猪肝细胞黄嘌呤氧化还原酶代谢喹赛多的结构和功能研究（可编辑）

猪肝细胞黄嘌呤氧化还原酶代谢喹赛多的结构和功能研究（可编辑） 猪肝细胞黄嘌呤氧化还原酶代谢喹赛多的结构和功能 研究 分类号 密级: 华中农业大学硕士学位 猪胞黄嘌呤氧化还原酶代谢喹赛多的结构和功能研究 研 究 生:陈持纲 指导教师:袁宗辉教授 指导小组:袁宗辉教授 戴梦红副教授 程古月讲师 专业:基础兽医学 研究方向:兽医药理学与毒理学 获得学位名称:农学硕士 获得学位时间:年月 华中农业大学动物医学院 二。一二年六月课名称:猪肝细胞黄嘌呤氧化还原酶代谢喹赛多的结构和 功能研究来源编号:国家重点基础研究发展计划计划, 承担单位:国家兽药残留基准试验室华中农业大学/农业部食品安全评价华 中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 年 月 日 如需保密,解密时间 是否保密 奄 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果,也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料,指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明,并表示了谢意。 帆舢年月缃 研究鳓:产?场,闩 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定,即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本;学校有权保存提交论文的印刷版和电子版, 并提供目录检索和阅览服务,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容,同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注:保密学位论文即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者签名:芦.扬?刁导师签名:雠 签名日期: 签名日期:功?年月?夕日 纠易年吕月‘?孑目 注:请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间??一一~?一猪肝细胞黄嘌呤氧化还原酶代调十喳赛多的结构和功能研究 目 录 目 录.. 摘 要 缩略语表 .立题依据. .国内外研究现状与发展趋势? ..喹赛多国内外研究进展? ..猪黄嘌呤氧化还原酶的研究现状 ..猪黄嘌呤氧化还原酶功能和作用 .科学假设 .研究的意义材料与方法??.. .材料??.. ..药品和试剂 ..仪器和设备 ..溶液配制? .猪肝胞浆与喹赛多孵育 ..猪肝胞浆蛋白制备 ..胞浆代谢体系的建立.. 方法学?. . 基因克隆? ..猪肝脏总提取??. ..电子克隆? .. 克隆载体构建 .猪表达?.华中农业大学届硕士毕业论文 ..表达载体构建??. .. 基因的转座? .. 基因转染..重组蛋白.及 .重组与底物孵育. ..黄嘌呤、喹赛多方法学? ..重组蛋白体外代谢试验?. .猪突变位点确定. ..猪一级结构分析?. ..猪二级结构分析?. ..猪同源建模. ..猪模型对接喹赛多. .突变体构建及表达..突变体构建 ..突变体蛋白的获得及鉴定 .突变体与底物孵育.数据处理 结果.. .猪肝胞浆蛋白代谢喹赛多. 猪基因克隆及活性鉴定.. 及质量检测? ..克隆质粒构建..表达载体构建及鉴定..重组蛋白鉴定??. ..重组活性测定??. .突变体的确定? ..猪肝一级结构特点. ..二级结构特点分析猪肝细胞黄嘌呤氧化还原酶代谢喹赛多的结构和功能 研究 ..猪模型??. ..喹赛多对接猪模型. .突变体功能分析 ..突变体构建及表达鉴定? ..突变体的代谢活性研究? 讨仑?.. .猪黄嘌呤氧化还原酶基因克隆及表达 . 生物信息学分析? . 结构功能特点结论.. 黄嘌呤氧化还原酶在药物代谢中的结构与功能研究文献综述?一 .日,言??. .黄嘌呤氧化还原酶结构 ..哺乳动物黄嘌呤氧化还原酶基因结构? ..哺乳动物黄嘌呤氧化还原酶高级结构? .黄嘌呤氧化还原酶基本功能? ..生理性底物代谢? ..小分子药物代谢? 参考文献??.. 致 谢?.. 作者简介??..猪肝细胞黄嘌呤氧化还原酶代谢喹赛多的结构和功能研究 猪肝细胞黄嘌呤氧化还原酶代谢喹赛多的结构和功能研究 专业: 兽医药理与毒理学 届硕士研究生:陈持纲 指导老师:袁宗辉教授 摘 要 喹赛多是喹嗯啉类抗菌促生长类饲料添加剂。早先上市的喹嗯啉类药物如卡巴氧和 喹乙醇在上世纪中后期曾广泛应用于养殖业的各个环节,但随后的毒理试验证明它们都 具有明显的三致作用,严重威胁动物和人类健康。目前的毒理研究已经表明喹赛多的无 光敏、致畸、生殖和蓄积毒性,在猪和鸡的安全性非常高,可成为新的喹嗯啉类替代药。 目前关于喹赛多代谢酶的研究还很少见,而药物的毒理、药理作用都与其原型药物在机 体内的代谢及残留息息相关,因此加强对喹赛多体内代身.过程中相关酶的研究就显得刻 不容缓了。