井冈霉素产生菌的诱变选育及发酵条件优化

井冈霉素产生菌的诱变选育及发酵条件优化 () Aug. 2008 2008 年 8 月 自然科学版四川大学学报 ( )第 45 卷第 4 期Jo ur nal of Sichuan U niversity Nat ural Science Editio n Vol . 45 No . 4 () 文章编号 : 049026756 20080420963204 井冈霉素产生菌的诱变选育及发酵条件优化 廖晓 , 陶 科 , 侯太平 ()四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 , 成都 610064 ( 摘 要 : 本研究以一株能产生井冈霉素的吸水链霉菌井冈变种 S t re pto m yces hy roscu picus ) ( ) () var . J i n gga n ggensis yen J 1 为研究对象 ,通过紫外线 U V及硫酸二乙酯 D ES两次诱变 ,经平 - 6 皿初筛 ,摇瓶复筛 ,获得菌株 J 12U2D ,效价达 25874 ×10 g/ mL ,比出发菌株提高 29 %. 菌株 经 过 5 次传代 ,代间效价差异不明显 ,遗传性能较稳定. 通过单因素实验和正交实验分析研究 了 ( ) 摇瓶产井冈霉素的最适发酵培养基 ,该菌的最适发酵培养基为 %:淀粉 12 % 、酵母粉 4 % 、 KHPO0 . 05 % 、NaCl 0115 %. 最适发酵条件为 :发酵起始 p H 值 7 . 2 ,接种量 8 % ,发酵温度 37 2 4 - 6 ?,发酵时间 96 h . 菌株最终效价达 30610 ×10 g/ mL ,比出发菌株提高 53 %. 关键词 : 井冈霉素 ; 菌种选育 ; 物理化学诱变 ; 发酵条件 中图分类号 : Q93文献标识码 : A Breeding of a j inggangmyc in produc ing stra in an d opt imizat ion on f ermentat ion con dit ions L IA O X i ao2X u n , TA O Ke , HO U T ai2Pi n g ( Key L aboratory of Bio2Resources and Eco2Enviro nment , Minist ry of Educatio n , )College of Life Sciences , Sichuan U niversity , Chengdu 610064 , China Abstract : The st rain imp rovement st udies of S t re pto m yces hy roscu picus var . J ingganggensis were carried o ut by U V2radiatio n and D ES as mutagens. One jinggangmycin high2p ro ducing st rain of S t re pt o m yces hy roscu pi2 - 6 cus var . J ingganggensis , J 12U2D was selected. The yields of t he st rain was 25874 ×10 g/ mL , increased by29 % t han t he start st rain . It’s p roperties of highly p ro ducing jinggangmycin remained stable af ter five times. The fer mentatio n cult ure medium was op timized by o rt hogo nal designed single f acto r experiment . The op timal cult ure medium fo r fer mentatio n were show n as follow s : f aecula 12 %、yeast pow der 4 % 、KHPO0 . 05 % 、 2 4 NaCl 0 . 15 %. The op timum fer mentatio n co nditio ns were p redicted as below : p H 7 . 