大鼠肠系膜淋巴结高内皮微静脉内蛋白多糖的分布_cropped

大鼠肠系膜淋巴结高内皮微静脉内蛋白多糖的分布_cropped 大鼠肠系膜淋巴结高内皮微静脉内蛋白多糖的分布 1 2 2 2 2 3 周海兵 ,刘 丽 ,刘 颖 ,谢遵江 ,贺业春 ( )1. 中国人民解放军空军 93019 部队医院 ,辽宁 大连 116023; 2. 哈尔滨医科大学解剖学教研室 ,黑龙江 哈尔滨 150086 ( ) 【摘要 】目的 研究蛋白多糖在大鼠肠系膜淋巴结高内皮微静脉 H EV s中的分布 ,探讨蛋白多糖在淋 巴细胞归巢过程中的调节作用 。方法 阳性胶体铁染色 —酶连续阻断法 ,光镜和电镜观察蛋白多糖于 H EV s 内的淋巴细胞 、内皮细胞 、基膜上的分布 。结果 H EV s的基膜和邻接基膜的淋巴细胞胞膜呈强阳性染色 ,能 被透明质酸酶 、肝素酶 、软骨素酶 ABC阻断 ;电镜显示 ,胶体颗粒主要排列于基膜的内 、外侧及穿越基膜的淋 巴细胞胞膜上 ,内皮细胞 、穿内皮细胞的淋巴细胞和腔内的淋巴细胞不着色 。结论 蛋白多糖于大鼠肠系膜淋巴结 H EV s内主要分布于基膜和穿基膜的淋巴细胞胞膜上 ,可能对归巢淋巴细胞穿越 H EV s管壁有调节作 用 。 【关键词 】蛋白多糖 ; 高内皮微静脉 ; 肠系膜淋巴结 ; 大鼠 ( ) 【文章编号 】1006 - 2947 200501 - 0007 - 03 【中图分类号 】Q538; R39211 【文献标识码 】A The D istr ibu t ion of Pro teog lycan in the H igh En do the l ia l Ven u le s of Ra t M e sen ter ic L ym ph Node s 1 2 2 2 2 3 ZHOU H a i2b ing , L IU L i, L IU Ying, X IE Zun2jiang, H E Ye2chun ( 1. A irfo rce 93019 U n it Ho sp ita l of Ch ine se PLA , D a lian 116023; 2. D ep a rtm en t of A natom y, H a )rb in M ed ica l U n ive rsity, H e ilongjiang H a rb in 150086 Ch ina ( ) ( ) 【A b stra c t】O b jec t ive To study the d istribu tion of p ro teoglycan PGin h igh endo the lia l venu le s H EV sof m e sen te ric lymp h node to exp lo re the regu la to ry ro le of p ro teoglycan s fo r lymp hocyte hom ing. M e thod s The d istri2 bu tion of PG in lymp hocyte s in side H EV s wa s ob se rved unde r the ligh t m ic ro scop e and e lec tron m ic ro scop e w ith ca t2 ion ic iron co llo id so lu tion sta in ing2enzym e sequence b locked m e thod. Re su lts PG po sitive p roduc t wa s found in the ba sem en t m em b rane of H EV s and the lymp hocyte s m em b rane ad jacen t ba sem en t m em b rane, wh ich cou ld be b locked by hya lu ron ida se, hep a rina se and chond ro itina se. The co llo id granu le s we re m a in ly d istribu ted in side o r ou tside the ba sem en t m em b rane s and in the lymp hocyte m em b rane s trave rsing ba sem en t m em b rane s unde r the e lec tron m ic ro2 scop e. The endo the lia l ce lls, the lymp hocyte s trave rsing endo the lium and the lymp hocyte s in side the H EV s we re neg2 a tive ly sta ined. C on c lu s ion PG d istribu ted in the ba sem en t m em b rane s of H EV s and the lymp hocyte m em b rane s trave rsing ba sem en t m em b rane s m ay p lay an impo rtan t regu la to ry ro le fo r the hom ing lymp hocyte s trave rsing ba sem en t m em b rane s. 