喹赛多代谢关键酶的研究不仅有助于喹赛多作为一类新兽药的申报,更能指 导喹赛多在食品动物中的合理使用,帮助制定合理的休药期,从而避免了有害残留的出 现,为人类的食品健康保驾护航。 黄嘌呤氧化还原酶是含钼类酶家族的一员,在动物体内各组织中分布广泛, 主要是参与哺乳动物体内次黄嘌呤代身.成黄嘌呤和黄嘌呤氧化代谢为尿酸的生理过程。 主要分布在组织细胞胞浆中,在肝细胞浆中展示了重要的氧化还原活性,是 除 酶之外最重要的药物代谢酶之一。具有很强的还原代谢能力,主要参与了硝基、氮 氧化物和硫氧化物等基团的还原。由于喹赛多位和位的氮氧化物的还原产物都是喹 赛多在动物体内代谢的主要代谢产物,已有的研究证明了喹赛多跟猪胞浆蛋白孵育后会 发现代谢,推测极有可能在喹赛多的脱氧还原代谢中扮演重要角色。 本研究首先用特异性抑制剂确定是喹赛多的代谢酶,然后克隆猪肝细胞 基因,并选择合适的体外表达系统对猪进行重组表达,研究重组的酶学 性质。为了研究催化喹赛多代谢的机理,利用同源建模和分子对接技术确定 代谢喹赛多的关键氨基酸残基,利用定点突变技术,异源表达并鉴定突变体的代谢活性, 展示关键氨基酸残基对其代谢能力的影响,并分析结构与功能的关系。 .猪代谢喹赛多的验证 差速离心法制猪肝细胞胞浆蛋白,与喹赛多进行体外孵育,并用特异性抑制剂 作用,检测代谢产物。 体外代谢试验可以明显的看到猪肝细胞胞浆蛋白代谢喹赛多,特异性抑制剂作华中农业人学届硕十毕业论文 用后可以看到明显的抑制作用,说明猪肝脏胞浆蛋白中的可以代谢喹赛多。 .猪基因的克隆、表达和活性鉴定 用法提取肝细胞总,反转录酶反转录获得,再以为模板, 参照其它哺乳动物同源性较高的序列引物,分两段扩增基因,然后酶切 连接获 载体构建重组质粒,转座到杆粒中,然后转染到杆状 得完整序列。用 病毒中,获得含有编码序列的重组病毒。被杆状病毒感染后表达蛋白。 验证表达结果,蛋白胶灰度确定重组蛋白含量。测定代谢动力学参数 最大初速度、米氏常数和体外清除率。 .酶切结果证明目的基因克隆成功,编码序列测序 表达载体 后上传到核苷酸库中,序列号是.。重组蛋白体外代谢结果表明,重组 蛋白是以活性形式存在于细胞中。重组代谢喹赛多的值是代谢黄嘌呤的. 倍,而只有后者的/,对黄嘌呤的值是喹赛多的近倍。说明相对于喹赛 多,猪对黄嘌呤的结合能力更强,催化效率更高,代谢能力更强。 .猪代谢喹赛多的关键氨基酸的确定 利用分子生物学网站,分析蛋白质二级结构,并根据牛晶体结构为模板进行 同 源建模。将喹赛多作为配体,作为受体进行分子对接,得到喹赛多代谢关键氨 基酸 残基。 二级结构预测结果显示,猪跟牛的二级结构十分接近。结构域预测结果 说明,该酶的功能区域保守性非常高,分别由含铁硫中心的结构域、含 的结构域和含钼辅助因子的结构域三部分组成。同源建模结果可信 . 。 程度很高,对模型评价 是. 为 ., 图结果显示,.%氨基酸都分布在蓝色最适区域,.%氨基酸位于紫色可信区域, .%氨基酸位于可疑区域。将喹赛多与模型对接后找到与喹赛多发生相互作用力的 、、、、、、和八个氨基酸残基。这八个氨基 酸距离喹赛多都不超过,其中、、和与喹赛多形成了氢键结 合,其余四个氨基酸形成了其它非共价键结合。分子对接模拟结果显示,这些氨基酸残 基都与喹赛多催化过程息息相关,能显著改变对喹赛多的代谢能力。 .点突变对代谢喹赛多的影响 构建突变体表达载体,重组表达突变体,并与喹赛多孵育评估突变对酶代谢喹猪肝细胞黄嘌呤氧化还原酶代谢喹赛多的结构和功能研究 赛多能力的影响。 动力学分析结果显示,突变体代谢黄嘌呤时,和能增加 值,、和能降低值,说明这些氨基酸残基与黄嘌呤代谢能 力关系密切。同时,这些位点的突变也改变了酶对底物亲和性和值,能显 著增加,、和对黄嘌呤亲和性明显降低,说明这些位点与 底物结合位点关系密切。突变体代谢喹赛多结果显示,代谢喹赛多的能力不及 代谢黄嘌呤/,和 能增强值,即能增强喹赛多代谢能力,、 、和代谢喹赛多能力下降。底物亲和性明显增强,、 和的值明显增大,说明底物亲和性减弱明显,这些都说明这些氨基 酸残基与喹赛多代谢作用相关。 综上所述,本研究在体外重组表达了喹赛多在猪体内的代谢关键酶.黄嘌呤氧化还原 酶,并对该酶进行了同源建模和分子对接模拟研究,确定了个与喹赛多代谢 相关的氨基酸。通过对这些氨基酸进行定点突变研究,一定程度上揭示了代谢喹赛 多的结构与功能关系及分子催化机制,为喹赛多在猪体内的代谢提供了理论依据。此外, 本研究建立的重组酶体外代谢体系为新药研发提供了一个稳定的代谢系统,也为其它的 新药研发提供了一种科学策略。 关键词:黄嘌呤氧化还原酶;重组表达;同源建模;分子对接华中农业人学届硕十毕业论文 :: , , .,, , .., , . ,, , . . ., . ,.. , . . ? . . , , . ., . ., , . , , , . ,? .. , , . , , . . , . . , .. :.. . .. ,. . . . , .. . . , ? . . ?., . .华中农业大学屑硕毕业论文.% , ,.% .