酶联免疫吸附分析法测定血清中醋酸亮丙瑞林含量

酶联免疫吸附分析法测定血清中醋酸亮丙瑞林含量 酶联免疫吸附分析法测定血清中醋酸亮丙 瑞林含量 药物分析杂志ChinJPharmAnal2006,26(8) 酶联免疫吸附分析法测定血清中醋酸亮丙瑞林含量 董泗建,郑建全,池木根,王丽韫,闰海涛,邓祥惠,张振清,梁远军,刘克良 (军事医学科学院毒物药物研究所,北京100850) 摘要目的:建立一种检测微量醋酸亮丙瑞林的方法.方法:使用酶联免疫吸附分析法(ELISA),测定样品中醋酸亮丙瑞林含 量.结果:自制的兔抗亮丙瑞林抗血清具有良好的特异性.使用EL1SA测定醋酸亮丙瑞林的最低检出限为0.025ng?mL,, 精密度(日内RSD<23.5%,日间RSD<22.4%)良好.不同浓度醋酸亮丙瑞林的平均回收率为97.3%.含样品血清冷冻(一 20?)保存30d内,醋酸亮丙瑞林的检测结果稳定,重复性好.结论:本实验研究建立了一种操作简单,快速,特异性好,灵密 度高的醋酸亮丙瑞林检测方法. 关键词:醋酸亮丙瑞林;抗血清;酶联免疫吸附分析法 中图分类号:R917文献标识码:A文章编号:0254—1793(2006)08—1058—03 Enzyme?—?linkedimmunosorbentassayofleuprorelinacetateinserum DONGSi—jian,ZHENGJian—quan,CHIMu—gen,WANGLi—yun,YA NHai—tao, DENGXiang—hui,ZHANGZhen—qin,LIANGYuan—jLIB,LIUKe—li ang (InstituteofPharmacologyandToxicology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850,China) AbstractObjective:Todevelopasensitiveandeasyhandledmethodforthedeterminationofserumleuprorelin acetate.Methods:Theenzyme—linkedimmunosorbentassay(ELISA)was establishedtodeterminethecontentof leuprorelinacetateinserum.Results:Therabbit’santiserumdisplayedahighselectivebindingtoleuprorelin.The minimumofdeterminedleuprorelinacetatewas0.025ng?mL-.usingELISA.Precisionwasevaluatedwiththein— tra—assay(RSD<23.5%)andinter—assay(RSD<22.4%).Recoveryr atewas97.3%.Astableandrepeatable determinationwasstillobtainedwhentheserumcontainedleuprorelinacetatewasstoredfor30daysat20clC.Con. clusion:AnewmethodiSestablishedforthedeterminationofserumleuprorelinacetatewithELISA. Keywords:leuprorelinacetate;antiserum;enzyme—linkedimmunosorben tassay 醋酸亮丙瑞林为9个氨基酸所构成的小分子 肽,是促黄体生成激素释放激素(LH—RH)的高活 性衍生物.使用醋酸亮丙瑞林可以最终抑制垂体生 成和释放促性腺激素,以及抑制卵巢和睾丸对促性 腺激素的反应,临床上广泛用于治疗前列腺癌,子宫 内膜异位,子宫肌瘤和性早熟等疾病.据文献 报道,有关动物和人体血清及排泄物等生物样品中 亮丙瑞林的检测,主要采用双抗体放射免疫分析 法,.