焦的避难所。然而，在记录表明大多数草树采样大部分的时间都烧了，随着补丁定期消防逃生的小证据(Enright等人。2005 A，2005 B)。 进一步，我们理解燃料载荷的动态和火蔓延表明，至少在灌木林，林下火灾低强度是不可能。相反，活的和死的燃料必须达到的水平连续阈值之前，火蔓延可能的。一旦达到这个门槛，火灾可能影响整个系统不只是表面的燃料(基思等人。2002。在干硬叶林，林下火灾强度可能，但是，如果过于频繁，会限制招聘的树木，仍无法解释许多木本物种的存在在今天的森林.这种新的潜力)]火历史挑起政治辩论和政策关于和火南后果的角色转换这场火灾评价关系到我们目前的人口的理解记录在北部的动力学，使用经验证据和仿真建模，提供了一个我们如何了解这些生态系统的挑战。 莱特等人。(2005年)的修改后的版本使用空间模型Groeneveld等人描述。(2002)识别无论Threebanksiaspecies，B. hookeriana，B.狭B. prionotes，可以在一个景观生存火灾每5年。新的模型研究了增加每个物种的种子扩散距离增加，斑块火(即细胞逃逸各火)和增加的大小空间网格(由于大面积可能包含更多的未燃，避难所细胞比小面积)。模拟运行500年频繁的火灾场景，然后再为500年通过确定“最佳”年纪小小的防火间距的情况下等人。(2002)为繁育的失去了机会栖息地。结果表明，三种可能在频繁的消防制度(在潮湿的微型)如果火斑片状，与招标。有很强的扩散距离优势。南(否则B. hookeriana总是流离失所的B. Prionotes)。在这些微型贴片的平均年龄> 10年，那么物种并火者有足够的时间来积累了相当大的种子店。然而，该品种是不能够繁殖失去栖息地和重建在当前的景观空间格局，即使500年后返回一个较长的防火间距制度。 该火灾历史记录从个人北表明一个重大的转变在防火间距?1940，约有4–，日期前5年火灾的时间间隔，10年之后，?。如果有了重大的影响山龙眼的分布和数量(和其他)的物种由前欧洲的火灾场景景观，那么现在景观模式只有在建立 29 银条茎尖的脱毒组织培养和植株再生 过去的50年。胡子(1976人。通信)走过的地区1962和1974的植被映射。无论他的地图也没有他的个人收藏的植被的建议，这是然后，明显不同于现在的。如果是这样的话，然后对植被变化的时间窗口缩小到20–30年(2或3的火灾周期)，使得它不太可能1940看之前，很多不同的植被本节。支持这个论点是存在的沙丘的波峰的l中等和高丰度花旗松和Resprouters B. B.狭，分别。成熟的这些物种的个体可能会在订单300岁(恩赖特和拉蒙特1992)，所以保持种群最火的易发部位自从进入前欧洲时期的山水。再次，我们目前这些物种的动力学的理解建议5年的防火间距会促使他们在区域规模的灭绝。 长距离扩散(LDD)在最近的证据B. Hookeriana，现在已经提出的可能性，这个物种，和其他的火灾中丧生的多年生植物，也许能够更好地繁殖栖息地比以前失去的怀疑的。遗传分配测试表明，少年的植物生长在沙丘上烧1997产生的种子释放其他的沙丘植物通过相同的火焰高达2.5公里的影响离开。B. Hookeriana附近发生使Eneabba作为一个集合种群，在坡上部种群和沙丘的波峰通过干预等从低地地区在土壤深度太浅，支持物种由于在夏季极端干旱胁迫(恩赖特和拉蒙特，1992年b)。在这种情况下，它是可能的，该物种可能在频繁的火灾在景观的地方，只要在一些沙丘种群存活提供源繁育的人从这物种已经失去了。 结论: (1)火灾的时间间隔在过去的30年记录的短威胁他们的保护状态，相对于土地的清理。种群灭绝一直局限于非,很清楚的是，在变幻莫测的弱势群体火(短期和长期的时间间隔)，疾病，害虫，杂草气候变化是非。然而，该火灾频繁发生的负面影响应该缓冲他们增加的斑块。我们的模型表明，这样做减缓人口下降，尤其是当种子传播的发生。然而，我们还没有证据这两个防火性能之间的良性互动;该记录(奇怪的)没有显示出任何这样的(拉蒙特等人的关系。2004。) (2)种子的积累率是非的关键。到200可行的种子都需要家长的更换15年INB。南长时条件差(低降雨，商业切花采收)，这个种子库的大小可以花12年才能达到从发芽。种子生产很少是由传粉的可用性有限公司，但年际季节的影响(有时相关随着降雨的随机性和资源的可用性(土壤)水和营养水平)控制花序和卵泡生产。的种子贮藏遗传多样性迅速恢复到父母的水平。可以减少70%的种子供应， 30 河南科技大学本科生毕业论文 但他们的出现是断断续续的，在B. Tricuspis Florivory的黑凤头鹦鹉实际上增加了结实的选择性在花卉摧毁蛀虫。 (3)植物竞争的影响，确保季节/火强度不是招聘水平的关键，除了存在外来植物。入侵杂草后，大火已导致更少的比B藤母置换。水的供应在夏季–秋天在最初的几年是至关重要的，不是一个好兆头保护如果下降趋势在该地区的降雨仍在继续。 致谢 衷心感谢澳大利亚自然保护局(濒危物种的程序)，世界野生动物基金会(澳大利亚)(现在DEC)的工作人参与者这个研究。我们感谢米勒博士提的供数。这是Cedd09-2007Curtin大学多样性和生态系统动力学中心的贡献。 31