2 befo re sterilized ,inocu2 lated volume 8 % ,fer mentatio n temperat ure 37 ?, fer mentatio n time 96 h . And t he final yields of t he st rain - 6 was 30610 ×10 g/ mL ,increased by 53 % t han t he start st rain . Key words : jinggangmycin , breeding of bacterial st rain , p hysiochemical mutagens , fer mentatio n co nditio ns 功能 ,可分为防病抗生素 、杀虫抗生素和除草抗生 1 引言 素 . 我国农用抗生素的研究始于 20 世纪 50 年代. 农用抗生素是微生物产生的重要次级代谢产 几十年来相继开发出“5406”菌株 、井冈霉素 、农抗 物之一 ,可用于农业上有害生物的防治. 按其作用120 、武夷霉素 、浏阳霉素 、阿维菌素等一大批农用 收稿日期 : 2007204202 ; 修回日期 : 2007205221 ( ) 作者简介 : 廖晓 1981 - ,男 ,四川自贡 ,2004 级硕士研究生 ,主要研究领域为微生物农药. 通讯作者 : 侯太平. E2mail : ho utp @to m. co m 1 ,2 . mL ,于 37 ?, 200 r/ min 摇床上分别处理 0 . 2 h , 抗生素 井冈霉素是一株在井冈山地区发现的微生物 015 h ,1 . 5 h 和 6 h 后 ,加入 2 %NaSO终止诱变 ,2 3 菌株所产生的农用抗生素 . 对防治水稻纹枯病具有 将处理后的孢子悬液梯度稀释后涂板避光培养.特效 , 也 可 用 于 水 稻 稻 瘟 病 , 小 麦 纹 枯 病 的 防 2 . 2 . 2 效价的测定 初筛时效价的测定 : 检定菌 38 治. 此外 ,井冈霉素还被推广到其他作物的病菌 为水稻纹枯病菌. 害防治上. 虽然井冈霉素发现至今已有 30 余年 ,但 复筛时效价的测定 :按照井冈霉素水剂国家标 因其高效 , 低毒 , 对环境友好 , 以及尚未发现抗药( ( ) ) 准 GB/ T9553293,上高效液相色谱 HPL C测定 48 性,深受广大农户的欢迎. 其效价. 9 如何提高井冈霉素工业生产水平是一直受重( 2 . 2 . 3 井冈霉素效价的计算 HPL C 法按照 视的问题 ,选育高产菌株更是一种有效的手段 ,传 ( ) 井冈霉素水剂国家标准 GB/ T9553293,井冈霉素 统的诱变育种方法是获得高产突变株 ,提高和保持 A 采用液相色谱法测定 ,试样经 500 倍稀释 ,使用 生产水平的基本之一 ,多年来一直应用于微生 ODS2C色谱柱 , 紫外检测器 , 对井冈霉素进行分 18 物工业中. 此外 ,发酵培养基及培养条件的优化也 离 ,以外标法峰面积定量. 计算得到井冈霉素的效 是提高工业生产水平的有效手段之一 . 本文主要报 价 . ( ) ( ) 道通过紫外线 U V 和 硫酸二乙酯 D ES诱变对 井冈霉素产生菌 J 1 进行选育 ,以及发酵培养基与 2 . 2 . 4 遗传稳定性实验 将诱变产生的高产菌 发酵条件的优化等研究结果. 株在斜面上连续传代 5 次 ,检测其代间效价. 3 结果与分析 2 材料和方法 菌株选育结果 3 . 1 2 . 1 材 料 3 . 1 . 1 紫外线诱变 以 J 1 为出发菌株 ,进行紫外 ( 菌 种 2 . 1 . 1 吸 水 链 霉 菌 井 冈 变 种 S t re pto线诱变 ,从表 1 可以看出 ,随着诱变时间的增加 ,菌 ) m yces hy roscu picus var . J ingganggensis yen、水稻纹 株的致死率不断提高. 当诱变时间为 30 s 时 ,菌株 ( ) 枯病菌 Pel l icul a ri a sasaki i 均由四川大学生物资 的致死率为 81 % ,正变率为 21 %. 因此选择在 30 s 源与生态环境教育部重点实验室提供 . 下对菌株进行诱变处理. 紫外诱变后 ,平板初筛出 2 . 1 . 2 培养基 试管斜面 、孢子活化培养基 :高氏73 株正变菌株进行摇瓶发酵复筛实验. 通过效价 5 ?号培养基.检测 ,复筛得到 3 株效价较好的菌株 ,进行 D ES 诱 ( ) 基础发酵培养基 %: 米粉 9 . 0 ,黄豆饼粉 3 . 变 . 0 , KHPO0 . 1 ,NaCl 0115 ,p H 6 . 7 . 2 4 表 1 诱变时间对致死率及正变率的影响 井冈霉素标样由上海农 2 . 1 . 