三相静态萃取高效液相色谱法鉴别人参、三七及西洋参

三相静态萃取高效液相色谱法鉴别人参、三七及西洋参 三相静态萃取高效液相色谱法鉴别人参、三 七及西洋参 药物研究2007年第l6卷第20期 三相静态萃取高效液相色谱法鉴别人参,三七及西洋参 王晓坤,程秀民,唐辉,于海英 (山东大学药学院,山东济南250012) 摘要:目的建立人参,5--Az和西洋参的高效液相色谱(HPLC)鉴别方法,对其进行鉴 别和质量控制.方法利用一种新的样品处理方法,即 液一液一液三相静态萃取法对药材样品进行预处理,然后对三相萃取物分别以不 同的流动相梯度进行反相高效液相色谱(RP—HPLC)法 测定,记录色谱图和三维图谱.结果3种药材的HPLC图均具有良好的分离度和重 现性,鉴别特征差异显着.结论三相静态萃取能够对 参类药材的复杂成分进行有效的分离.药材各相萃取物的HPLC图均具有良好的 鉴别特征,其中中间相较轻相和重相萃取物的色谱信息 量大,专属性强,因此可以将中间相的特征色谱作为人参,5--Az和西洋参鉴别及质 量指标量化的依据. 关键词:人参;三七;西洋参;三相静态萃取;高效液相色谱法;鉴别 中图分类号:11284.1;11282.5文献标识码:A文章编号:1006—4931(2007)20—0030—02 IdentificationofPanaxGinseng,PanaxNotoginsengandPanaxQuinquefoliumbyStatic Three—PhaseExtractionCoupledwithHPLC WangXiaokun,ChengXiumin,日M,YuHaiying fCollegeofPharmacy,ShandongUniversity,Jnnn,Shandong,China250012J Abstract:ObjectiveToestablishthemethodtoidentifyandcontrolthequalityofPanaxginsen g,PanaxnotoginsengandPanaxquinquefolium. MethodsPretreatingthesampleswiththenewmethodofliquid—liquid—liquidstaticthree—phaseextraction.theextractivesweredetected byRP— HPLCwithagradientprogram.ResultsThesimpleandspecificmethodwithgoodresolution andrepeatabilitywasestablished.The HPLCchromatogramsofsamples,especiallythethree— dimensionalchromatograms,weredistinguishedsignificantly.ConclusionThestatic three—phaseextractionhasadvantagesofpre— treatmentofmedicinalmaterials.Threekindsofextractivesofeverysamplehavecharacterist ic chromatograms.Theintermediatephasecangivemoreinformationthantheothertwophases. So,theHPLCcharacteristicchromatogramsof intermediatephasescanbeusedtoidentifyandcontrolthequalityofPanaxginseng,Panaxnot oginsengandPanaxquinquefolium. Keywords:Panaxginseng;Panaxnotoginseng;Panaxquinquefolium;staticthree— phaseextraction;HPLC;identification 人参,三七和西洋参均为我国名贵中药材,其鉴别方法除了经 典的性状鉴别,显微鉴别外,还有荧光光谱法,红外光谱法1,紫外 光谱法,薄层色谱法I1,高效液相色谱(HPLC)法以及液相色谱一 质谱联用1等.目前HPLC法是最常用的鉴别方法,但常出现基线 漂移较大,峰分布不均,分离度差或分离出的峰数较少等问,难 以达到理想的鉴别效果.笔者认为,造成这些问题的原因与样品制 备方法直接相关,为提高HPLC色谱对参类药材的分离鉴别能力, 故采用了与文献不同的样品处理方法——液一液一液三相静态 萃取技术进行样品预处理,并通过采用不同流动相洗脱梯度对三 相萃取物分别进行测定,获得了满意的色谱效果. 1仪器与试药 美国Agilentl100型高效液相色谱系统,包括G131lA型四元 梯度泵,G1322A型在线脱气系统,G1313A型自动进样器,G1316A 型柱温箱,G1315B型二极管阵列检测器(DAD),Agilent1100型化 学工作站;Agilent8453型紫外光谱仪;雷勃尔LDZ5—2型离心机(北 京雷勃尔台式离心机有限公司);ULTRAsonik一28x型超声振荡器 (美国NEY公司);Molelement18IOV型超纯水机(上海摩勒生物科 技有限公司).乙腈(色谱纯,美国Fisher公司),水(自制超纯水), 其他试剂(分析纯);人参(批号为120917—200406),西洋参(批号 为9303,产地加拿大),三七(批号为120941—200304),均由中国药 品生物制品检定所提供. 