% . ,,,,, ,,, ., ?. , . . ?, ., , , , ,, . , , ,, .., / , . .,, . . ,..? . , ., . . . ,. : ; ; ; 猪肝细胞黄嘌呤氧化还原酶代谢喹赛多的结构和功能研究 缩略语表 缩略语 英文名称 中文名称 氨苄青霉素 过硫酸胺 基本局部比对搜索工具 碱基对卷曲互补脱氧核糖核酸 /体外清除率 一氧化碳” 细胞色素 双蒸水 二乙基二硫代氨基甲酸 酯焦碳酸二乙酯脱氧核糖核酸 脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核苷三磷酸溴化乙锭 乙二胺四乙酸 胎牛血清 黄素单加氧酶 ’ ’ ’昆虫培养液螺旋 .羟基香豆素 ?高效液相色谱 半数抑制浓度 千道尔顿酮康唑米氏常数 细菌培养基 最低检测限 最低定量限信使核糖核酸 质谱 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 磷酸钠 还原型烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸磷酸钠 美国国家生物技术和信 华中农业大学届硕士毕业论文 息中心 硝苯地平 光密度 氧化硝苯地平 盐酸土霉素 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚合酶链式反应 核糖核酸 核糖核苷酸酶 核糖核酸酶抑制剂 保留时、白? 逆转录聚合酶链反应 . 偏差底物结合位点 底物识别位点 ? 一乙酸电泳缓冲液 三氯乙酸 四甲基乙二胺 ,.’. 三羟甲基氨基甲烷 紫外分光光度计最大反应速度 猪肝细胞黄嘌呤氧化还原酶代谢喹赛多的结构和功能研究 前言 .立题依据 黄嘌呤氧化还原酶是一种重要的胞浆蛋白,属于含钼黄素蛋白家族,在代 身外源性药物方面具有重要的意义。介导杂坏和醛类化合物的氧化,以及硝 基、硫氧化 物、氮氧化物等物质的还原 .,。哺乳动物的主要药物消除器官 是肝脏和肾脏,肝脏中主要的药物转化都由微粒体中的酶系负责,而肝脏胞 浆之中 最主要的药物代谢酶是一类含钼代谢酶,其中主要的成员就是黄嘌呤氧化还 原酶 和醛氧化酶,。在体内代谢黄嘌呤的过程中就是其关键代 谢酶,该代谢过程的终产物是尿酸,而代谢副产物活性氧则是导致近年来对 该 酶类研究升温的主要原因。所以无论是对小分子药物的代谢作用,还是其代身过程 所产生的副产物都吸引大量人力物力对其进行深入的研究。 猪是中国最主要的食品动物之一。猪由于体型大小、饮食习惯及遗传背景与人十分 相似而被用来作为药理学、毒理学研究的动物模型,。猪的器官大小 与人相似,而其不存在伦理学方面的问题,所以已经成为了一种重要的器官来源。因而, 对猪的代谢酶进行深入研究也显得意义深远。 喹赛多能显著促进食品动物生长,能使饲料利用率得到显著提高王玉 莲 .,,无生殖、致畸和蓄积毒性方桂杰,;方桂杰 .,;何庆 华 .,。但是,目前喹赛多体内代谢资料却很少,早期有一篇喹赛多在猪体内 代谢成脱二氧喹赛多和.脱氧喹赛多的报道.。喹赛多 在猪、鸡体内代谢动力学研究表明,喹赛多在动物体吸收和消除都很迅速,生物利用度 低,已经检测出的代谢物有脱二氧喹赛多、脱一氧喹赛多和喹嗯啉.一羧酸,喹 赛多的代谢具有明显的种属特异性邱银生.;黄玲利,,在大鼠肝脏微粒 体代谢试验鉴定出了更多种类的代谢产物刘兆颖,,但无具体酶代谢机理的 阐 述,代谢途径也缺少研究报道。 面对目前喹赛多代谢机理并不清楚,猪酶研究几乎空白的情况,本课题准备 不展下列研究: .为了初步研究猪肝脏胞浆蛋白是否能代谢喹赛多。本试验利用差速离心法制备猪 胞浆蛋白,体外孵育代谢鉴定对喹赛多的代谢,用特异性抑制剂奥昔嘌醇和黄芩素 作用,检验是否猪参与喹赛多的代谢过程。 华中农业人学届硕士毕业论文 .进一步研究关键代谢酶对喹赛多的代谢能力和机制,需要构建单一的代谢酶体系。 本试验先电子克隆基因序列然后设计引物克隆、鉴定和构建表达载体。然后 利用杆状病毒表达系统表达重组蛋白,考察重组蛋白对于探针底物黄嘌呤及药物喹赛多 的代谢活性特点,测定代谢动力学参数。 .应用生物信息学知识和技术,分析结构,同源建模,构建蛋白三级结 构,分子对接预测与代谢药物喹赛多相关的关键氨基酸残基。 .利用定点诱变技术,构建的突变体蛋白,比较诱变前后重组蛋白对药物喹 赛多的代谢能力变化。根据代谢能力的变化分析与喹赛多代谢相关的结构与功能之 间的关系。 体外定点突变是目前使用量非常大的生物和医学领域的前沿试验技术,可以用来改 变基因序列,也是目前研究蛋白质结构和功能的最便捷和有力的工具。蛋白质的功能由 蛋白质高级结构决定,蛋白质高级结构的基础是一级结构,研究蛋白质的结构与功能的 关系是目前研究蛋白质的主要方向。对目的基因碱基进行定点缺失、插入和改变就可以 改变相应的蛋白质序列,进而影响到蛋白质的高级构象。 对己知和未知的小分子药物进行生物信息学研究有助于了解药物作用机制、代谢动 力学和毒理作用。生物信息学技术的出现和发展,加速了新药的发现。在药理学研究方 面,生物技术的应用,使我们能从基因的水平认识药物的作用机制,药物作用遗传分布 的多态性。在模拟了生物大分子以后也可以模拟生物大分子与已知的小分子药物之间的 结合,来预测相互作用的活性中心,结合体内体外代谢资料就可以很有效的分析药物代 谢的具体过程和作用机制。对于知道临床用药和新药的开发有着重要的意义。 本实验室研发的一类新兽药喹赛多在代谢及临床实验方面已有比较全面的 数据,但 是负责药物代谢的酶相关研究确不甚清楚。