【doc】切割采卵法及牛卵巢深层卵泡卵母细胞的体外受精

【doc】切割采卵法及牛卵巢深层卵泡卵母细胞的体外受精 切割采卵法及牛卵巢深层卵泡卵母细胞的 体外受精 摹二十四卷第五期 Vo1."No.5 内簟古丈学(盲靛科攀版). Acta&jtntru?Natural[urnUni一it-tNeiMe~u l9H|F?月 S=p.19D3 ? 前言 切割采卵法及牛卵巢深层卵泡卵母细胞的体外受精.. 出武枷干S32,够(实验动物研究中心)V一/, 摘要为墨膏牛体,卜曼辅(nIvF,过暑中屠宰牛卵柏利用事.奉研究将来囊的110十丰 |I先用,|规的证射嚣抽l臣墙采鼻后.再用刀片朝制法臻橐了位干挥屡甜席穗弗母啊臆.并对商 种方甚回收的卵子分别进行了BlVF实验.结果衰嚼.在尚用抽幢法幕卵每头牛町?翻9.0I士? 2.42教可用J_子的基础上.切宣l法采卵又可获弭早均B.74~4B教可用卵子.连使再平均秉. 卵熬达到了每头牛18.62士2.59教.悻,卜受精詹.由切割法目l啦舶扞器卵子其却基事和曩崔 53,372)和10-'8(39/;72),均啊显低于? 胚,囊胚发育率分别为43.0l(16O/3T~).14.z4【 抽嗳脚收卵柏73.62(201/~73),31."(B5,273)和19.05'52,盯l.'Or).事研 究证明了抽吸后再切割的两次采卵法对提高牛卵巢采舜教率有着明量髓敲?孤且连蕾姥幕 层卵泡卵母细胞用于体外受精后可发育为正常的早期胚胎?但各嘎裳育指标尚有待予进—沓 词切割幕卵法探卵细胞呆卵事件外发育事1件蹄费犏关键词切割幕卵法探屡卵母细胞呆卵事件外发育事牛卵卟问 蝴贽料髅号讪"鲫?湖等 近年来,随着国内外牛体外受精(BIVF)技术酌不断完善,13IyF研究的重点巳逐渐转到了提高 BIVF胚生产效率的研究方面".而提高牛卵巢豹利用率.,即卵|母细胞的采卵率是其中一个重要 环节.自从1984年旭日干在体外受精研究中建立注射器抽暇采卵法后,这一采卵方法被广泛用于 . B1VF,并成为一种常规的采卵手段..1987年S.1wasakl等采用多刀片切瓤法.:it411器磨碎法 进行采卵,虽然卵子回收率有所提高,但可用l卵子数量不多,而且未进行B1VF盾的发育_培养t鼓难 以分析其实际效果..最近(199~)S.Hamano和M.Kuwayama又报j苴切荆珐采熙和抽暖甚采庳 对母纽胞回收率及体外受精后麓育率的影响,证明二者间在采卵率上存在髓最差晃丽在IVF备 硬指标上未见区".笔者薄为了进?步提高牛卵巢的利用效率同m诵实由切割j眚网救舶探层舅l 泡卵母细胞在体外成熟体受精后的发育能力.李研究在上述研者工作的基l础上设诗了先抽嚷 后切割的二次采卵方法对用常规抽曝法采卵后卵巢的深层卵母钾胞进行了_皿收事船缱计和#l齄 受精试验,以抽暖法回收租卵母胞作为对照.分析了深层卵蝎母细胞的再圊收对据赢期蒜利用事及 这部分卵子的体外受精后的笈育能力.. 1材料和方法. 1.1卵巢卵母细胞的回收.. 将采自附近屠宰场的蒙古牛新鲜卵巢置于盛有25~30?生理盐水的保温瓶内挽圊l实硅室.用 生理盐水洗2,3次后,先用灭菌的5ml注射器(上海医用诊察仪器厂)和18号皮下针头(1.2O XL38mm,TerumoCo.Ltd)对卵巢面可见卵泡进行抽吸法采卵.采卵液为mPBS+3mg/m[ BSA(~t:血清白蛋白)4-双抗. 将抽吸法采卵后的牛卵巢再用生理盐水洗一次,然后沿卵巢门纵切至卵巢的3/5深处,沿切口 ? 收稿日期I1993—05—27 ? ? 第五期莽|毫先等切割呆卵法盈牛j_撬懈屠鼻泡舅母蛔胞的体外受精 分开,平铺卵巢于12cm平皿(盛有采卵液)内.用一把灭菌的23号手术刃对浸在采卵浪中的卵巢 按1mm间隔进行交叉切割.切害后的卵巢再在另一盛有相同冲卵液的小烧杯中冲洗出残冒的撅 层卵母细胞.切割完毕后,把两部分液体静置3,5rain,在立体显微镜下检出各级卵子-分别予以 数量统计. 将先后用两种方法回收的卵母细胞分别检出后.均按Ldbfried和First的方法分类.仅选择 那些卵母细胞质清晰,且外面包裹有多层卵丘细胞的A级卵子用于BIVF实验. 1.2卵母细胞的成熟培养和体外受精 分别将两种采卵方法获得的可用卵母细胞先进行体外成熟培养(IVM).成熟培养浪为鬻加 20发情母牛血清和少量双抗.用Hepes缓冲的M199培养液 (Cat.No.400~1100,Gibco).培养 条件为39?,5C0的二氧化碳培养装置(TsE.SanyoCo.Ltd)(下同).培养22~24h之后,用 于体外受精. 精子诱导获能处理参考Parrlsh等报道的方法,即将公牛冷冻精液(黑白花,北京奶牛研究所 提供)在37?下解冻后,用含有10mMol咖啡因的I30培养液稀释.离心洗涤两次.然后和成蔫舅 母细胞一起.