外周血单核细胞流式分析

外周血单核细胞流式分析 (1) 采集小鼠眼血，每只小 300-500μl，新鲜外周血2500rpm 离心20 分钟， 吸取上层血浆； (2) 用PBS 或生理盐水重悬下层血细胞，稀释倍数2-4 倍，稀释倍数越高分 离效果越好； (3) 离心管内加入Ficoll，Ficoll 上层缓慢的加入重悬细胞液，Ficoll 与重悬 细胞液比例1:2； (4) 2000rpm 离心 20 分钟，离心机设置为缓慢加速和缓慢减速； (5) 离心后离心管内可见四层分液，从上向下依次为：PBS 血浆混合液、 PBMC、Ficoll、红细胞，Z 字形吸取 PBMC 分层； (6) PBS 或生理盐水清洗细胞三次并计数； (7) 将细胞用 PBS 重悬，分组加入流式管中，每管100μl； (8) 加入抗 CD16/32 封闭抗体，4℃反应 10min，除去小鼠免疫细胞表面 的非特异性染色； (9) 根据抗体要求体积在流式管内加入抗体，常见的大比例细胞可只标记检 测抗体，以下几种情况需要同时制备空白细胞管、同型对照管、检测抗体管检 测：细胞比例含量低、细胞表面标志表达较弱、首次使用的新抗体、同时标记 多类标志时需要每种标记都单独制备单一抗体标记管，4℃反应 30min； (10) 3ml 1×PBS 清洗一次，如需分选，用PBS 重悬后直接上机；如需分析， 用1%的甲醛 PBS 固定后检测，荧光染色最多保留48h。流式数据用FlowJo 软 件分析。