黑眶蟾蜍和黑斑蛙消化道5_羟色胺免疫活性细胞的免疫组织化学_cropped

黑眶蟾蜍和黑斑蛙消化道5_羟色胺免疫活性细胞的免疫组织化学_cropped 黑眶蟾蜍和黑斑蛙消化道 52羟色胺免疫 活性细胞的免疫组织化学 ?? ? ? ?张秋金 陈友铃 耿宝荣 王义权 ( )? 福建师范大学生物工程学院 福州 350007 ; ? 厦门大学生命科学学院 厦门 361005 ( ) ( ) 摘要 : 对黑眶蟾蜍 B uf o melanostictus和黑斑蛙 Rana nigromaculata消化道 52羟色胺免疫活性细胞的形 态 、分布进行了免疫组织化学定位 。52羟色胺免疫活性细胞在黑眶蟾蜍和黑斑蛙消化道各段中均有分 布 ,分布密度均呈升2降2升2降的波浪式分布特点 ,二者在幽门部和回肠都有个分布的高峰值 。黑眶蟾蜍 回肠最高 ,空肠 、幽门部次之 ,十二指肠 、直肠最低 ;黑斑蛙幽门部最高 ,回肠 、空肠次之 ,食道 、贲门部 、直肠最低 。52羟色胺免疫活性细胞位于胃的胃腺上皮 、食道及肠的粘膜上皮 ,有圆形 、椭圆形 、梭形 、楔形 等 ,有的有胞突 。文中讨论了 52羟色胺免疫活性细胞分布型的原因及形态与功能的关系 。 关键词 : 黑眶蟾蜍 ;黑斑蛙 ;消化道 ;52羟色胺免疫活性细胞 ;免疫组织化学 () 中图分类号 :Q954 文献标识码 :A 文章编号 :025023263 200504217205 Immunohistochemical Study on 52 Hydroxytrypta mine Immunoreactive Cells in the Alimentary Tract of B uf o mela nostict us and Ra na nigromac ulata ?? ? ? ? ZHANG Qiu2J in CHEN You2Ling GENG Bao2Rong WANG Yi2Quan ( ? Bioengineering College , Fujian Normal University , Fuzhou 350007 ; )?College of Life Science , Xiamen University , Xiamen 361005 , China ( ) Abstract: Using immunohistochemical technique , 52Hydroxytryptamine immunoreactive 52HT2IR cells were observed in the alimentary tract of the toad B uf o melanostictus and the frog Rana nigromaculata . 52HT2IR cells were distributed throughout the alimentary tracts of both species and located in the gastric glands of the stomach regions and in the intestinal or esophageal epithelium with variable frequencies. The density of the cell in B . melanostictus is the highest in the ileum , moderate in the jejunum and stomachus pyloricus , and the lowest in the duodenum and rectum. In R . nigromaculata the density of 52HT2IR cells is the highest in the stomachus pyloricus , moderate in the ileum and jejunum , and the lowest in the esophagus , stomachus cardiacus and rectum. 