在古有5m/vlol咖咩因,10mg/mlBSA和1I肝素/mI(Novo-Hepanin,KodiD~Ia- dus~ries,丁apan)的BO培养液中进行7h的受精培养,然后移入发育培养藏(M199+5OCS+0. 12mg/ml丙酮酸钠+Hepes+双抗)小滴中进行发育培养.在相应的发育时间内以最初用于戚蔫 培养的卵母细胞为基数.分别统计来自两种不同采卵方法回收卵母细胞的卵裂胚,桑椹胚和囊胚发 育率,并以此作为判别二者受精能力的指标. 对实验1的头平均采卵敷和实验2的发育率百分比坶进行了Mean士SD方差统计处理.并对 两类卵母细胞可用卵子比倒和在受精能力方面的差异进行了检验. 2结果 2.I头平均可用卵子回收数 共采集了149枚卵巢t先用注射器抽吸法共回收各级表层卵泡卵母细胞1255枚,其中可用于 体外受精的^级卵子75~枚(60.08%).头平均可用卵子致为9.88:1:2.42枚.从抽嗳后再次切翻 采卵的110个卵巢中又回收了各级深层卵泡卵母细胞1006牧,其中^级可甩卵子为489枚(48. 61%)-头平均可用卵子数为8.74士3.48枚.两次采卵法使得每头牛的平均采卵敷 从9.88士2.'2 增加到18.62士2.59枚.提高88.46%.这说明.抽吸后再用切割法采卵的二次回收法可以明显曩 高深层卵母细胞的利用率(见表1). 衰1切割法果卵对提高牛睁^黑卵率的研究 Tib|e1Theeffectofev~ryc?'q"t嘲"ry.fbovineoot一 ?I抽嗳后讶.cuttingmiternplrallon. ?>b'P<0.01) 内蒙古大学1993生 2.2受精卵的发育率 将372枚切割法获得的深层卵母细经体外成熟,体外受精后,进行了发育培养.其卵裂胚(2 ,8细胞),桑椹胚及囊胚发育率分别为43.Ol(160/372),14.25(53/372)和10.48(39/ 372).与相同方法处理的抽吸卵母细胞的三项指标73.63(201/273),31.14(851273)和19. O5(521273)相比,均存在着明显差异(P<0.01).这一结果说明由再切割法回收的深层卵母细胞 采用常规体外受精处理后可以获得正常的桑椹胚及囊胚,但其发育率尚有待于进一步提高(见表 2). 2来自不同采卵方法的牛卵子对体外受精后发育率的影响 Table2EffectofdifferentrecoveryofoocytesolldevelopmentofIVFembryos ?_抽啦后切甜.CUlthalterIiip~'atlon. A>aIB>b~C>c一(P<O.01)? 3讨论 与S.1wasaki等(1987)和S.Hamano&M.Kuwayama(1993)的切割采卵法相比,本研究采用 了先抽吸,再切割的两步采卵法.这一方法的特点在于可以使大部分卵巢表层卵泡 卵母细胞先经注 射器抽吸采集后,其余的深层卵泡卵母细胞再用切割法回收,统计,并用于体外受精.这样就可以对 卵巢中不同部位卵母细胞的数量分布,回收潜力以及体外受精后的发育能力做出客观的判断,为提 高牛体外受精胚生产过程中卵巢的利用率提供可靠的参考依据. 值得注意的是,与抽吸法采卵相比,再次切割法采卵数的稳定性较低,这可由其标准偏差(sD) 值看出(见表1).笔者认为,影响采卵率的主要因素是卵巢的情期与妊娠状态,尤其在妊擐状态下 出现的巨大黄体会对卵巢皮质深层卵母细胞产生竞争性抑制作用.同时,F.Rabahi等的研究也证 实了LH浓度和孕酮浓度的升高对周围小卵泡中颗粒细胞的生长,分裂产生抑制.因此数量会藏 少. 对深层卵母细胞在同样条件下比袭面可见卵泡卵受精后发育率低的阃题,很难怍出一个肯定 的解释.笔者等对部分卵子在成熟前后的封片染色链检中发现,深层卵母细胞在核分裂相方面与表 面卵泡卵子无任何差异,所以认为影响受精后进一步发育的主要因素为核质成熟的非同步化.F. Rabahi等在最近的研究中又报道了颗粒细胞对卵丘一卵母细胞复合体的影响…'.慨们认为t只有 当卵泡体积较大,其中的颗粒细胞数量占有优势的情况下,脑下垂体分泌的促性腺激素(FSH和 LH)才能通过颗粒细胞产生一种短距离内分泌因子释放到卵泡液中,称作卵泡液因子(follcular ~actor).后者作用于卵丘一卵母细胞复合体后促使卵母细胞合成一种28KDa的胞内蛋白,以加快 核质同步成熟.因此可以推论,本研究在抽吸后切出的深层卵泡卵母细胞虽然其核巳进入生发泡阶 段,通过体外成熟培养系统也可以培养至成熟状态(第二次减数分裂中期),但由于其卵泡较小,颗 粒细胞处于受抑制状态.所以不可能产生足够的卵泡液因子来促进卵质成熟:从面造成了成熟堵养 后核质非同步成熟的情况,并影响了受精后发育.许多研究者曾先后报道了在成熟培养体系中添加 颗粒细胞""'或第20天发情牛血清和LH0'会改善核质同步成熟状态.所以有必要根据上述研究 结果对切割法回收的深层卵母细胞的体外成熟和体外受精进行更深入的探索. ? ? ? 