由于该方法采用放射性同位素,并且有时 需要使用高效液相色谱技术对生物样品进行预处 理,增加了生物样品中微量亮丙瑞林检测的困 难,使其在临床上的应用受到一定的限制.本文使 用酶联免疫吸附分析技术(ELISA),建立一种特异 通讯作者Tel:(010)66931632;E—mail:zhengjq@nic.bmi.ae.en 性好,灵敏度高,操作简单快速的醋酸亮丙瑞林检测 方法,为醋酸亮丙瑞林的药效,药代学研究,以及临 床患者血中醋酸亮丙瑞林含量的动态观察提供便利 的手段. 1仪器及试药 微量移液器(GILSON),酶标仪(TECAN),一70 clC冰箱(FormaScientific,INC),96孑L酶标板(江苏 海门市三和亚美玻璃制品厂),37clC孵箱(天津医疗 器械厂),4clC,一20clC冰箱(青岛海尔股份有限公 司),LD5—2A型医用离心机(北京医用离心机厂). 兔抗亮丙瑞林抗血清(滴度1:100万,自制),醋酸 亮丙瑞林(纯度99%,自制).羊抗兔辣根过氧化酶 (滴度1:1万,北京中山生物技术有限公司).3,3, 药物分析杂志ChinJPharmAnal2006,26(8)一1059— 5,5一四甲基联苯胺(TMB,Sigma),脱脂奶粉(内蒙 古伊利实业集团股份有限公司),牛血清白蛋白 (BSA,Sigma),大白兔(本院动物场提供),其他试剂 均为国产分析纯. 2试剂配制 2.1包被稀释液(碳酸盐缓冲液,pH9.6)碳酸钠 1.59g,碳酸氢钠2.93g,加双蒸水溶解至1000mL. 2.2磷酸盐缓冲液(pH7.4)氯化钠8.1816g, 氯化钾0.2013g,磷酸二氢钾0.245g,无水磷酸氢 二钠1.434g,加双蒸水溶解至1000mL. 2.3洗涤液吐温1.0mL,加磷酸盐缓冲液溶解 至1000mL. 2.4样品稀释液脱脂奶粉1g,加磷酸盐缓冲液 溶解至100mL. 2.5封闭液脱脂奶粉10g,加磷酸盐缓冲液溶解 至100mL. 2.6底物显色液乙二胺四乙酸二钠0.02g,柠檬 酸0.111g,醋酸钠0.136g,甘油7.5mL,3,3,5,5 一 四甲基联苯胺0.02g,30%过氧化氢0.03mL,加 双蒸水溶解至100mL. 2.7终止液(2tool?L硫酸)取双蒸水445 mL,缓慢滴加浓硫酸56mL. 2.8样品溶液用万分之一电子天平称取醋 酸亮丙瑞林10mg,用生理盐水溶解并稀释至10 mL,分装,一2O?冰箱保存备用. 3兔抗亮丙瑞林抗血清的制备 制备免疫抗原:参考Sperll6法合成免疫抗原 (BSA一亮丙瑞林). 动物免疫:大白兔,2.5,雄性,采用佐剂皮下 多点免疫法,每次每只注射1mg免疫抗原,间隔2O d免疫1次,免疫11次制备抗血清. 抗血清制备:采用动脉取血法,收集兔血,待血 凝后,1000r?rain离心5rain,收集血清,分装,一 80?冰箱保存备用. 抗血清溶液:用样品稀释液按1:3428的比例将 免抗亮丙瑞林稀释,即得. 4测定方法 参考Sperll6法.首先用包被液(pH9.6)稀释 醋酸亮丙瑞林至终浓度15Ixg?mL,,加到酶标板 孔中,每孔0.1mL,4?孵育5d.然后用洗涤液洗 涤已包被抗原酶标板,每孔0.2mL,每次3rain,洗 涤3次.每孔加10%脱脂奶粉磷酸盐缓冲液(pH 7.4)0.2mL,37?孵育1h,用洗涤液洗3次,甩干. 每孔分别加不同浓度标准样品(按”5.1”项下方法 制备)或待测样品(按”5.6”项下方法制备)0.1 mL,置37?孵箱反应1h,用洗涤液洗3次,甩干. 每孔加入1:7000羊抗兔辣根过氧化酶0.1mL,置 37?孵箱反应1h,用洗涤液洗5次,甩干.每孔加 底物显色液0.1mL显色,反应10rain.每孔2tool ? L硫酸0.05mL终止反应,在450nm处测定光 密度值. 5结果 5.1标准曲线的制作取1mg?mL醋酸亮丙瑞 林标准样品溶液,用样品稀释液稀释制得浓度为 0.125,0.5,5,50,500,5000ng?mL的系列溶液, 分别取不同浓度的溶液(终浓度为0,0.025,0.1,1, 10,100,1000ng?mL)0.07mL,加1:3428兔抗亮 丙瑞林抗血清溶液0.08mL,加正常比格犬血清0.2 mL,总反应体积为0.35mL,同时做空白对照,在37 ?