52HT2IR cells were spherical , elliptoid , coniform or spindle2shaped with long cytoplasmic process reaching to the lumen. The distribution mode of 52 HT2IR cells and the relationship between morphology and function are also discussed. Key words : B uf o melanostictus ; Rana nigromaculata ; Alimentary tract ; 52Hydroxytryptamine immunoreactive cell ; Immunohistochemistry ( )52羟 色 胺 52Hydroxytryptamine , 简 称 52HT 肌收缩和血管扩张的功能 。 是机体内具有神经内分泌功能的神经介质之 一 ,主要分布在中枢神经系统和消化道内 ,对机 () 基金项目 福建省自然科学基金 No . D0320001; 第一作者介绍 张秋金 , 男 , 博士研究生 , 副教授 ; 研究方向 :体完成生理功能具有重要作用 。在消化道内 , 两栖爬行动物学 ; E2mail : qjzhang @fjnu. edu. cn 。 52羟色胺具有调节黏液分泌 、胃肠道蠕动 、帄滑收稿日期 :2004212210 ,修回日期 :2005204227 近些年来 ,随着免疫组织化学技术的发展 , PBS 冲洗 , 除去 PBS , 滴加多聚物增强 孵育后 () 与应用 ,不少学者对多种动物尤其是脊椎动物 液 polymer enhancer孵育 20 min , PBS 冲洗 , 除 1 ,15 的消化道内分泌细胞进行研究,为比较内 去 PBS ,滴加过氧化物酶2羊抗鼠 IgG 多聚物孵 ( 分泌学 提 供 了 丰 富 的 资 料 。黑 眶 蟾 蜍 B uf o育 30 min ,PBS 冲洗 ,DAB 显色 、苏木素复染 、脱 ) ( ) melanostictus和 黑 斑 蛙 Rana nigromaculata 属 水 、透明 、中性树胶封片 。实验设阴性对照 : 用 () () 于两栖纲 Amphibia无尾目 Anura,其消化道 PBS 和正常非免疫小鼠血清分别代替小鼠抗 52 52羟色胺免疫活性细胞的免疫组化研究未见报 HT 单克隆抗体 ,其余步骤一样 。 道 ,本文采用不同的免疫组化染色方法对其分 114 细胞计数与统计 用 Olympus AHB2LB 型 布进行研究和定位 ,可以丰富两栖动物内分泌显微镜观察 、计数 。在 10 ×40 视野下对每个部 学资料 。位的切片随机取 20 个视野 ,计数每个视野 52羟 色胺免疫活性细胞的数量 ,然后求帄均值 ,表示 1 材料与方法 该部位 52羟色胺免疫活性细胞的分布密度 ,并 3 ?3 , 黑 斑 蛙 2 ?2 黑 眶 蟾 蜍 111 材 料 对黑眶蟾蜍和黑斑蛙消化道相同部位的细胞密 ,2004 年 4,5 月采自福州市仓山区 。毁髓处 度均值进行差别显著性检验 。 死 ,迅速解剖 ,按下列消化道各段取材 :食道 、贲 2 结 果 门部 、胃体 、幽门部 、十二指肠 、空肠 、回 肠 、直 肠 。将 消 化 道 各 段 用 生 理 盐 水 漂 洗 , 然 后 用 通过 DAB 显色的阳性 52羟色胺免疫活性 ( 10 %中性福尔马林固定 ,常规石蜡包埋 、切片 7细胞呈褐色 。用 SP 试剂盒染色 ,在肠段尤其是 μ) m。直肠的背景比较深 ,阴性对照也有一些褐色背 TM 112 试剂 即用型小鼠抗 52HT 单克隆抗体 、 ( ) 景着色 图版 ?: 11, 而用 EliVisionPlus 试剂 即用 型 链 霉 菌 亲 生 物 素 蛋 白2过 氧 化 物 酶 盒染色则背景清晰 ,阳性细胞容易辨认 。TM ( ) strepavidin2peroxidase , SP和 EliVisionPlus 免 211 52HT 细胞的分布密度 黑眶蟾蜍和黑斑 ( )疫组化检测试剂盒 、3 , 32二氨基联苯胺 DAB 蛙消化道 52羟色胺免疫活性细胞分布密度见表 及正常非免疫小鼠血清均由福州迈新生物技术1 。52羟色胺免疫活性细胞在黑眶蟾蜍和黑斑 有限公司提供 。蛙消化道各段中均有分布 ,分布密度都呈升2降 113 免疫组织化学染色 按照迈新公司 SP 检 2升2降的波浪式分布特点 , 二者在幽门部和回 TM 测试剂盒和 EliVisionPlus 检测试剂盒说明书 肠都有个分布的高峰值 。黑眶蟾蜍回肠最高 , ( 进行 。石蜡切片脱蜡 、水化 ,用 PBS 0101 molΠL ,空肠 、幽门部次之 ,十二指肠 、直肠最低 ;黑斑蛙 ( ) ) p H 714冲 洗 3 次 , 每 次 3 min , 下 同 。