蛇鳞草提取液体外抑菌作用研究.doc

蛇鳞草提取液体外抑菌作用研究.doc 蛇鳞草提取液体外抑菌作用研究 作者:钟希文，梅全喜，高玉桥，林慧，胡莹 【摘要】 目的对蛇鳞草提取液体外抑菌作用进行初步研究。方法采用试管二倍稀释法测定蛇鳞草的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。结果蛇鳞草水提液对金黄色葡萄球菌的MIC为63 mg/ml，MBC为500 mg/ml，对大肠杆菌的MIC为250 mg/ml。蛇鳞草醇提液对金黄色葡萄球菌的MIC为125 mg/ml，MBC为500 mg/ml，对大肠杆菌的MIC为250 mg/ml，MBC为500 mg/ml。两种提取液对绿脓杆菌均未呈现抑菌活性。结论蛇鳞草提取液具有一定的抑菌和杀菌活性。 【关键词】 蛇鳞草; 抑菌活性; 最低抑菌浓度; 最低杀菌浓度 蛇鳞草Abacopteris triphylla (Sw.) Ching，又名蛇退步、三枝标、三叉蕨、入地蜈蚣，为蕨类金星蕨科新月蕨属三羽新月蕨的干燥全草,1,。主产于广东，在福建、广西、云南、台湾等地也有出产。蛇鳞草味辛、苦，性平，具清热解毒，散瘀消肿、化痰止咳的功效，主要用于痈疮疖肿、毒蛇咬伤、跌打损伤、湿疹、皮肤瘙痒以及急、慢性支气管炎的治疗。但其仅作为一种民间中草药在使用，国内外对其研究甚少，曾有报道其化学成分主要为三羽新月蕨苷(Triphyllin)A、B、C,2,。20世纪70年代初期，广东省中山市中医医院以蛇鳞草为主药研制成“复方蛇鳞草散”及“复方蛇鳞草膏”，临床上用于治疗毒蛇咬伤、甲沟炎、皮炎、湿疹、痈疮疖肿等病症，应用至今疗效确切，为该院中医皮肤科、外科特色专药。蛇伤专科以蛇鳞草为主药研制的“蛇黄散”，用于治疗初期疮疡，蛇伤虫咬肿痛等,3,5,，其疗效显著，为中医院蛇伤专科的特色专药。梅全喜等,6,报道了”蛇黄散”具有抗炎、镇痛的药理作用，然而，目前尚未见相关蛇鳞草体外抑菌活性等方面的文献报道。本实验观察蛇鳞草的体外抑菌作用，为充分发掘其市场潜力，开发其可利用性提供实验参考。 1 材料 1.1 实验材料与试剂蛇鳞草原植物采集于广东中山市五桂山，经鉴定为蛇鳞草Abacopteris triphylla(Sw.) Ching。实验菌株:金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、大肠杆菌(ATCC 25922)、绿脓杆菌(ATTC 27853)，均由中山市中医院检验科提供。培养基:营养琼脂(广东环凯微生物科技有限公司，批号:200901071)、营养肉汤(广东环凯微生物科技有限公司，批号:200810267)。其余试剂均为分析纯。 1.2 仪器UV-754型紫外分光光度计;BS224S型电子天平 (北京赛多利仪器系统有限公司);LMQR-4060型立式灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司);PYX-DHS-35×40型隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂);XSW-CJ-2A型净化工作台(吴江市津化设备总厂)。 2 方法与结果 2.1 培养基的制备 2.1.1 营养琼脂培养基准确称取3.3 g营养琼脂至250 ml锥形瓶中，加入100 ml蒸馏水，加热至全溶，调整pH为7.4，封瓶口后灭菌备用。 2.1.2 营养肉汤培养基准确称取9g营养肉汤至500 ml锥形瓶中，加入500 ml蒸馏水，加热至全溶，调整pH为7.4，封瓶口后灭菌备用。 2.2 溶液制备 2.2.1 蛇鳞草水提液的制备称取50g蛇鳞草干品，剪碎放入烧杯中，加适量蒸馏水浸泡30 min后加热煎煮1 h，经过滤得第一次煎液;药渣再加入适量蒸馏水加热煎煮1 h。合并两次水煎液，浓缩至每毫升药液相当于含生药1g。 2.2.2 蛇鳞草醇提液的制备称取50g蛇鳞草干品，剪碎放入圆底烧瓶，加入适量稀释至60%的乙醇液，安装回流装置，加热回流1 h，过滤得第1次醇提液;药渣再加入适量乙醇液加热回流1 h，过滤。合并两次滤液，浓缩至每毫升药液相当于含生药1g。 2.2.3 麦氏比浊标准液,7,的配制 用电子天平称取1.175 6 g氯化钡，蒸馏水定容至100 ml，配成0.048 mol/L氯化钡溶液;再量取1 ml 95%浓硫酸，加入94 ml蒸馏水，配成0.18 mol/L硫酸溶液。0.048mol/L氯化钡0.5 ml加0.18 mol/L硫酸溶液99.5 ml，混匀后用530 nm波长比色调整其浊度，使吸光度为0.1该浊度为0.5麦氏比浊标准，相当于5×(107,108)CFU/ml。 