【Key word s】P ro teoglycan; H igh endo the lia l venu le; m e sen te ric lymp h node; R a t [ 1 ] ( )( p ro teoglycan, PG是细胞外基质 ex2 展等方面起重要作用 。最新研究发现 PG可能通蛋白多糖 )过对趋化因子的作用参与淋巴细胞归巢的调节 ,但trace llu la r m a trix, ECM 的重要组成成分 ,普遍存在 [ 2 ] 缺乏系统的确切的 认识 。淋 巴细 胞 归巢 是机 体 于组织间隙 、细胞面 、基膜等处 ,参与细胞分化 、生 行使免疫监视功能 ,产生免疫应答的前提和关键 ,而 长 、粘附 、迁移 、信息传递和组织形态结构的形成 。 ( 淋巴结等末梢淋巴组织中的高内皮微静脉 h igh en2 因此 ,在免疫细胞归巢 、组织炎症 、肿瘤 的 发 生 和 发 ) do the lia l venu le s, H EV s是 淋 巴 细 胞 归 巢 的 主 要 场 所 。本文根据 PG所含硫酸基和羟基呈强阴性荷电 【收稿日期 】2004 - 09 - 16 系膜淋巴结内 H EV s中 PG的存在部位和种类 ,以探 ,经坚固红核对比染色 ,淋巴细胞核呈红色 、H EV s 色 讨 PG与淋巴细胞归巢关系 ,为某些疾病的诊断 、预 的内皮细胞核呈浅淡的兰红相间着色或呈灰蓝色 , 防和治疗提供新的 。 大鼠肠系膜淋巴结 H EV s的基膜 、穿基膜的淋巴细 胞胞膜呈强阳性普鲁士兰着色 ,而内皮细胞 、腔内和 1 和方法 穿越内皮细胞的淋巴细胞几乎不染色 。肠系膜淋巴 健康成年 W ista r大鼠 () 20 只 ,体重 200 —300 克 结内的毛细血管与阳性胶体铁反应微弱 图 1 。 透由哈尔滨医科大学动物中心提供 。LR 2W h ite 树脂 、 明质酸酶消化处理后 , H EV s的基膜及其 附 () 软骨素酶 ABC、肝素酶 、角质 蛋白 酶 、神 经胺 酸酶 、 近的淋巴细胞阳性胶体铁反应受阻断 图 2 ,对照 胶原酶为 Sigm a公司产品 。 切片无改变 。软骨素酶 ABC、肝素酶 、角质蛋白素酶 连续消化后阳性胶体铁反应的阴性荷电部位显著减 在比妥钠麻醉下开胸 ,经升主动脉用林格氏液 () 灌流 ,再用 2 %多聚甲醛 - 1 %戊二醛 0. 1m d /L 二甲 少 ,不染色 图 3 ,对照切片无变化 。单纯用肝素酶 ( )() 砷酸缓冲液 pH 7. 4 灌流固定 。取肠系膜淋巴结 , 消化 ,基膜和淋 巴细 胞 胞膜 反应 明 显减 弱 图 4 。 再以上液固定 3 ,6 h。一部分进行石蜡包埋 ; 一部 单纯用软骨素酶 ABC 消化后 ,基膜呈阳性反应 ,而 ( )() 分切成小块 1 ×1 ×1mm 再固定 ,然后用 LR 2W h ite 树其周围的淋巴细胞染色明显减弱或消失 图 5 。胶 脂包埋或 1 %鋨酸后固定 , 812环氧树脂包埋 。 原酶或神经胺酸酶不能阻断阳性胶体铁的反应 。 1. 1 透射电镜212 电镜观察 ( ) 环氧树脂包埋样品超薄切片 ,醋酸油和柠锰酸 经阳性 胶 体 铁 pH1. 5 和 醋 酸 铀 染 色 的 LR 2 ( ) 铅染色 ,透射 电 镜 H 2700 日立 观察 ; LR 2W h ite 树 W h ite树脂包埋切片的电镜像反差不好 ,但于 H EV s 脂包埋样品超薄切片后于 pH1. 5 阳性胶体铁溶液 的基膜的内外侧或正在穿基膜的淋巴细胞胞膜上分 [ 3 ] 中孵育 ,再经醋酸铀染色 ,透射电镜观察 。 布有成簇的胶体颗粒 ,而内皮细胞 、腔内的淋巴细胞 112 光镜和正在穿越内皮的淋巴细胞胞膜上几乎见不到胶体 () 颗粒 图 6 。 将石蜡包埋样品行厚度为 5 ,10mm 的连续切 片 ,脱蜡后做如下处理 。 3 讨论 : 将切片置于 pH 值 1. 5 的阳 阳性胶体铁染色 PG是一类大分子糖复合物 ,主要由糖胺多糖共 性胶体铁溶液中孵育 ,用 1 %氰铁四钾和 1 %盐酸的 价连接于核心蛋白所组成 。糖胺多糖主要包括透明 [ 3 ] 混合液蓝化处理 , 再经核对比染色后光镜观察 。 质酸 、硫酸软骨素 、硫酸皮肤素 、硫酸角质素及硫酸 甲基化 和 皂 化 : 将 切 片 用 0. 