除 去幽门部最高 ,回肠 、空肠次之 ,食道 、贲门部 、直 PBS ,用 3 % HO孵育 10 min ,阻断内源性过氧肠最低 。对黑眶蟾蜍和黑斑蛙消化道相同部位 2 2 52羟色胺免疫活性细胞密度均值进行差别显著 化物酶 ,PBS 冲洗 ,除去 PBS ,10 %正常山羊血清 性检验的结果表明 ,除幽门部 、空肠 、直肠外 ,其 孵育 10 min 。除去血清 ,滴加即用型小鼠抗 52 他各部位二者的 52羟色胺免疫活性细胞密度差 HT 单克隆抗体 ,室温下孵育 60 min 。用 SP 法 ( ) 异极显著 P < 0101。 染色者 ,小鼠抗 52HT 抗体孵育后 , PBS 冲洗 ,除 ( 去 PBS ,滴加生物素标记的二抗 biotin2goat anti 212 52羟色胺免疫活性细胞的形态学特征 ) mouse IgG孵育 10 min 。PBS 冲洗 ,除去 PBS ,滴 黑眶蟾蜍和黑斑蛙消化道相同部位的 52羟色胺 ( 免疫活性细胞形态上没有明显的种的特异性 。 加链霉菌亲生物素蛋白2过氧化物酶 streptavidin2 ) 食道的 52羟色胺免疫活性细胞位于食道粘膜上 peroxidase孵 育 10 min 。PBS 冲 洗 、DAB 显 色 、 () 图版 ?: 6,10。消化道中楔形 形 、楔形 、梭形 腺腺上皮细胞间 ,大多呈圆形 、半月形 、弧形和 长条形 , 细胞一般较小 , 细胞周 边 可 见 分 泌 颗 和梭形的 52羟色胺免疫活性细胞有胞突伸向消 ( ) 化管管腔面 ,梭形的还有伸向固有膜的胞突 。 粒 ,往腺内分泌 图版 ?: 3,5, 肠的 52羟色胺 免疫活性细胞位于粘膜上皮 , 呈 圆 形 、长 椭 圆 ()表 1 黑眶蟾蜍和黑斑蛙消化道 52羟色胺免疫活性细胞分布密度 细胞数Π400 ×视野 Ta ble 1 Distribution and density of 52 HT2IR cells in the alimentary tract of B uf o mela nostict us ()and Ra na nigromaculata cell numbersΠarea of 400 ×scope 贲门部 胃体 幽门部 食道 十二指肠 空肠 回肠 直肠 Stomachus Stomachus Stomachus Esophagus Duodenum Jejunum Ileum Rectum cardiacus corpus pyloricus 黑眶蟾蜍 165 ?2137 5100 ?1112 5180 ?2133 6135 ?5112 2160 ?1127 6150 ?2161 1214 ?5166 3105 ?2116 4B . melanostictus 黑 斑 蛙 2115 ?1109 2120 ?1106 3105 ?1154 8120 ?3164 7100 ?2113 7120 ?5145 7180 ?2186 2160 ?1135 R . nigromaculata P 值 P2Value < 0101 < 0101 < 0101 > 0105 < 0101 > 0105 < 0101 > 0105 囊有暂时贮存并软化食物的功能 ,食物并不急 3 讨 论 于送到胃部 ,可以无需 52HT 的作用 ,而哺乳动 目前国内各试剂公司所提供的抗 52HT 抗 物出现口腔咀嚼及口腔消化 ,食物经过口腔咀 体都是抗人 52HT 抗体 ,用抗人的 52HT 抗体在 嚼 ,容易经过食道 ,也无需 52HT 的作用 。 各种动物组织上都能得到阳性结果 ,说明 52HT 消化道 52羟色胺免疫活性细胞的分布与动 在动物演化史上的保守性 。52羟色胺免疫活性 物的栖息环境及食物类型也有关系 。黑眶蟾蜍 细胞广泛分布于多种动物的消化道中 ,但在不 除了繁殖期间在池塘水域 ,帄时多栖息在离水1 ,15 源较远的旱地 ,而黑斑蛙与大多数蛙类一样生 同动物消化道中的分布情况不尽相同。黑 眶蟾蜍和黑斑蛙 52羟色胺免疫活性细胞分布于 活环境离水源较近 ,黑眶蟾蜍的吞咽必须有较 多的 52HT 因子的作用 ,因而食道到胃体的 52羟整个消化道各段 ,各段的细胞形态没有大的差 异 ,从切片上观察到的有圆形 、椭圆形 、楔形 、梭 色胺免疫活性细胞都比黑斑蛙来得多 ,明显与 形等 。其中梭形的 52羟色胺免疫活性细胞具有食物的通过有关 。 