金银花解热作用及机制的实验研究

金银花解热作用及机制的实验研究                 作者:谢新华 董军 付咏梅 唐红梅 【摘要】  目的探讨金银花的解热作用及中枢电生 理解热机制。方法复制IL 1β性发热新西兰兔模型～观察 金银花的解热作用～并应用微电极细胞外放电技术观察 金银花对IL 1β作用下POAH温度敏感神经元放电频率的 影响。结果金银花对IL 1β性发热有解热作用; 金银花能 增加IL 1β作用下热敏神经元的放电频率～而减少IL 1β作用下冷敏神经元的放电频率。结论 逆转IL 1β引起 的温度敏感神经元放电频率的改变～可能是金银花起解热作 用的机制之一。 【关键词】  金银花 IL 1β 解热 室前区下丘脑 前部 Abstract:ObjectiveTo study the antipyretic effect and the mechanism of Jinyinhua (JYH). MethodsFever models of rabbits were established by intravenous injection of IL-1β. The antipyretic action of JYH was observed. The firing rates of thermosensitive neurons in the POAH were recorded by extracellular microelectrode technology. Results?JYH obviously reduced body temperature of febrile rabbits induced by IL 1β(P< 0.01) .?After i.v injection of JYH～ the firing rates of warm-sensitive neurons responsed to IL-1β increased from ,3.2〒1.6, imp/s(before i.v injection of JYH)to ,9.7〒4.4, imp/s (P<0.01～n=13)(In contrast～the firing rates of cold-sensitive neurons decreased from (20.1〒5.8) imp/s (before i.v JYH) to (8.4〒2.0) imp/s (P<0.01～ n=10) (Conclusion?JYH has obvious antipyretic effect on IL 1β induced fever in rabbits(?JYH can reverse the changes of firing rates of thermosensitive neurons treated by IL 1β in POAH and plays an antipyetic effect by increase in heat lost and decrease in heat production( Key words:Jinyinhua,  IL 1β,  Antipyretic,  POAH     金银花是重要的清热解毒中药～以金银花为主的复方制剂解热作用的临床观察和药效学研究很多～但对金银花是通过何种途径起解热作用～其作用靶点和机制究竟如何～至今国内外少见报道。因此～本课题通过采用IL 1β复制新西兰兔发热模型～在了解金银花解热作用的基础上～运用玻璃微电极细胞外放电记录技术来记录金银花对IL 1β作用下下丘脑温度敏感神经元放电的影响～以阐明金银花的中枢解热电生理机制～为临床应用提供实验依据和理论指导。 1  材料与方法 1.1   材料与试剂ST 1 型数字温度计,上海医用仪表厂,、数字温度计 、,北京师范大学司南仪器厂,、温度计,上海医用仪表厂,、MEZ 8300型微电极放大器,光电公司,、SBR I 型二线示波器,汕头超声电子仪器厂,、TD W718型磁带机,日本JVC公司,、WC/09 05型超级恒温器,重庆试验设备厂,、VNSA-II 型生理信号处理系统,海军医学高等专科学校,、步进式微操纵器,上海量具刀具厂,、江湾II 型立体定位仪,上海川沙花木农机厂,、IL 1β,美国Sigma公司～来源于E.coli～纯度?98%,、金银花注射液,西安黄河制药厂,。 1.2  方法 1.2.1  实验动物及体温测量取封闭群健康新西兰兔～ 体重1.5，2.5 kg ～基础体温38. 6，39. 2?～雌雄不限～由广东省医学实验动物中心提供～许可证编号:SCXK(粤) 2003 0002。实验前将兔臵于实验环境中模拟实验操作以适应实验条件2 d ,3，4 h/d,第3天正式实验。实验室温度控制在22，25 ?。测温时将兔臵于特制兔架上,用数字测温仪探头(预先经标准温度计校正) 涂以液体石蜡,插入直肠内10 cm 并固定于尾根部,待体温稳定后每10 min 记录体温1 次,取3 次平均值作为基础体温,实验中每10 min 记录体温1 次。防污措施按发热实验的常规方法进行,1,。 