8m l 31 % 盐 酸 和乙酰肝素 /肝素 。传统上根据核心蛋白结合的不同 100m l纯甲醇的混合液在 37 ?下孵育甲基化 。将甲 糖胺多糖类型将 PG分为 :硫酸乙酰肝素蛋白多糖 、 硫酸软骨素蛋白多糖 、硫酸皮肤素蛋白多糖 、硫酸角 基化的部分切片再用 1 % KOH 和 70 %酒精的混合 质素蛋白多糖等 。以前用铁蛋白 、钌红 、聚乙烯亚氨 液于 25 ?下 孵育 皂 化 。甲 基化 、甲 基 化 2皂 化 的 切 及其它阳性 荷电 探 针染 色 , 电镜 观察 技 术示 踪 PG ( ) 片和对照切片进行阳性胶体铁染色 pH1. 5 。 的形成和分布 ,但所发现的呈强阴性荷电的部位是 [ 4 ] 酶消化 : ? 切片经醋酸和氯化钠混合液清洗并 否是硫酸多糖或糖 胺多 糖导 致 的尚 不清 楚 。本 用透明质酸酶处理后再进行阳性胶体铁孵育 、蓝化 研究用阳性胶体铁 2酶阻断法证明大鼠肠系膜淋巴 结中的高内皮微静脉的基膜及其邻近的或穿越基膜 和核染 ,以不含透明质酸酶的醋酸钠和氯化钠混合 (的淋巴细胞胞膜上有丰富的与阳性胶体铁 甚至低 液处理的切片做对照 。 ? 分别以软骨素酶 ABC、肝 )pH 值 1. 5,2. 0 反应的强阴性荷电部位 。光镜研究 素酶 、角质蛋白酶 、神经胺酸酶 、胶原酶单独消化和 证明这些阴性荷电部位的胶体反应可以被甲基化阻 连续消化 ,以不含任何酶的缓冲液做对照 。再将这 断 ,用皂化不能还原 。进一步证明能用透明质酸酶 ( )些切片于阳性胶体铁 pH 1. 5 中孵育及蓝化反应 。 或软骨素酶 ABC 、肝素酶 、角质蛋白酶消化阻断 ,但 不能被神经胺酸酶和胶原酶消化 。以上结果这 2 结果 些阴性荷电部位是由硫酸化蛋白多糖构成的 。单纯 211 光镜观察 阳性胶体铁染色 :经 pH1. 5 的阳性胶体铁溶液 孵育 , 1 %氰铁四钾和 1 %盐酸混合液兰化处理后 , [ 1 ] E rkk i R. P ro teoglycan s in ce ll regu la tion [ J ]. J B io l Chem istry, 酸乙酰肝素蛋白多糖和硫酸软骨素蛋白多糖 。 ( ) 1989 , 264 23 : 13369 - 13372. 近年来由于粘附分子和趋化因子等理论的发 [ 2 ] John ston B , Kim CH , So le r D , e t al. D iffe ren tia l chemok ine re2 展 ,关于血液中循环的淋巴细胞穿越 H EV s管壁的 spon se s and hom ing p a tte rn s of m u rine TCR alp habe ta N KT cell 分子调节取得了长足的发展 ,研究表明 :淋巴细胞穿( ) sub se ts[ J ]. J Imm uno l, 2003 , 171 6 : 2960 - 2969. 越 H EV s壁归巢至淋巴组织 ,是在多种粘附分子 、趋 [ 3 ] O h tsuka A , M u rakam i T. A n ion ic site s on the free su rface of the p e ritoneal m e so thelium: ligh t and e lec tron m ic ro scop ic de tection u2 化因子等参与下 ,与 H EV s内皮细胞之间发生的多 [ 5 ] ( ) sing cation ic co llo ida l iron [ J ]. A rch H isto l Cyto l, 1994 , 57 4 : 步骤的复杂的迁移过程 。 H EV s内皮细胞和淋巴 307 - 315. 细胞上的粘附分子及其受体在趋化因子等诱导下 , [ 4 ] Taguch i T, O h tsuka A , M u rakam i T. L igh t and elec tron m ic ro scop 2 淋巴细胞上的粘附分子和内皮细胞接触 ,淋巴细胞 ic de tec tion of an ion ic site s in the ra t cho ro id s p lexu s [ J ]. A rch 在有选择素的血管内皮上开始滚动 ,来自趋化因子 ( ) H isto l Cyto l, 1998 , 61 3 : 243 - 252. [ 5 ] B a tche r EC. L ymp hocyte traffick ing and regional imm un ity [ J ]. 受体的信息活化整合素 ,诱导牢固粘附 ,然后反复 ( ) A dv Imm un ity, 1999 , 72 1 : 209 - 253. (粘附与脱粘附 , 最后向组织浸润 淋巴细胞穿越内 [ 6 ] To sh io . I Ce ll adhesion and m igra tion regu la ted by chemok ine s[ J ]. [ 6. 