只有将代谢酶也进行深入透彻的研究才能更 清楚的喹赛多代谢过程。 .国内外研究现状与发展趋势 ..喹赛多的国内外研究进展 喹赛多是本试验室正在致力于研究的新型抗菌促生长的动物专用药物,属于喹嗯啉 类化学合成药物具有喹嗯啉.,.二氧化物的基本结构。世纪中后叶广泛使用的喹 嗯啉药物如:卡巴氧和喹乙醇大量应用与动物养殖的各个产业,但后期的毒理试验证明 .,、致癌、致突变等严重毒负作用,不但威 了它们有明显的致畸猪肝细胞黄嘌呤氧化还原酶代谢喹赛多的结构和功能研究 胁了用药动物的健康,更是直接关系到了人类的健康。所以,欧盟于年明令禁止卡 巴氧和喹乙醇的使用,经过大量毒理研究后我国确定喹乙醇也仅能用 以下猪的抗 菌用药。但喹嗯啉类药物的显著抗菌和促生长作用还是有很大市场潜力,因此,国内外 许多研究结构都致力于研究新型的喹嗯啉类替代药物,以填补需求的空缺。 新型的喹嗯 啉类药物喹赛多是华中农业大学国家兽药残留基准试验室研发和合成的抗菌促生长类饲 料添加剂,已经在药理、毒理等研究结果表明哇赛多无光敏方桂杰,、致畸 , ;,和蓄积毒性 、生殖, ,,极有可能成为喹嗯啉类新型替代药物而大量应用在食品动物鸡和猪 的饲养中。 在药物研究中的一个显著难题就是明显的种差异,不同的物种的药物代谢酶的作用 个功能可能存在着难以预测差异,直接导致同种药物在不同的生物种类具有明显差异的 活性和作用。在人类药物研究开发时,猪由于体型、饮食习性和基因同源性上与人类比 ..; 较接近,被广泛应用作为药理、毒理学研究的非啮齿类哺乳动物模型 . 。所以,为了更好给人类健康服务,我们有必要对猪体内酶类研究投 入更多精力。在中国,猪是主要的食品动物种类,而关于猪体内酶类的研究还几乎 处于空白的状态,数据库中没有相对应的编码序列信息,但是其它国外食品动物种 类牛、羊、鸡,包括试验动物大鼠、小鼠、兔和豚鼠都有大量的关于酶的研 究,这 就说明了酶研究的重要意义,显示本文研究的重要性。 喹嗯啉类药物主要应用于食品动物的养殖业,也导致了它肩负了重大的责任,虽然 已经进行了传统的毒理学研究,喹嗯啉的安全问题依然是食品安全问题关注的重点,必 须有全面透彻的研究来证明。药物对生物体的作用跟它在生物体内的生物转化息息相关, 代谢产物也可能是其发挥药理毒理作用的重要原因。代谢酶就是这中问关键的催化剂, 它的存在使药物在生物体内的快速转化和代谢成为可能。确定药物在体内的代谢过程就 是确定生物体内代谢酶对药物的作用过程,是确定发挥作用的关键步骤,是药物研发的 不能缺失一部分。只有确定了药物在体内的转化过程才能合理的指导药物使用,科学的 对药物进行评价。 目自仃对喹赛多的代谢研究大多还只停留在代谢物的鉴定层面上,对催化其生物转化 的代谢酶知之甚少。利用体内体外代谢试验,分离鉴定喹赛多的各种代谢产物,但对于 这些代谢产物是如果形成的,喹赛多为什么会有这些转化却不甚清楚。知其 然,不知其华中农业人学届硕十毕业论文 所以然,这就大大的限制了我们对于一种药物全面了解。 ..猪黄嘌呤氧化还原酶的研究现状 哺乳动物中,是除酶系以为最重要的药物代谢酶之一。组织分布广泛, 主要分布于动物的肝脏和小肠。在动物体内主要生理作用是代谢次黄嘌呤和黄嘌呤生成 尿酸和活性氧。目前关于该酶的主要研究集中在人类关于缺血.再灌注损伤以及 .,。 代谢过程产生的导致癌症的显著增高有关 酶分子由两个左右的相同亚基组成,两个亚单位上各含有一个活性中心,每 个亚基都含有四个活性辅基:一个钼辅助因子、一个黄素核苷酸辅基和 / 个铁硫中心/中心。电子从供体/ 传递。是由 黄嘌呤氧化酶 ,; ...和黄嘌呤脱氢酶 ,;...两种不同存在形式的统称。人们已得到人、大鼠、 小鼠、牛和猫等哺乳动物的氨基酸序列,除鸡含有个氨基酸以为的该酶 由.个氨基酸组成。各种动物的氨基酸序列在哺乳动物之’白有高度同源性, 可达%,哺乳动物与鸡之间也有%的同源性,而与常用试验动物果蝇之间的同源性 只有%。将大鼠肝脏用胰蛋白酶分解,可将从端到端水解成含有 个/中心的 片段、含有辅助因子的 片段和含有钼辅基的 片 .,。 段 牛晶体结构的得到使我们对的结构有了更进一步的了解 .,;.,,对该酶的催 化机理有了更清晰的认识。当分子氧作为电子受体的 时候,催化过程会产生活性氧,尽管当作为受体的时候也可能产生活性氧,但 是 以形式存在时是导致活性氧产生的主要原因。体内的两种形式之间是可 .,。的两种不同形式具有不同的电子受体, 以转化的 一般以作为电子受体;而则是以分子氧作为电子受体,只有提供电子时 几乎不具有代谢活性。到的转变可以由半胱氨酸的巯基氧化转化为二硫键而 形., 成,也可以是被胰蛋白酶不可逆的裂解形成 .,; 。以上两种转化方式都会导致酶分子中结构域构象的改变,从而导致与 结合部位失去活性而转换酶的形式。 、 活性在细菌 ., 、真菌, 植物 .,和动物 .,;,;猪月十细胞黄嘌呤氧化还原酶代谢喹赛多的结构利功能研究 .,中都有发现。并且在动物体内组织分布广泛,各个组织器官都有检测到, 其中以代勇活跃的肝和小肠中活性为最高,。对于人类,各个. 组织器官中活性都很低下 .,;,; ; ..;.;,。 的分布不但有明显的种属特异性,也有明显的组织特异性,在狗和小鼠体内,心肌中 活性很高,。亚细胞结构定位结果显示,各种动物中都存在且只存在与细胞浆中 .,,尽管也有过不 ..;..; .,认为是整个肝脏细胞中都有分布。 