长短不一的胞突 ,伸向消化道管腔面 ,这与其他 虽然黑眶蟾蜍和黑斑蛙消化道不同部位 52 脊椎动物中 52羟色胺免疫活性细胞形态是一致 羟色胺免疫活性细胞密度不同 ,而且最高或最 1 的,具有胞突的梭形细胞属于开放型的细胞 , 低值出现的部位也不同 ,但是二者从前到后都 2 呈现出升2降2升2降的波浪式分布特点 而圆形 、椭圆形的则属于闭合型的细胞,说明,在胃幽 门部有个密度峰值 ,这可能是由于幽门部与十 黑眶蟾蜍和黑斑蛙消化道 52羟色胺免疫活性细 胞有外分泌及内分泌的功能 。 二指肠交接处比较狭窄 ,必须增加该部位的蠕 动才有利于食糜从胃到肠的移动 ,52羟色胺免 52HT 对消化道的蠕动具有很重要的调节 作用 。目前所报道的两栖类和爬行类食道都有 疫活性细胞在十二指肠稍有降低后又升高 ,到 52羟色胺免疫活性细胞分布 , 而鸟类和哺乳类回肠段出现第二个峰值 ,这与回肠是完成消化 1 道功能的主要部位有关 ,二者的 52羟色胺免疫 食道未见有 52羟色胺免疫活性细胞,这正好 体现了 52HT 对消化道的蠕动有重要调节作用 。 活性细胞密度到直肠又降低 。脊椎动物胃肠道 13 中的嗜银细胞主要分泌 52HT,免疫组化显示 两栖爬行类缺乏口腔消化 ,食物是整个咽下 、经 过食道到达胃部 ,在此过程中食道分泌的 52HT的 52羟色胺免疫活性细胞的分布密度 、形态特 起重要作用 。而鸟类食道较长并形成嗉囊 ,嗉征与用改良龙桂开浸银染色法显示的消化道嗜 14 ,277 . 银细胞的结果基本一致。黄徐根 ,吴海龙 , 吴孝兵等. 日本林蛙胃肠道内分泌细 15 7 ] 李淑兰认为黑龙江草蜥回肠 、直肠的 52() 胞的免疫组织化学. 动物学杂志 ,2004 ,39 2:19,25 . HT 细胞可能与动物对水分的保持有某种联系 , Ku S K , Lee H S , Lee J H. An immunohistochemical study of 8 ] endocrine cells in the alimentary tract of the red2bellied frog , 黑眶蟾蜍回肠的 52HT 细胞密度明显较高 ,是否 () Bombina orientalis . J Vet Med Sci ,2000 , 62 6:589,594 . 与其生活环境远离水源更需要保持水份有关 , Sae2kwang Ku , Hyeung2sik Lee , Jae2kee Koh , et al . An 9 ] 有待于进一步研究 。immunohistochemical study on the neuropeptide2producing endocrine cells in the alimentary tract of wrinkled frog , Rana 参 考 文 献 ( ) rugosa Ranidae . General and Comparative Endocrinology , 1 ] 唐晓雯 ,郑一守. 不同脊椎动物消化道内 52羟色胺免疫 2003 ,131 :1,8 . () 染色细胞的分布. 动物学研究 ,1991 ,12 3:293,298 . 张张志强 , 张盛周 , 吴孝兵. 竹叶青蛇消化道内分泌细胞 10 盛周 ,陈冬生 , 张志强等. 无斑肥螈消化道五羟色胺 免() 的免疫组织化学定位. 动物学报 ,2001 ,47 6:666,671 . 2 ] 疫活性细胞的分布与形态学观察. 动物学杂志 ,2001 , 邓泽沛 , 周占祥 , 山田纯三. 北京鸭消化道内分泌细胞 () 36 3:13,16 . () 的免疫组织化学研究. 动物学报 ,1994 ,40 4:383,389 . 11 黄辉洋 , 李少菁 , 王桂忠等. 锯缘青蟹消化系统 52羟色 方之帄 , 孙宝田 , 谢云芳等. 新疆犏牛胃肠胰系统 52羟 ( ) 胺免疫组织化学的研究. 厦门大学学报 自然科学版, 3 ] 色胺免疫 活 性 细 胞 的 免 疫 组 织 化 学 研 究. 解 剖 学 报 , 12 () 2001 ,40 3:789,792 . () 1994 ,25 1:78,81 . 李伟 ,李霖 , 吴孝兵等. 多疣壁虎肠道内分泌细胞的分 El2Salhy M , Grimelius L , Wilander E , et al . Histological () 布与形态学观察. 动物学杂志 ,2001 ,36 1:11,14 . 