反应2h,制得标准样品.按”4”项下方法,测定 光密度值,分别计算不同浓度的抑制率.以不同标 准样品浓度的对数值为横坐标,以抑制率值为纵坐 标,Hill(Origin6.0制图软件)方程拟合得到标准曲 线,最大抑制率为95.34%,IC.为4.74ng?mL,, Hill系数为0.69.回归方程: X=『(y×4.74.)/(95.34一y)]’.胡)r:0.9998 在0.025—1000ng?mL浓度范围内,浓度与抑制 率呈较好的量效关系. 5.2特异性试验为了观察本实验所使用的自制 兔抗亮丙瑞林抗血清的特异性,分别加入浓度为 0.01,0.1,1,10,100,1000ng?mL的亮丙瑞林和 LH—RH,进行特异性竞争抑制结合实验(=3). 结果见图1.提示本实验所使用的抗体只与亮丙瑞 林抗原有特异性结合,并且随着亮丙瑞林浓度的增 加,其竞争抑制性结合明显增加,现出良好的剂量 依赖性关系;而其与LH—RH没有明显的竞争性结 合反应,表明我们制备的兔抗亮丙瑞林抗血清具有 很好的特异性. 5.3稳定性试验用比格犬血清分别配制成 1.25,25,500ng?mL’.3种浓度的醋酸亮丙瑞林 血清样品,冻存于一20?冰箱.分别对冷冻0,3, 6,12,35d的亮丙瑞林血清样品进行测定(=5). 结果表明,1.25,25,500ng?mL3种浓度冷冻 不同时间的样品RSD分别为3.77%,3.58%, 1.65%,表明亮丙瑞林样品放置一20?保存35d 内基本稳定. 一 1060一药物分析杂志ChinJPharmAnal2006,26(8) 0.0010.010.1l10[001000 C/ngmL一 图1兔抗亮丙瑞林抗血清特异性竞争抑制结合实验 Fig1Specificcompetitiveinhibitoryassayoftheantiserum 1.LH—RH2.醋酸亮丙瑞林(1euprorelinacetate) 5.4精密度试验 5.4.1日内精密度分别取0.5,25,500ng? mL3种浓度的亮丙瑞林血清样品(终浓度为0.1, 5,100ng?mL)0.07mL,每种浓度重复6次,按 “4”项下方法,在同一时间内进行样品测定,以考察 方法的日内精密度.实验结果表明,不同浓度样品 日内RSD分别为23.5%,19%,12.5%. 5.4.2日间精密度分别取2.5,50,250,2500ng ?mL4种浓度的亮丙瑞林血清样品0.07mL(终 浓度为0.5,10,50,500ng?mL),按”4”项下方 法,连续6d测定(n=6),以考察方法的日间精密 度.实验结果表明,不同浓度样品日间RSD分别为 22.4%,12%,7.6%,14%. 5.5回收率试验分别取0.5,5,50,500,5000ng ?mL5种浓度的亮丙瑞林血清样品0.07mL(终 浓度为0.1,1,10,100,1000ng?mL),按”4”项下 方法测定不同浓度样品的含量,以加入量数值作为 对照,计算血清样品中亮丙瑞林的回收率.结果表 明,不同浓度平均回收率为97.3%. 5.6样品测定每只比格犬给醋酸亮丙瑞林3.75 mg,给药0.25,0.5,1,2,3,4,6,24,48,72h后分别 取血清0.2mL,加1:3428兔抗亮丙瑞林抗血清溶 液0.08mL,加样品稀释液0.07mL,总反应体积为 0.35mL,同时做空白对照,在37cI=反应2h,制得待 测样品.按”4”项下方法,测定光密度值,计算样品 抑制率值(y),将y值代入标准样品方程,计算待测 样品血药浓度().结果(ng?mL’.,n=4)分别为 2.91-4-1.10,8.58-4-1.38,121.20-i-7.02,27.43-i- 8.54,19.64-i-9.16,15.39-i-9.19,3.59-i-1.73,0.87 - i-0.48,0.23-4-0.14,0.85-i-0.38.