同意见】 ..猪黄嘌呤氧化还原酶功能和作用 目前关于的研究主要文献集中于在代谢黄嘌呤、次黄嘌呤产生尿酸过程 中生成的自由基对机体的损伤及相关致病机理研究。同样,对于药物的相代谢同 样有不容忽视的作用,对于很多小分子药物和外源性化合物的氧化和还原是导致其代谢 的主要酶。 具有广泛的底物特异性,可以氧化许多具有醛基和杂环的化合物,还原硝基、 氮氧化物和硫氧化物等基团,而大部分小分子药物和外源性的小分子物质都具有这些基 .,的氧化作用,抗肿瘤药物乐疾宁一羟基嘌 团。例如,对咖啡因呤的体内代谢消除 .,,对硝基苯甲酸,一硝 .,; 基芘,一硝基喹嗯啉氮氧化物和呋喃西林还原作用,;,; .,。近年来,更多的人将目光投向了酶系以外的药物代谢酶类, 但是,的许多性质还是未知的,特别是猪体内的酶,更是几乎没有研究报道,这早 还有大量的空白需要我们来填满。因此,这里研究猪与药物的相互作用对于,指导 动物的临床用药和新药物的开发都十分的必要。 近年来关于的报道主要集中在,代谢过程产生的副产物:活性氧,带来的副作 用上面,研究证明,活性氧的产生会导致一系列关系人类生死的重大疾病 .,.,。故,对代谢作用机制的研究不但可 ; .,; 以指导机体与药物之、日互作用,还有利于多种重大疾病的预防和治疗。提取猪肝脏细 胞,利用克隆基因,进行异源表达来进行研究。目前,关于动物 体外表达的研究资料并不是很丰富,主要是同本克隆大鼠基因利用杆状病毒表达系 统进行表达研究。另外用原核系统进行表达的重组蛋白都几乎没有活性,考虑到哺乳动华中农业大学届硕毕业论文 物表达后修饰对酶活性的重要性,这里准备构建昆虫表达载体转染到杆状病毒中进行表 达研究,希望能获得具有生理活性的重组蛋白,可用于对药物的代谢研究。 猪在猪的外源物质代谢过程中起着至关重要的作用。但是目前还很少有关于 猪 代谢文献报道,没有体外重组表达研究报道,只有少量作为辅助性的报道。在这种 情况下,我们几乎不知道该酶的代身.特点,唯一可以作为参考的是其它物种的高度同源 性酶的文献报道。在中国,猪是最重要的食品动物种类之一,加上目前中国食品动物用 药安全还有明显不科学性,而又是出酶以为最重要的外源性物质代谢酶之一, 对其进行透彻的研究就显得刻不容缓了。 .科学假设 本研究基于前人研究基础,查阅文献后假设胞浆中药物代谢酶可以代谢本试验 室研究的喹嗯啉类抗菌促生长药物喹赛多。为证实这个假设,设计了提取猪肝脏胞浆蛋 白,进行体外代谢研究,用特异性抑制剂进行代谢研究确定对喹赛多的代谢 作用。然后根据核苷酸数据库中其它物种已有报道进行电子克隆猪基因序列。 根据电子克隆基因序列设计引物,以猪肝脏反转录为模板克隆基 因序列。 定点突变作为一种方便而有效的研究蛋白结构与功能的方法,在酶的关键氨基 酸研究早有先例。 在大肠杆菌中表达的定点突变研究 .,,以及同本克隆的大鼠在昆虫杆状病毒系统中的研究铁硫中心相关氨.,和酶两种形式的转换机制研 基酸残基 .,; 究 .,。 为了进一步研究对喹赛多代谢的作用,本研究准备在体外重组表达活性酶蛋 白。鉴于目前没有关于猪异源表达的研究,参考大鼠,人和小鼠等哺乳动物表达系 统选择,考虑的实际操作的可行性,决定使用昆虫杆状病毒表达系统进行表达。蛋白质 高级结构决定其活性特点,本研究中应用分子信息生物学手段构建了猪蛋白的高级 结构模型并与小分子药物进行对接,分析与活性作用有关的氨基酸残基。假设突变关键 的氨基酸残基必定导致代谢能力的明显改变,然后代谢试验证明突变后的代谢特点,进 而分析猪与喹赛多代谢的关系,以及猪结构与功能的关系。 .研究的意义 本课题研究为了证明猪对抗菌促生长药物喹赛多的代谢作用,为喹赛多的研发猪肝细胞黄嘌呤氧化还原酶代谢喹赛多的结构和功能研究 提供数据支持,方便后期的代谢研究。将首次克隆猪基因编码序列,构建了猪 的体外重组表达系统,可以用于酶生产和研究使用,大量表达以后就可以进行高级 结构分析研究,具有十分重要的意义。首次对猪进行结构与功能方面探索。 是一种重要的外源物质代谢酶,清楚其结构对于了解它代谢机制和代谢能力有重要帮助 也有助于外源性药物研发和合理使用。猪是中国目前最重要的食品动物之一,具有跟人 类十分相似的体重和代谢状况,常被用来作为人的模型进行研究,对猪肝脏酶的研 究使我们对猪有了更全面的了解,从长远的角度来看具有重要的意义。 分子信息生物学方法的应用也对以后研究有重要意义,利用软件准确模拟现实中难 以实现的过程,可以节约大量的时间和金钱,在耗费少量资源的情况下获得大量的有用 信息,是以后科学研究的有力武器。在本研究中首先应用分子克隆的方法来指导克隆了 真讵的编码蛋白质基因序列,然后利用软件模拟同源建模获得高级结构,最 后将小分子药物与大分子蛋白质进行对接模拟药物与大分子蛋白的相互作用。在药物分 子产生药效过程中,药物分子与大分子蛋白相互结合,两者在必要的位置相互契合,继 而调整构象,得到稳定的复合物构象。所以,分子对接方法对于新药的研发具 有十分重 要的意义。华中农业大学届硕毕业论文 材料与方法 .材料 ..药品和试剂 试剂:货号,批号 , :批号??,生物生产,杰瑞生物分装 ? .