2方法与结果 21色谱条件 色谱柱:资生堂ShiseidoMGII—C.8柱(150mm×4.6mm,5m); 流动相:乙腈(A)一0.05mol/L磷酸二氢钾水溶液(B);中间相萃 取物梯度洗脱程序:0,20min,100%B,20,30min,100%B一98% B,30,40min,98%B,40,50min,98%B—95%B,50,70min. 95%B;体积流量:0.6mL/min;检测波长:203nm;柱温:40?;进 ? 30? 样体积:50ILL. 2.2供试品溶液制备 精密称取人参,三七,西洋参粉末各100mg,分别加水振摇后 定容至10mL,超声提取15rain,然后置离心机中(4000r/min)离心 处理5min,取上清液与氯仿,正己烷组成三相(正己烷为轻相,水溶 液为中间相,氯仿为重相)萃取体系,静置萃取24h,进行相分离,将 三相萃取溶液置水浴上蒸干,中间相残渣用2mL蒸馏水溶解,轻相 和重相残渣分别用1mL无水乙醇溶解,分别经0.45m微孔滤膜 过滤,得供试品溶液. 2,3方法学考察 精密度试验:取2.2项下人参中间相供试液,重复进样5次,记 录色谱图.结果各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值无 明显变化,RSD分别为0.9%和1.4%,说明仪器精密度良好. 稳定性试验:取2.2项下人参中间相供试液,分别于0,2,4,8, l6,24h时检测色谱图.结果表明,各主要色谱峰相对保留时间和 相对峰面积比值无明显变化,其RSD分别为1.3%和2.0%,说明 供试液在24h内稳定性良好. 重现性试验:精密称取人参粉末5份,按照2.2项下方法制备供 试液,取中间相供试液分别进样,记录色谱图.结果表明,各主要色 谱峰相对保留时间和相对峰面积比值无明显变化,其RSD分别为 1.8%和2.7%,说明方法重现性良好. 2.4HPLC二维特征色谱图及数据分析 人参,三七和西洋参中间相萃取物的HPLC特征区二维图谱 如图1所示,以色谱图中分离良好,无干扰,较为稳定的9号色谱峰 (保留时间约为l9.14min)作为各自的基准,计算出的各个特征色 谱峰的相对保留时间(tn)和相对峰面积(Area)值见表1.从图1和表 1中可以观察到人参,三七和西洋参的显着差异:如三七无1,14, l6和20号色谱峰,而人参和西洋参均无l5号色谱峰;西洋参的9, 中国药业ChinaPharmaceuticals 2007年第16卷第20期 10,17号峰的信号强度明显大于人参和三七的信号强度;西洋参18 号峰的信号强度与人参的相当,但明显大于三七的信号强度;西洋 参14号峰的信号强度明显小于人参的信号强度等,这些都充分表 明三种药材各具显着的鉴别特征. 砌e,.二 234L5~89.10 一 觇 图1人参,三七,西洋参中间相萃取物特征区色谱图(5,55min,150mAU) 表13种药材中间相萃取物特征峰的相对保留时间和相对峰面积值 2.6HPLC三维特征图谱及数据分析 人参,三七和西洋参中间相萃取物的三维色谱图(20,50min) 如图2所示.以S号色谱峰(保留时间约为3173min)作为各自的基 准计算各色谱峰的相对保留时间,特异色谱峰的峰光谱数据见表2. 图谱中特异色谱峰以字母编号(人参:B,G,I,J,K,三七:A,D,E,H, 西洋参:C,F);两者共有的色谱峰以阿拉伯数字编号,人参与西洋 参共有2,3,5,7号峰,三七与西洋参共有1,4,6,8,9号峰,未找到人 参与三七共有峰;三者共有的色谱峰未编号标出.分析发现,3f't'药 材的特异色谱峰之间不仅保留时间不同,峰光谱形状和数据也完全 不同;两者或三者共有峰的峰强度也存在明显差异. 3讨论 31液一液一液三相静态萃取是针对成分复杂的中药所建立的 样品预处理方法,主要是利用了"相似相溶"和"分子扩散力"原理. 在三相萃取体系中,中药成分按分子极性大小扩散富集于相应极 性的相中.假设三相萃取物互为杂质,那么通过三相萃取.就可以 使每相萃取物都得到精制和纯化.这样,每相萃取物中的成分变得 相对简单,分子极性范围相对变窄,便于建立良好的色谱条件,使 更多成分得到有效分离,色谱图质量提高.因此三相静态萃取不同 于文献中提供的各种样品预处理方法.从图1可以看出,三相静态 萃取HPLC法的色谱图基线平稳,分离度好,峰分布均匀,鉴别特 中国药业ChinaPharmaceuticals 药物研究 字母为特异色谱峰,数字为3种药材中两者共有的色谱峰,S为基准峰 图2人参,三七,西洋参中间相萃取物特征区三维图谱 (2O,5Omin.40mAU) 表23种药材中问相萃取物三维图谱中特异色谱峰峰光谱数据 征清晰. 32试验发现,当检测波长为203lqm时,对在较长波长处有最大 吸收的成分会造成漏检或只检测到较小的信号.为弥补这一不足, 在单波长检测的同时设置采集全波长图谱一三维图谱.从图2可以 看出,3种药材的色谱峰数量和信号强度不同,峰光谱信息不同,这 些都表明三维图谱较二维图谱分辨率高,提供的信息多,能够更加 真实,直观地显示3种同科属植物的共性和各自的特异性. 3.3通过对三相萃取物的色谱分析,发现中间相较轻相和重相萃 取物的色谱图信号多,强度大,分离度好,能够代表并充分显示药材 的鉴别特征和内在质量,因此确定将中间相萃取物的色谱图作为人 参,三七和西洋参的鉴别依据,轻相和重相萃取物则作为杂质弃去. 参考文献: [1]吴建华,罗宗铭,郑建国,等.人参种类鉴别的傅里叶变换红外光谱法[J]. 分析测试,2003,22(3):75—77. [2]张慧燕,李银.西洋参,人参,三七的鉴别[J].中国药品标准,2001,2 (1):55—57. [3]翟为民,袁永生,周玉新,等.人参,西洋生及三七参指纹图谱鉴别[J]. 中国中药杂志,2001,26(7):481—482. [4]李丽,刘春明,吴巍,等.高效液相色谱一电喷雾质谱联用法测定人 参和西洋参的皂苷类成分[J].中国药学杂志,2006,41(5):391—394. (收稿日期:2007—04—09) ? 3l?