3 井冈霉素标样 Tab. 1 Effect of mutatio n time o n Fatatlityrate 药所提供.and positive mutatio n rate 2 . 2 方 法( )0 30 60 90 120 150 180 s 诱变时间 2 . 2 . 1 诱变方法 首先制备单孢子悬液 ,将孢子 ( )0 81 83 87 88 89 93 致死率 % 8 浓度调整为 10个/ mL .( )正变率 % 0 21 15 10 5 4 0 6 紫外线诱变:取出发菌株 J 1 的单孢子悬液 , 加入放有无菌搅拌棒的的培养皿中 ,置于磁力搅拌 3 . 1 . 2 D ES 诱变 由表 2 可以看出 ,D ES 对菌株 器上 ,调整培养皿至紫外灯距离为 30 cm. 打开皿 具有强烈的致死作用 ,D ES 处理 0 . 2 h ,致死率即( 盖 ,开启 磁 力 搅 拌 器 恒 速 搅 拌 , 紫 外 灯 波 长 254表 2 0 . 2 %D ES 处理时间对致死率的影响 ) nm下分别照射 0 s 、30 s 、60 s 、90 s 、120 s 、150 s 、Tab. 2 Effect of mutatio n time o n Fatatlityrate 180 s ,将照射后的孢子悬液做梯度稀释后涂板避 of 0 . 2 %D ES 光培养. ( )0 . 2 1 . 5 6 015 处理时间 h 7 D ES 诱变: 在紫外诱变的正变菌株中选取 ( )92 . 3 94 96 . 4 98 . 5 致死率 % 效价较高的菌株进一步进行 D ES 诱变. 取新鲜制 备的出发菌 株 的 孢 子 悬 液 5 mL , 加 入 D ES 0 . 04 达 92 . 3 % ,但是随着时间的变化 ,致死率的增加却 mL ,再 加 入 0 . 1 mol/ L p H7 . 0 的 磷 酸 缓 冲 液 15 第 4 期 廖晓 等 :井冈霉素产生菌的诱变选育及发酵条件优化 965 不大. 选择 在 30 s 下 对 菌 株 进 行 诱 变 处 理. 通 过 于产素 , 因 此 选 择 p H7 . 2 作 为 培 养 基 的 起 始 p H 值 .D ES 再次诱变 ,选育得到高产菌株 J 12U2D ,效价为 - 6 25874 ×10 g/ mL . 3 . 1 . 3 稳定性实验 将高产菌株 J 12U2D 在斜面 培养基上连续传代五次 ,测定其效价 ,发现其效价 - 6 为 25187 ×10 g/ mL ,具有良好的遗传稳定性. 3 . 2 发酵条件优化 3 . 2 . 1 不同碳 、氮源对 J 12U2D 产井冈霉素能力的 影响 采用 6 种碳源取代基础发酵培养基中的碳 源米粉 ,结果见表 3 . 由表 3 可以看出 ,使用淀粉作 - 6 为碳源时效价最高 ,达 28090 ×10 g/ mL . 表 3 单因素碳源选择使用结果 图 1 培养基 p H 值对化学效价的影响 Tab. 3 Effect of single carbo n source o n Fig. 1 Effect of initial p H in medium o n p roductio n of J inggangmycin chemical potency 化学效价 ( )碳源 用量 % - 6 ( )×10 g/ mL 3 . 2 . 3 培养温度对 J 12U2D 产井冈霉素能力的影 碳酸钙 9 7408 响 将发酵培养基接种后分别置于 33 ?、35 ?、 碳酸氢钠 9 9332 37 ?、39 ?、41 ?下摇瓶培养 ,结果见表 5 . 由表 5 牛肉膏 淀9 11036 粉 乳糖 可以看出 ,在温度为 37 ?时 ,菌体的产井冈霉素能 9 28090 葡萄糖 米 力最强. 9 22391 粉 表 5 培养温度对化学效价的影响 9 16451 Tab. 5 Effect of cultivatio n temperat ure 9 25874 o n Chemical potency - 6 ( )培养温度 ? ( ) 化学效价 ×10 g/ mL 进一步采用 6 种氮源取代基础发酵培养基中 33 20635 的氮源黄豆饼粉 ,由表 4 可以看出 ,使用有机氮源 35 23356 更有利于菌体生产及产素 ,其中 ,使用酵母粉作为 37 25874 - 6 氮源时效价最高 ,达 27076 ×10 g/ mL .39 24367 表 4 单因素氮源选择使用结果 41 24032 Tab. 4 Effect of single nit rogen source o n p roductio n of J inggangmycin 3 . 