楚德and immunohistochemical studies of the endocrine cells of the 4 ] 昌 , 邓振旭. 中华蟾蜍 、黑斑蛙冬眠期与非冬眠期 消化13 ( ) gastrointestinal mucosa of the toad B uf o regularis . () 管嗜银细胞的比较. 动物学杂志 ,2004 ,39 1: 21, () Histochemistry ,1981 ,71 1:53,65 . 24 . 14 郑一守 , 唐晓雯 , 朱洪文. 中华大蟾蜍多种组织内 52羟 李淑兰. 黑龙江草蜥消化道 52羟色胺免疫活性内分泌 ( ) 色胺免疫染色细胞的分布. 实验生物学报 ,1990 ,23 3: ( ) 细胞的分布与形态学观察. 动物学杂志 ,2004 ,39 2: 33 5 ] ,37 . 285,287 .15 张盛周 ,吴孝兵 , 陈壁辉. 虎纹蛙消化道两种内分泌细 ( ) 胞的免疫组织化学定位. 解剖学杂志 , 2002 , 25 3: 275 6 ] 图版 说 明 1 ,2 . 黑斑蛙食道 52HT2IR 细胞 ×760 ; 3 . 黑斑蛙贲门部 52HT2IR 细胞 ×760 ; 4 . 黑斑蛙胃体 52HT2IR 细胞 ×760 ; 5 . 黑斑蛙幽门部 52 HT2IR 细胞 ×1 520 ; 6 . 黑眶蟾蜍十二指肠 52HT2IR 细胞 ×760 ; 7 . 黑眶蟾蜍空肠 52HT2IR 细胞 ×1 520 ; 8 . 黑眶蟾蜍回肠 52HT2IR 细 胞 ×760 ; 9 . 黑斑蛙回肠 52HT2IR 细胞 ×760 ; 10 . 黑眶蟾蜍直肠 52HT2IR 细胞 ×760 ; 11 . 黑眶蟾蜍直肠 ,示阴性对照背景着色 × TM 760 ; 其中 1 ,2 ,3 ,6 ,8 ,11 为 SP 法染色 ,4 ,5 ,7 ,9 ,10 为 EliVisionPlus 染色 。 Ep :上皮 ; GG:胃腺 。 Explanation of Plate 1 ,2 . 52HT2IR cells in the esophagus of R . nigromaculata ×760 ; 3 . 52HT2IR cells in the stomachus cardiacus of R . nigromaculata ×760 ; 4 . 52HT2IR cells in the stomachus corpus of R . nigromaculata ×760 ; 5 . 52HT2IR cells in the stomachus pyloricus of R . nigromaculata ×1 520 ; 6 . 52HT2IR cells in the duodenum of B . melanostictus ×760 ; 7 . 52HT2IR cells in the jejunum of B . melanostictus ×1 520 ; 8 . 52HT2IR cells in the ileum of B . melanostictus ×760 ; 9 . 52HT2IR cells in the ileum of R . nigromaculata ×760 ; 10 . 52HT2IR cells in the rectum of B . melanostictus ×760 ; 11 . The background of negative control in the rectum of B . melanostictus ×760 ; 1 ,2 ,3 ,6 ,8 ,11 stained by SP kit and 4 ,5 , TM 7 ,9 ,10 by EliVisionPlus kit . Ep : epithelium ; GG: gastric gland. 图版 ? 张秋金等 :黑眶蟾蜍和黑斑蛙消化道 52羟色胺免疫活性细胞的免疫组织化学 ZHANG Qiu2J in et al . : Immunohistochemical Study on 52Hydroxytryptamine Immunoreactive Cells in the Alimentary Tract of B uf o melanostictus and ? Plate Rana nigromaculata 图版说明见文后