表明本方法适用 于醋酸亮丙瑞林药代动力学的检测. 6讨论 醋酸亮丙瑞林目前广泛用于治疗早熟,女性子 宫内膜异位症,子宫肌瘤,绝经前乳腺癌和男性前列 腺癌,最近美国FDA又批准了加拿大QLT公司的醋 酸亮丙瑞林注射用混悬剂(1euprolideacetate,eli— gard,45mg)上市,用于姑息治疗晚期前列腺癌. 血,尿等生物样品中醋酸亮丙瑞林含量的测定 为其药效学和药代动力学等研究所必需,同时也用 于临床对使用醋酸亮丙瑞林患者血药浓度的监测, 以指导临床用药.目前使用的方法为放射免疫检测 法,存在一些缺点,如同位素价格昂贵,污染环境,需 要大型设备放射性记数仪,耗时长,通量低等,本研 究在获得自己制备的兔抗亮丙瑞林抗血清的基础 上,采用ELISA技术,建立了一种新型醋酸亮丙瑞 林酶联免疫吸附分析法.由于制备的兔抗亮丙瑞林 抗血清效价高(滴度为1:100万),所以本方法的灵 敏度比较高,最低检出限可达到0.025ng?mL,, 与文献报道的放射免疫检测法灵敏度相似.方 法学评价结果表明,本方法的稳定性,准确性,重复 性及回收率都比较好,能满足实验要求. 基于以上研究结果,我们认为使用ELISA技 术检测醋酸亮丙瑞林含量的方法,可代替传统的 放射免疫检测法,以克服其成本高,易造成环境污 染等缺点.本方法不需要昂贵仪器,操作简便,安 全,快速,灵敏度高,尤其适合于实验室大批量生 物样品的测定. 参考文献 1Perez—MarrenoR,ChuFM,GleasonD,eta1.Asix—month,open— labelstudyassessinganewformulationofleuprolide7.5mgforsup— pressionoftestosteroneinpatientswithprostatecancer.ClinTher, 2oo2,24(11):1902 2Eyal0,RoseSR.Autoimmunethyroiditisduringleuprolideacetate treatment.,Pediatr,2004,1,:t-4(3):394 3UenoH,MatsuoS.High—performanceliquidchromatographyfol— lowedbyradioimmunoassayforthedeterminationofaluteinizinghor- mone—releasinghormoneanalogue,leuprorelin,anditsmetabolite.J Chromatogr,1991,566(1):57 4OkadaH,YamazakiI,YashikiT,eta1.Vaginalabsorptionofapotent luteinizinghormone—releasinghormoneanalogue(1euprolide)in rats.IV:Evaluationofthevaginalabsorptionandgonadotropinrespon— sesbyradioimmunoassay.JP Sci,1984,73(3):298 5YamazakiI,OkadaH.Aradioimmunoassayforahighlyactiveluteini— zinghormone—releasinghormoneanalogueandrelationbetweenthe seD.1mleveloftheanalogueandthatofgonadotropin.EndocrinolJpn, 1980,27(5):593 6SperlJ,PaliwalV,RamabhadranK,eta1.SolubleTcellreceptor:de— tectionandquantitativeassayinfluidphaseviaEL1SAorimmune— PCR.JlmmunolMethods,1995,186(2):181 (本文于2005年4月21日收到)