7 ] ) 皮间间隙或内皮内 ,再穿基膜 ,进入淋巴组织 , ( ) Techno logy of Ce ll, 2000 , 19 5 : 717 - 731. 关于组织浸润的调节一直少有报道 。本研究结果显 [ 7 ] H iro to K. P re sen ta tion of chemok ine s by p ro teoglycan s[ J ]. C lin lm 2 示高内皮微静脉的基膜和穿越基膜的淋巴细胞膜上 ( ) m uno l, 2000 , 33 2 : 166 - 172. 分布有 PG,提示这些硫酸蛋白多糖可能对淋巴细胞 Exp lana tion of F igu re s F ig 1 L igh t m ic rograp h of H EV s, incuba ted in ca tion ic iron co llo id a t PH 1. 5 , trea ted fo r P ru ssian b lue reaction. The ba sem en t m em b rane of H EV s and the lymp hocyte s m em b rane trave rsing basem en t m em b rane we re strongly sta ined w ith PG. The endo the lial ce lls, lymp hocyte s trave rsing endo the li2 um and in side the H EV s we re stained nega tive ly ×300 ( ) F ig 2 N ega tive ca tion ic iron co llo id sta in ing PH 1. 5 after d ige stion w ith hya lu ron ida se ×250( ) The cation ic iron co llo id sta in ing PH 1. 5 wa s weak o r no sta in ing on the who le afte r d ige stion w ith enzym e s ×250 F ig 3 ( ) D igested w ith simp lex hep a rina se and incuba ted in ca tion ic iron co llo id PH 1. 5 , the ba sem en t m em b rane sta in ing wa s weak ly po sitive, the lym 2 F ig 4 p hocyte s m em b rane s no t sta ined ×300 D ige sted w ith simp lex chond ro itina se and incuba ted in cation ic iron co llo id a t PH 1. 5 , the lymp hocyte m em b rane sta in ing wa s weak, the ba sem en t F ig 5 m em b rane sta in ing wa s still po sitive ×500 )( E lectron m ic rograp h of an u ltrath in sec tion, em bedded in LR 2wh ite re sin and stained w ith ca tion ic iron co llo id a t PH1. 5 , the co llo id granu le s ξ F ig 6 we re m a in ly d istribu ted in side o r ou tside the ba sem en t m em b rane s and in the lymp hocyte m em b rane trave rsing ba sem en t m em b rane s ×12000 ?ba sem en t m em b rane, ?lymp hocyte m em b rane, E: endo the lia l ce ll nuc leo lu s, L1: lymp hocyte nuc leo lu s in cavity, L2: lymp hocyte trave rsing endo the li2 um , L3: lymp hocyte s trave rsing ba sem en t m em b rane s, H EV: h igh endo the lia l venu le, B: ba sem en t m em b rane ()图见封三