货号,批号,:货号.,批号, :货号,批号, :货号,批号, :货号,批号,:生产,货号:,批号: ,:生产,货号:,批号: ,:货号,批号, .:货号,批号, :上海生工生物工程技术服务有限公司合成 寡聚核苷酸 :货号.,批号,天根生化科技有限公司 琼脂糖:货号,批号?,英国公司 胰蛋白胨:货号,英国公司 酵母抽提物:货号,英国公司 氨苄青霉素:批号/ ,分装 琼脂粉:批号/,分装 :含量%,批号,分装 ?:含量%,批号,分装 碱:含量.%,批号,分装 溴化乙锭:批号,分装 溴酚蓝:批号,分装 二甲苯青:批号 ,分装 质粒抽提试剂盒:货号.,批号,博大泰克 ,博大泰克 片段回收试剂盒:货号.,批号 猪肝细胞黄嘌呤氧化还原酶代谢喹赛多的结构和功能研究 冰乙酸:货号,批号,上海申博化工有限公司 浓盐酸:批号 ,国药集团化学试剂有限公司 :货号,批号,国药集团化学试剂有限公司 :货号,批号,国药集团化学试剂有限公司 :货号,批号 ,国药集团化学试剂有限公司 :货号,批号,国药集团化学试剂有限公司 葡萄糖:货号,批号,国药集团化学试剂有限公司 异丙醇:货号,批号,国药集团化学试剂有限公司 乙醇:货号,批号,国药集团化学试剂有限公司 甘油:批号..,上海化学试剂有限公司 氯仿:批号. 一,上海化学试剂有限公司 ..仪器和设备 核酸/蛋白浓度分析仪: , 分析天平.:.型,湖南仪器仪表总厂天平厂 电热恒温水浴锅:型,金坛市佳美仪器厂 超净工作台:..型,苏州安泰空气技术有限公司 制冰机:型, 高压湿热灭菌锅:?一型,上海博迅实业有限公司 全自动高压灭菌器:一型, .?冰箱:型, 自动双重纯水蒸馏器:.型,上海亚荣生化仪器厂 冷冻台式高速离心机:型, 梯度仪:.型,. 漩涡振荡仪器:一型,北京六一仪器厂 微型离心机:公司 恒温摇床: 型,上海福玛试验设备有限公司 电泳仪:一型,北京六一仪器厂 水平电泳槽:.型,北京六一仪器厂 凝胶成像系统:型, 华中农业大学届硕十毕业论文 电热培养箱:.型,上海浦东荣丰科学仪器有限公司 超纯水仪:美国. ..溶液配制 ./ .%甘油混合溶液:称取分析纯固体.,充分溶解于 去离子水中,加入 甘油液体,充分搅拌,液体经?高温高压灭菌 后,自然冷却,?保存备用。 水:滴加液体. 于去离子水中,充分震荡后,再于磁力搅拌 用品的灭活。 器室温搅拌小时,此溶液用于所有 处理水:水于?高温高压,。保存备用。 %乙醇处理水溶液:用 量筒量取处理水于 无水乙醇中,混匀,.。保存备用。 电泳缓冲液×的配制:称取碱, .,置于烧杯中,加入 去离子水约,充分搅拌溶解,.醋酸.,充分搅拌,加去离子水定容到 。 ,室温保存,使用时稀释成 /氨苄青霉素的配制:称取氨苄青霉素,置于烧杯,加入灭菌水 约,充分混合使其溶解,最后定容到,并用.过滤膜过滤除菌,小份 分装,.?保存。 溶解于终体积为的去离子水中, 母液/的配制:. 过..滤膜,以除菌,储备液/管分装,.。贮存备用。 二 溴一氯一一吲哚一一一糖苷溶于 ?/母液配制: 甲基甲酰胺。用铝箔封裹并贮存在。。 ,加入约 液体培养基配制:称取胰蛋冻,酵母抽提物, 去离子水,充分搅拌溶解, 调整溶液值到.,补充去离子水到,。 高温高压灭菌 后,。保存备用。 ,琼脂粉 .//氨苄/平板制备:称取蛋白胨,酵母抽提物, 调整溶液值至.,补充去 ,加入约去离子水,充分搅拌溶解, 离子水至, 。高温高压灭菌,待培养基降到。左右时,补充氨苄青霉素 ,充分混匀,铺制平板,待固定后,。避光 ,. /, 保存。猪肝细胞黄嘌呤氧化还原酶代谢喹赛多的结构和功能研究 .猪肝胞浆与喹赛多孵育 ..猪肝胞浆蛋白制备 试验动物:同龄,雄性去势长白、大约克三元杂交猪头,体重 ,购自华中 农业大学试验猪厂,饲养管理按试验动物饲养标准进行。 差速离。法制胞浆蛋白:颈静脉放血处死后,立即剖开腹腔,暴露肝脏和前后腔静 脉。将前腔静脉结扎,并用注射器从结扎处沿肝脏方向灌注冰冷的生理盐水,剪断后腔 静脉,充分冲洗肝脏残留血液后,剥离肝被膜。将肝脏剪成约的组织块,用锡箔纸 包裹后立即放入液氮中,待充分冷冻后转入一?冰箱保存备用。差速离心法制备肝微粒 体。取出少部分冷冻的肝脏,称重,用?缓冲液,.反复冲洗除掉 、. 组织中的血液成份。按:/加入.匀浆缓冲溶液含 蔗糖,用玻璃匀浆器制成肝匀浆。将制备好的肝匀浆在超速冷冻离心机上离心 ,取上清液,离一,保留上清液,分装,放入.。冰箱中储 存备用。以上所有操作均在冰浴中进行。 ..胞浆代谢体系的建立 在.缓冲液中开始反应。 猪肝胞浆蛋白终浓度为/和预反应后加入喹赛多终体积 ,?维持后,加 冰甲 供分析。 醛终止反应。混匀,离心取上清 .. 方法学 仪器配置: 高效液相色谱系统配备 检测器;分析柱: . .,。 。 喹赛多相色谱方法:检测波长,柱温。,流速为/,进样量 流动相为乙睛和.%甲酸水:,%;,%:,%; .,%:,%。 . 基因克隆 ..猪肝脏总提取 样品采集:同龄,雄性去势长×大约克三元杂交猪头,体重~,购 自华中农业人学试验猪厂,饲喂基础日粮,按试验动物饲养标准进行同常管理。动物颈 动脉放血处死后,打开腹腔,去除组织表面的被膜,用预冷的水冲洗血液,立即 切取肝实质组织左右颗粒若干。迅速将采集的样品置于做好标记的管,并立即华中农业人学届硕士毕业论文 投入液氮以使其速冻。随后转入.。冰箱备用。采样过程中所有金属用品均须以锡箔纸 包裹后,于?