1.2.2  动物分组取健康新西兰兔24只～随机分为4组～分别为生理盐水组,NS,:静脉注射NS～1 ml/只,白介素-1β,IL 1β,组:静脉注射IL 1β～100 ng/只～(用无热原生理盐水稀释成100 ng /ml),金银花和白介素-1β,IL-1β+JYH,组:静脉注射JYH 1 ml/只～30 min后再静脉注射IL-1β(剂量同IL 1β组),金银花,JYH,组:静脉注射JYH～1 ml/只。 1.2.3  POAH温度敏感神经元放电的记录取新西兰兔～用25%氨基甲酸乙酯(1.0 g/ kg ～iv) 麻醉～常规消毒～切开气管并作气管插管。     将兔头俯卧位固定于立体定位仪上～消毒～于头部正中作一约8 cm的纵形皮肤切口～暴露颅骨～找出前囟和人字缝～并使人字缝尖低于前囟1.5 mm。     根据 Sawyer 兔脑定位图谱～用牙科钻在A0～A5近中线处各钻一小孔～插入直径为1.2 mm 的变温管近颅底,在A2.5中线旁开3 mm处钻一小孔～植入直径1.2 mm的测温探头至前联合水平,在 1对侧A1，3中线旁开1，3 mm 处开2 mm〓3 mm的骨窗～作插入记录电极用。变温管、测温探头均用牙科水泥固定,实验过程中室温控制在22，25 ?。     将尖端直径为0.5，2 μm 的玻璃微电极(电阻为8，15 MΩ,～电极内液为3 mol/L的 KCl,内含2%的普鲁士蓝,～ 在H-4，0范围内引导出的神经元放电～经放大器放大的信号输入到二线示波器及磁带机做连续记录。     观察放电稳定约10 min后～用超级恒温泵向循环变 温管分别泵入热水和冷水～在32，42 ?范围内两次升降下丘脑温度,脑温用数字温度计测量,～并记录相应脑温下神经元的放电频率～计算出温度敏度系数(即在放电单位反应最为敏感的下丘脑温度范围内～局部脑温变化1 ?时～神经元单位放电频率变化的数值)。判定神经元温度敏感性的标准是:温度敏度系数? 0. 8 imp/ s.?者为热敏神经元,温度敏度系数?- 0. 6 imp/ s.?者为冷敏神经元,介于0.8， 0.6 imp/ s. ? 为温度不敏度神经元。     观察金银花对IL-1β作用下POAH 热敏神经元放电的影响:当热敏神经元稳定放电10 min后～从耳缘静脉注射IL-1β 100 ng/只～待神经元放电频率明显改变时～从耳缘静脉注射JYH 1ml/只～观察其对热敏神经元放电频率的影响。对照组为注射IL-1β引起神经元放电频率变化明显时～注射NS 1 ml/只～观察其对热敏神经元放电频率的影响。     观察金银花对IL-1β作用下POAH冷敏神经元放电的影响:观察冷敏神经元稳定放电10 min后～从耳缘静脉注射IL-1β100 ng/只～待神经元放电频率明显改变时～静脉注射JYH 1 ml/只～观察其对冷敏神经元放电频率的影响。对照组为注射IL-1β引起冷敏神经元放电频率变化明显时～注射NS 1 ml/只。     实验结束后～微电泳,电流为20 μA～10 min,普鲁士蓝标记玻璃微电极尖端的位臵。断头取脑～用4 %多聚甲醛固定3，5 d做冰冻切片～以检查记录电极的位臵。 1.2.4  统计分析所有实验数据均以〒s表示～用SPSS11.0进行统计学分析～神经元放电频率数据采用配对t 检验～其余采用单因素方差分析。 2  结果 2.1  金银花对IL-1β性发热效应的影响从表1可以看出～JYH组和NS组新西兰兔体温没有明显变化～两组比较～?T及TRI1均无明显差异(P>0.05),而IL-1β组在注射IL-1β后～结肠温度逐渐升高～与NS组相比～?T及TRI1有显著性差异(P<0.01),JYH+IL-1β组在事先注射JYH后～温度上升峰值明显低于IL-1β组～两组?T及TRI1相比较～有显著性差异(P<0.05)。 表1  各组家兔结肠温度影响的比较,略, 与NS组比较,*P<0. 01～与IL-1β组比较～? P<0.05,n=6 2.2  温度敏感神经元的放电记录 2.2.1  温度敏感神经元性质的判定完成实验全过程且微电极尖端在POAH范围内的神经元共42例。其中19 例热敏神经元～放电频率随局部脑温升高而增加～温度敏感系数为0.8， 4.0 imp/ s.?,冷敏神经元17例～放电频率随局部脑温升高而降低～温度敏感系数为-2.6 ，-0.7 imp/ s.?,6例温度不敏感神经元～温度敏感系数为-0.2 ，0.5。 2.2.2  IL-1β对温度敏感神经元放电频率的影响静脉注射IL-1β后～热敏神经元的放电频率由,9.2〒3.7, imp/s 减少到,3.2〒1.6,imp/s～经配对t检验～放电频率变化有显著性差异„放电频率差值为(5.9〒3.6)imp/s～n =13～P<0.01‟ ,给IL-1β后～冷敏神经元的放电频率由,7.5〒2.1,imp/s增加到 ,20.1〒5.8,imp/s～放电频率前后变化有显著性差异,差值为,12.5〒5.9,imp/s ～P<0.01～t =7.89～n =10,,而对温度不敏感神经元放电频率没有明显影响～给药前后～放电频率改变没有显著性差异„放电频率差值为,0.2〒0.2,imp/s～t =1.94～P>0.05‟。 