第五期薛晓先等切鲁I采卵拄丑牛卵巢探屡卵泡卵母细胞的体外受精 参考文献 1HanadaA.FarmingJapan,1993?27(2)l11,l7 2BavLIterBD-Rose—HellekanzTA,Pin~opumminlrT.Theriogeaoll~.1992,37(11Il27,148 8BoasI-~rsau.BllNI"mVHZooteh.Colt1954.33'219~221 lHanadaA,Sh~oyaY,州T?78thAnnualMeetingAbit18InJpnJZootechSd(inJapanese)1988 51wasakiS-Kono~T-NakaharaT-ShlcyaY,FukushimaM,HanadaA,Jpn-J-AnimRepred-- 1987-33(4)I188~192 8Haman~,KuwayamaM.TIlerJogenololuf-1993.39(9)?703~712 7L,ibfHedL,FirItNL.J.^?lm,sd..1979,48l76~86 8Parri~h"-Susko-ParrhhJL,Leibi~ried-RudedgeML.且e山擘enol.ly,1986.85I591~800 9WilillamRB,ShapiroSS.TherJogenology一1990—33(1)一29~39 10RahahlF?M~nniauxD-PiueletC,ChuplnD.DurandP.MolRepredD竹.19930|269~274 11RahahiF,MonnlauxD-PiuelelC—DurandP.MolReprodDev-1993—34(4)?491~442 12Smigmil]erRB.MoorRM.GamateRes,1954.9:22l,229 13LutterbaehA.KOIIRA.BremG.Zuchthyg.1987.22Il?5,190 14M~hizukiH,FukuiY—OnoH.TherJogenology一1991-a6?973~989 15Younis^I?BraekellBG.Therlegenole8y,1991.36Ill,2l TheResearchofCuttingMethodonRecoveryofBovine 0ocytesandinVitroFertilization XueXisoxianLiuDongjunLiRongfengChanHongwuShorgsn (ResearchCentreLaboratoryAnimalScience) InordertoraisetheproductiveefficiencyofBIVF(bovinein~itrofertilization)embryos,1 006oocyteswerereoverdfrom110ovariesofMongoliacowbycuttingovariesafteraspirationof theoocytesfromtheirsurfacefolliclesandtreatedwithBIVF.Theresultsshowedthstthere.cov— cryrateofrankAoocytescouldbeincreasedfrom9.88土2.42to18.62士 2.59percowbyuling theadditionalcuttingmethod.AfterBIVF,theproportionsofcleavedOVa,morulaeandblssto- cystswere43.01(160/372).14.24(53/327)and10.48(39/372).respectively.Theywere Iowerthanthatoftheoocytesrecoveredfromaspirationmethodsignificantly.(P<0.01).There- suitssuggestedthat(1)theoocytescollectedfromthedeepfolielesofthebovineoveriesbycut- tingmethodhadacomparativelylargequantitivepotentialand(2)theseoocytescouldbeinvitro inseminatedandcultivatedtothenormaItransferableembryos,butthedevelopmentratessillI needtobeimprovedinthefuturestudies. Keywordscuttingmethoddeepfollcleoocytesrecoveryratedevelopmentrate