高温烘烤小时以上,冰上预冷。所有塑料制品均须浸泡水 小时,牛皮纸包裹,?烘干。 总提取:镊子、研钵等用品于。高温处理小时后?预冷,备用。., 离心管、头等塑料用品以水浸泡小时后,?高温灭菌,烘干 备用。倒入少量液氮于研钵,使其预冷,至液氮不再明显挥发,于一?冰箱中 取出冻存 的样品,立即投入到预冷的研钵中,用力锤击,使组织块破碎,并研磨组织碎 块,使其 变成粉木,期间不断加入液氮数次使样品保持脆性,保证不会降解。取支 处理过的离心管,加入预冷的试剂,并放置于天平,调整到零刻度。将 研磨好的组织粉末快速加入到装有试剂的离心管,使组织样品的质量为。 立即用力震荡分钟,所有组织粉末应立即充分与试剂接触。混合物于室温放 置 离心管中, ,离心;将组织上清液转入到新的.的. /管;每管中加入氯仿,剧烈振荡,室温静置,样品于。 离心;小心将上清液转至另一.的.离心管中;每管中加入. 异丙醇,混匀,室温静置,,。离心;弃去上清,此时可见试管 底部有白色块状沉淀,加入%/醇洗涤沉淀,,。,离心;用% 乙醇重复洗涤沉淀一次,,。再次离心:吸去上清,并尽量吸尽残存液 . 体,超净工作台干燥 ; 完全溶解沉淀。 进行%琼脂糖凝胶电泳分析,根据和 总完整性检测:取? 条带亮度,确定总的完整性。 处理: 在.的.离心管中配制下列反应液: 反应物 添加量“ . /? /“ 总 “ 处理水 .? 混合液于。反应;在反应物中补充“的处理水,加入 等量的苯酚/氯仿/异戊醇::,充分混匀;离心,取上层水 猪肝细胞黄嘌呤氧化还原酶代谢喹赛多的结构和功能研究 层移至另一微量离心管中;加入 等量的氯仿/异戊醇:;再次混匀, 离心,取上层水层移至另一微量离心管中;加入 .倍量 的冷无水乙醇,.?放置~ ;离心回收沉淀,用%的冷乙醇清洗沉淀, 沉淀于超净台干燥,的处理水溶解。取.作为模板,进行内参 基因的内含子序列扩增,以检验基因组去除是否完全。内含子区域扩增引物 : 序列:: 。 反应体系如下: 总 各 .? 上游引物 .“ 什 补充灭菌去离子水 反应程序:。 ,。 ,。 。 ;。 ,个循环:。 取. 反应产物进行%琼脂糖凝胶电泳分析,结果显示无特异条带扩增的总 样品判定为无基因组污染,可用于目的基因定量分析。 核酸 浓度测定:取电泳显示合格的总样品,于 蛋白分析仪测量总浓度;剩余样品于一保存。 ..电子克隆 将待研究的酶基因名字提交到网站://..../的核 苷酸数据库中进行搜索,筛选同源性很高的基因序列,然后用序列比对软件 将所得的牛、大鼠、小鼠、猫、鸡 序列进行比对拼接成重 叠群。然后再用软件进行拼接,得到同源性较高的基因序列。 .. 克隆载体构建 单链的合成:用处理水将合格的总样品稀释至./的终浓度, 并以其作为模板,进行第一链的合成。合成反应液添加如下: 总 补充 水 华中农业人学届硕十毕业论文 充分混合混合物,于。保温后,立即于冰上骤冷。离心数秒,使样品集中 于管底。再在上述反应管中添加下列反转录反应液: ?~引物混合物 ?各 ? / .. 。/ 补充 水 ? 涡旋混匀混合物,于。保温,再于。保温,然后将样品于冰上冷却 。得到的溶液于一。保存或者立即使用。 样品均一性检验:以样品为模板,进行基因片段的扩增,通过检测样 品内参的量来初步判定各组样品是否均一,以消除反转录效率的影响。内参 基因反 应体系如下: ×扩增缓冲液 第一链 “ . 各 上游引物 .? 丁砌 补充灭菌去离子水 “ ,。 ,循环 反应混合物经。预变性,再?,。 次后,?保持。反应产物于%琼脂糖凝胶电泳分析,产物条带亮度较其它 差异较大的样品应作适当稀释或者放弃。 目的基因引物设计:因为目前没有猪种基因序列的资料,所以选取同 源性较高的其它哺乳动物人、牛、大鼠、小鼠、羊和鸡的基因序列选取比较 保守的 序列设计引物。引物尽量满足下列条件:为保证特异性,引物应位于公印序 列的编码区两端区域内,不形成二聚体自由能小于./,引物含量在 ?。 %~%,引物内部和引物间不能有个以上连续互补结构,引物值在。猪肝细胞黄 嘌呤氧化还原酶代谢喹赛多的结构和功能研究 以搜索的文库、及文库,确保无假基因、临近家族成员 基因序列与引物配对。按照上述标准使用设计的引物见 表?: 表.用于黄嘌呤氧化还原酶克隆的引物序列 ?目的基因片段扩增:以肝作为模板,进行基因片段的扩增,反应 液配制如下: ×扩增缓冲液 ?. 各 .? 弓物 .“ . 补充灭菌去离子水 将反应混合物轻微震荡,于.梯度热循环仪进行扩增,设置程序为: ?后,。 ,表?中列出的相应温度退火,?延伸并循环次, 最后?延伸。各反产物分别进行%琼脂糖凝胶电泳分析,检测反应是否 有目的条带产生。 目的基因条带回收与纯化:产物成像分析后,将凝胶置于紫外切胶仪,切取相 应目的基因产物的凝胶条带,分别置于已称重的.的管,再次称重后,加 入倍于凝胶体积的融胶缓冲液,按照博大泰克公司的琼脂糖凝胶纯化试剂盒 操作指南 回收纯化目的基因片段,具体操作步骤为:于装有凝胶的中,加入倍于凝胶华 中农业人学届硕十毕业论文 体积的融胶缓冲液。将再将管置于。烘箱,每取出一次,剧烈 涡旋,以促进凝胶融化,将混合物加入到吸附小柱,离心,加% 乙醇溶液.到吸附小柱,放置,离心,%乙醇再次洗涤小柱 一次。最后离心,以充分去除残余的乙醇。