2.2.3  金银花对IL-1β作用下温度敏感神经元放电的影响静脉注射IL-1β引起温度敏感神经元放电频率明显改变时～注射JYH～发现JYH可使受抑制的热敏神经元放电频率回升、恢复至,9.7〒4.4, imp/s～用药前后放电频率差值为,6.4〒5.7, imp/s～经配对t检验用药前后放电频率改变有显著性差异(t=5.74～n =13～P<0.01)～其明显效应时间平均约,15.0〒6.0,min,图1,,使IL-1β作用下冷敏神经元的放电频率回降至,8.4〒2.0,imp/s～用药前后放电频率差值为,11.6〒5.1,imp/s ( t=7.16 ～P<0.01)～其明显效应时间平均约,19.0〒5.0,min(图2)。但对温度不敏感神经元放电频率没有明显影响„放电频率差值为,0.3〒0.6,imp/s～t =1.21～n =6～P >0.05‟。 图1  金银花对IL-1β作用下POAH热敏神经元放电频率的影响,略, 图2  金银花对IL-1β作用下POAH冷敏神经元放电频率的影响,略, 2.2.4   生理盐水对致热原作用下温度敏感神经元放电的影响 给予与解热剂等量的生理盐水～对 6例IL-1β作用下的热敏神经元的放电„给生理盐水前后放电频率差值为,0.1〒0.3, imp/s～t =0.62～P>0.05‟和7例冷敏神经元„给生理盐水前后放电频率差值为,0.7〒1.8,imp/s～t =1.05～P>0.05‟放电均无明显影响。 3  讨论     发热主要是外源性致热原作用于体内内生致热原细胞产生并释放内生致热原( EP) 而致。近年来的研究发现EP是多种致热性细胞因子,包括白介素( IL-1) 、肿瘤坏死因子(TNF) 、干扰素( IFN) 、巨噬细胞炎症蛋白- 1 (MIP-1) 、IL-6 等,其作为发热信息可直接或间接作用体温调节中枢,导致下丘脑中枢性发热介质如前列腺素E2,PGE2,、环磷酸腺苷,cAMP,、促皮质激素释放激素(CRH) 、精氨酸加压素,AVP,、α-黑素细胞刺激素(α-MSH)等的释放,进而引起温度敏感神经元的兴奋性改变～使体温调定点上移,产热增加,散热减少而发挥致热作用,2,。    研究表明～脊髓、延髓、脑干网状结构、下丘脑都分布有温度敏感神经元,即热敏神经元和冷敏神经元,～尤以POAH分布较多。热敏神经元兴奋时～一方面可引起散热反应～另一方面通过突触抑制冷敏神经元放电,冷敏神经元活动加 强时可促进产热反应～抑制散热反应。热、冷敏神经元的兴奋状态决定“体温调定点”的水平～进而调节体温。对解热剂的研究,目前认为主要有以下方面: 减少内生致热原的产生和释放,阻止内生致热原进入中枢,解热剂与致热原竞争温度敏感神经元膜上的受体, 影响温度敏感神经元的兴奋性,3,,抑制中枢性发热介质的合成而发挥作用,4～5,。     金银花是我国中医药宝库中的重要而常用的品种,为忍冬科植物～其成分复杂～含多种挥发油、绿原酸类化合物、三萜皂苷类化合物、黄酮类化合物等。国内外学者运用现代理论知识进行了全面分析和研究, 作了大量的药理临床工作, 从科学的角度证实了金银花具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫及解热、利胆、保肝、降脂、抗生育、止血、抗溃疡等多种药理作用 ,6,。以金银花为主的多种复方制剂,如银翘散、银黄注射液、银黄解毒片等,对多种感染所致的发热有较好的疗效。本实验旨在观察金银花对内生致热原引起发热的解热作用,并进一步探讨其是否能作用于发热调节中枢,以期进一步阐明其解热机制。本实验我们用IL-1β作为致热原～观察到新西兰兔出现明显的发热反应～并使热敏神经元的放电频率减少、冷敏神经元的放电频率增加,而注射金银花可起解热作用～并可逆转致热原引起的温度敏感神经元放电的改变～但对温度不敏感神经元没有明显影 响。     上述结果提示:金银花具有解热作用～其解热机制可能与逆转致热原引起的温度敏感神经元放电频率的改变有关。 【参考文献】   ,1, 张丹卉,蒋玉凤,黄启福,等. 清开灵对内毒素性发热家兔下丘脑cAMP 及腹中隔区AVP 含量的影响,J,.中国病理生理杂志, 2001 , 17(4) :340. ,2, 王迪寻～金惠铭.人体病理生理学,M,.北京:人民卫生出版社～2002:302. ,3, Hori T. An update on themosensitive neurons in the brain :from cellular biology to thermal and nonthermal homeostatic functions (review),J,.Japan J of Physiology ～1991～41 (1) :1. ,4, 王华东～屈 洋～李楚杰～等.中枢CRH在大鼠应激性体温升高和LPS性发热机制中的作用,J,.中国病理生理杂志～2001～17,2,:124. ,5, 齐 云～李沧海～郭淑英.桂枝汤对体温双向调节作用机理探讨-对发热及低体温大鼠下丘脑PGE2含量及COX 活性的影响,J,.中药药理与临床～2001 ～17 (6):390. ,6, 何显忠～兰荣德.金银花的药理作用与临床应用,J,.时珍国医国药～2004～15,12,:865.