2 . 4 种龄及接种量对 J 12U2D 产井冈霉素能力 化学效价 的影响 分别取 60 h 、72 h 、84 h 、96 h 不同种龄的 氮源 ( )用量 % - 6 ( )×10 g/ mL 液体种子进行试验 ,结果发现 ,菌株产井冈霉素的 酵母粉 3 27076 蚕蛹粉 蛋能力与种龄成正比. 将 96 h 液体种子以不同接种 3 14379 白胨 氯化3 17928 量接入发酵培养基进行试验 ,结果表明 ,8 %的接种 铵 硝酸钾 3 7432 硝酸铵 黄量最有利于井冈霉素的产生. 3 7321 豆饼粉 4 ( ) 3 . 2 . 5 正交试验 选用 L 9 3表对发酵培 3 8459 养基成分淀粉 ,酵母粉 , KHPO,NaCl 四个因素设 2 4 3 25874 计正交试验. 根据正交试验结果 ,得到其最适发酵 培养 基 : 12 % 淀 粉 、4 % 酵 母 粉 、0 . 05 % KHPO、 2 4 3 . 2 . 2 培养基起始 p H 值对 J 12U2D 产井冈霉素 - 6 0115 %NaCl , 化 学 效 价 达 到 29463 ×10 g/ mL . 能力的影响 为了比较不同的起始 p H 值对井冈 根据极差分析 ,淀粉对产井冈霉素影响最大 ,酵母 霉素产素能力的影响 ,采用不同 p H 值的缓冲溶液 粉次之 , KHPO,NaCl 对产素能力的影响较小. 2 4 配制发酵培养基 , 结果如图 1 所示 , 在 p H 为 7 . 2 时 ,菌株的产素能力最强 ,p H 值偏高或偏低都不利 在选育得到 J 12U2D 的基础上 ,通过对 J 12U2D 3 . 3 J12U2D 菌株发酵产井冈霉素曲线的确定 菌株培养基配方和培养条件的优化选择以及正交 采用 J 12U2D 菌株进行摇瓶发酵 ,按照产生井 实验 ,初步确定最适宜该菌生长的培养基配方及培 冈霉素的最佳发酵条件 : 以 12 %的淀粉作为碳源 , 养条 件 如 下 : 淀 粉 12 % , 酵 母 粉 4 % , KHPO0 . 2 4 4 %的 酵 母 粉 作 为 氮 源 , 0 . 05 % 的 KHPO和2 4 05 % ,NaCl 0 . 15 % ,p H 7 . 2 ,接种量 8 % ,37 ?发酵0115 %的 NaCl 作为无机盐 ,培养温度 37 ?,培养 96 h . 在此条件在对其进行发酵培养 ,测得其效价基起始 p H 7 . 2 ,用于接种的液体种子种龄 96 h ,液 - 6 为 30610 ×10 g/ mL , 比出发菌株提高 53 % , 高 体种子 接 种 量 8 %. 为 了 确 定 井 冈 霉 素 的 发 酵 周 - 6 12 ( ) 于目前报道的效价 26586 ×10 g/ mL ,为其 期 ,在最佳条件下培养 ,测定其发酵产素曲线 ,如图 工业生产奠定了良好的理论基础. 2 所示 ,发现产素高峰期在 72 h,96 h ,化学效价在 - 6 96 h 时达 30610 ×10 g/ mL . 因此可在此时停止 参考文献 : 发酵. 朱昌雄 , 宋渊 . 我国农用抗生素的现状与发展趋势 1 探讨 J . 农药市场信息 , 2007 , 4 : 17 . 朱昌雄 , 蒋细良. 我国农用抗生素的研究现状及其 2 () 进展 J . 现代化工 , 2004 , 24 10: 1 . 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Metabolic Engineering , 术,但利用传统的理化因子诱变育种的方法 ,因 10 () 2001 , 3 1: 4 . 上 海 市 农 药 研 究 所 农 用 抗 生 素 组 其具有简单 , 快速 , 有效等优点 , 至今仍被广泛使 编 . 井 冈 霉 素 M . 上海 : 上海人民出版社 , 1977 . 用 . 本文对 U V ,D ES 对井冈霉素产生菌菌株的诱 邹坚. 应用原生质体诱变技术筛选井冈霉素高产菌 变效果进行了研究. 发现经过 U V ,D ES 两次诱变 , () 种的研究 J . 现代农药 , 2003 , 2 2: 27 . 11 菌株可以获得较为理想的诱变效果 ,产素能力得到 - 6 较大的提高 ,得到的高产菌株效价为 25874 ×10 12 - 6 () g/ mL ,比出发菌株 效价为 20007 ×10 g/ mL 提 高 29 %. [ 责任编辑 : 白林含 ] 同时在检测其效价时采用了高效液相色谱 ,克 服了以往采用稀释法测定不易掌握 ,误差大 ,测定 所需时间长和比色法不能完全反映出井冈霉素的 11 质量等不足.