多聚酶链式反应

nullnull 课2 多聚酶链式反应扩增DNA片段一、PCR的原理多聚酶链式反应（PCR），是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。应用 遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、 基因克隆和DNA序列测定null一、PCR的原理（1、体内DNA的结构 ） ADNA分子的-OH端为3/ ; 磷酸基团的末端为5/ 。null一、PCR的原理（2、DNA体内复制相关知识） nullDNA体内复制（示意）null一、PCR的原理（3、 PCR的技术原理）时间（min）温度（℃）适温延伸高温变性低温复性重复1~3步30轮DNA双链单链变性（加热80-100℃ ）复性（缓慢冷却）null利用DNA分子的热变性原理，通过控 制温度来控制双链的解旋与结合，从而完成体外DNA分子的扩增。 体外DNA复制的条件：四种脱氧核苷酸、耐高温的聚合酶、引物、 模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。 复制的方向：子链的5’ 端向 3’端延伸。PCR技术的原理总结null二、PCR的反应过程 变性95oCnull每个循环包括：变性 ——复性——延伸从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。PCR的反应过程总结null体内DNA复制与PCR的技术区别：null1、PCR仪（一）设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次三、 PCR反应的实验操作nullPCR仪nullnull1、准备2、移液（二）实验操作步骤按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂3、混合①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁②注意：A、防止实验中脱落或液体外溢B、目的是使反应液混合均匀null将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s4、离心5、反应②离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果nullPCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：6、注意事项①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头null（一）理论上DNA扩增数目的计算1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n（二）实验中DNA含量的测定1 、原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关四、结果与评价null2 、过程①稀释2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释②对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值③计算null④计算DNA含量（ g ）＝50 x (260nm的读数）x 稀释倍数50：1 g /ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02null练习巩固1、关于PCR技术的应用，错误的一项是 A 古生物学、刑侦破案、DNA序列测定 B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学 C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案 D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定null2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？3、PCR技术最突出的优点是 A 原理简单 B 原料易找 C TaqDNA聚合酶有耐热性 D 快速、高效、灵活、易于操作null4、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是 A 反复洗涤 B 不怕外源DNA污染 C 高压灭菌 D 在—20 ℃储存null5引物15引物2 5 5模板DNA25～30 次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。null加样器的使用