2.2.4 菌液,8,的配制实验菌种经平板分离培养24 h后，挑取数个菌落置于生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准，再用营养肉汤1?100稀释，使含菌量达到106 CFU/ml为工作浓度。 2.3 最低抑菌浓度(MIC)判定标准首先在观察细菌对照组长菌呈浑浊状，而药物对照组不长菌，呈透明清亮状的前提下，再观察实验组试管的浑浊情况，以判断不同浓度药液的抑菌作用，如试管内呈浑浊，明有细菌生长，用“，”表示;如试管内透明清亮，表明无细菌生长，用“-”表示。2.4 蛇鳞草水提液MIC的测定,8,取30支试管于试管架上，分为3组，每组10支。用移液管吸取2 ml营养肉汤于每支试管内，再另取移液管吸取2 ml蛇鳞草水提液(1 g/ml)于每组的第1支试管内，吹匀，使药液与肉汤混匀，再从每组第1管吸取2 ml混匀液到每组第2管中，如此类推一直到第9 管，再从第9管中吸取2ml混匀液舍去，第10管为细菌对照组，不加药液。即每组试管中的药液浓度为0.5，0.25，0.125，0.063，0.032，0.016，0.008，0.004，0.002，0.000 g/ml。3组试管分别加入金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌的实验菌液0.1 ml。另取9支试管，稀释步骤按上述进行，此组不加入菌液，为药液对照组。将试管置于37?培养箱中培养24 h，实验组与对照组对比观察结果。结果见表1。表1 蛇鳞草水提液最低抑菌浓度(MIC)的测定(略) 表1实验结果可见，蛇鳞草的水提取液对金黄色葡萄球菌的MIC为63 mg/ml，对大肠杆菌的MIC为250 mg/ml，各浓度水提取液对绿脓杆菌均未呈现抑菌活性。表明蛇鳞草水提取液对金黄色葡萄球菌的敏感性比大肠杆菌高，抑制金黄色葡萄球菌的效果较好。至于各浓度水提液对绿脓杆菌未得出MIC，初步分析可能为药物未浓缩至对绿脓杆菌的有效抑菌浓度，有待进一步实验验证。 2.5 蛇鳞草醇提液MIC的测定具体操作方法同蛇鳞草水提液MIC的测定。结果见表2。表2 蛇鳞草醇提液的最低抑菌浓度(MIC)的测定(略) 表2实验结果可见，蛇鳞草醇提取物对金黄色葡萄球菌的MIC为125 mg/ml，对大肠杆菌的MIC为250 mg/ml，醇提取物各稀释浓度对绿脓杆菌均无抑菌活性，对比蛇鳞草水提取物的抑菌效果，醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果不如水提取液好，而对于大肠杆菌两种提取物的抑菌效果相当。 2.6 蛇鳞草水提液及其醇提液的MBC测定,9,分别取蛇鳞草水提液和醇提液各有效抑菌浓度药液和对照组相对应的浓度药液0.1 ml移种至不含药物的营养琼脂平皿上，用灭菌接种环轻推药液，各平皿置37?培养箱中培养24 h，观察有无细菌生长。以平皿培养基中，计数少于5个菌落者作为该药物的最低杀菌浓度(MBC)。结果见表3。表3 蛇鳞草水提液与醇提液最低杀菌浓度(MBC)测定结果(略) 表3实验结果可见，蛇鳞草水提液与醇提液对金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度(MBC)均为500 mg/ml，蛇鳞草醇提液对大肠杆菌的MBC为500 mg/ml，而蛇鳞草水提液对大肠杆菌的MBC在本次实验中未有呈现。本实验表明蛇鳞草醇提液对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌均具有良好的抑菌活性。 3 讨论 本实验采用试管二倍稀释法分别测定蛇鳞草水提液和醇提液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌的最低抑菌浓度(MIC)，并在此基础上又测定了两种溶剂提取物分别对各菌的最 低杀菌浓度(MBC)，本实验结果表明，蛇鳞草水提液及其醇提液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均具一定的抑菌活性，且对金黄色葡萄球菌的活性更为显著，但对绿脓杆菌的抗菌作用未有明显体现，具体原因有待进一步研究探讨。 药物抗菌效力的测定对于抗菌药物的筛选具有重要的意义。虽然本次实验所用菌种较少，但是以实验的结果来看，本次实验表明了蛇鳞草具有一定的抗菌作用，为今后进一步研究蛇鳞草的抗菌作用提供了实验数据，并为将来进一步开发利用蛇鳞草这一广东地产中草药资源奠定了实验基础。 【