每个回收小柱中加入预 热的 ,室温放置,离心,同时以新的管 收集洗脱。洗脱液中既含有高纯度目的基因片段。 感受态大肠杆菌的制备: 试验中所需的所有试管、培养瓶、离心管等均要 用去离子水彻底清洗干净,高温高压灭菌;从非选择性平板上挑取.单菌落, 接 种于 液体培养基中,。振荡培养过夜至对数生长中后期。将该菌悬液以: 的比例接种于~ 液体培养基中,。振荡培养.小时至.;将培养 ; 液冰浴 ,无菌转移培养物到一预冷的聚丙烯离心管,。 离心 :沉淀加入预冷的./ 用预冷的去离子水洗涤沉淀, 离心 ;沉淀加入预冷的./ 溶液,轻吹散,冰浴 ,?离心 .%甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞悬液。分装成~的小份, 贮存于.?备用。 目的基因的转化:从.。冰箱中取出感受态细胞,冰上解冻,将全量连接产 物或者质粒分别加入到感受态细胞中,轻微涡旋后,于冰上放置,。恒温水浴 培养液,。震荡培养箱 热激,立即冰上冷却,于超净台中加入 新鲜培养液重悬细菌,并 复苏,室温离心,弃上清, 平板,?倒置培养小时。 全部涂布/./ 目的基因克隆:回收的产物即可用于目的基因的克隆。克隆反应液添加如下: 回收产物 ? 补充灭菌去离子水“ 【感受念细 反应混合物于热循环仪?保温,每个全量反应物分别转化 胞,转化平板于。倒置培养小时,取单个克隆用于鉴定。阳性重组质粒命名为 ?。 ?和 平板上的白 阳性克隆的鉴定:无菌头挑取/?/猪肝细胞黄嘌呤氧化还原酶代谢喹赛多的结构和功能研究 色菌落于含有/氨苄青霉素的的液体中。,震荡培养小 时。每个基因取个单菌落液体培养物“作为模板,进行菌液,反应条件同上所 述。产物进行%琼脂糖凝胶电泳分析,可见到相应目的条带的菌为疑似阳性菌。 阳性克隆质粒抽提:出现阳性扩增的样品进行质粒抽提。取无菌细菌瓶,于超净台 中加入灭菌过的液体培养液,加入氨苄青霉素,使其终浓度为/,耿阳性 菌液,加入到该细菌瓶中,封口后于。震荡摇床震荡培养小时。离心收 集菌体,采用博大泰克质粒小量提取试剂盒,具体操作为:将.~过夜培养的细菌 ,并弃去上清液;多 菌液加入.离心管中;于~离一 ,重悬细菌体沉淀,确保重悬液 次操作,以收集全部菌体。加 ,轻柔颠倒~次。不要剧烈振动,以防止基 中无细菌团块:加细胞 因组被剪切,室温放置最多 ,立即轻柔颠倒离 ;加 心管一次。溶液应该出现絮状物;于离心 ;将离心后得到的上清液转 移至 ,并弃去 内,加入?的 ,混匀,于离心 接液管内液体;向 内力含%乙醇的 ,于离心 一秒,并弃去接液管内液体;重复第加入 ,离一~秒; 倒掉废液管中的液体,各 再次于离心 ,以完全去除 、 中的残余乙醇;各 转移到无菌的.离心管中,并 去离子水或溶液,并于室温静置 , ;最后将于 再次离心 .离心管内溶液即为质粒,可立即使用或者于.?保存。 阳性质粒酶切鉴定: 首先利用.软件,对各个基因克隆片段进行酶切位点分 析,确定各个基因片段中不存在的限制酶切割位点。利用该这些酶对目的基 因进行双酶 切分析,以确定克隆序列『确。每个反应混合物于。反应时。取进行%琼脂糖 凝胶电泳,凝胶成像系统分析,酶切产生了相应目的条带大小的片段判定为 阳性克隆。 .猪表达 ..表达载体构建 如图.所示将构建成功的克隆载体.和.用/和 /双酶切后回收,然后连接片段片段及.,构建好完整的 .?。 基因序列的克隆载体华中农业人学届硕十毕业论文一;一 一 \一。 .\构建策略 图.克隆载体? ? 结构图谱,在启动子后面带有标签可用于纯化 图为表达载体 和 分析用。 . ‘? ? 十’ ,“? 图 质粒结构示意图 . 质粒酶切位点序列结构如下: 掣 广??? 四羔 ??飞对两丽藏晤而两面?广?????????厂??厂???厂??厂 .『 ; 生?攀一。马?生?生?生』生一丁 . 不竹 骂嚣拦二吕吕器篙’。 。 堕 鲫邓原始质 基因的插入位点。取 选用,和印胛 ,酶 质粒。以 粒 ,转化感受念细胞,以扩增大量的 猪肝细胞黄嘌呤氧化还原酶代谢喹赛多的结构和功能研究 切产物进行%电泳分析,产生约大小的片段鉴定为阳性质粒。? 质粒分别进行 同步双酶切。酶切体系如下: 质粒和原始 质粒 “ 去离子水, , ,和 酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳,分别于紫外灯下回收大约 大小的条带。根据凝胶纯化试剂盒操作,纯化回收各目的条带。取 纯化产物电泳确证回收成功。配制连接反应液如下: 酶切回收片段 目的基因酶切回收片段 ד均匀混合后,连接体系于。孵育小时,。过夜。全量 连接产物按.. 的方法转化大肠杆菌感受态细胞。小时候,挑取单个菌落进行鉴定,并扩 .。 大培养单菌落,抽提质粒,双酶切鉴定阳性的菌落。阳性质粒命名为 .. 基因的转座 大肠杆菌感受态的制备:在抗性含有 /和 ./ 平板上划线,。培养过夜;挑取单菌落,接种至抗性,,。培养至 约.;转接至抗性中,,。培养至约.;冰浴 ;倒入预冷的离心管中,。约离心;弃上清,加入预冷的约 的.的,悬浮后,。约离心加入约,预冷的约的 .的,悬浮后,冰上放,。约离心加入约的预冷的 .的,悬浮后,加入甘油,分装保存。 .质粒 重组粘粒的制备与鉴定:取 ,加入到 的大肠 杆菌感受态细胞中,轻微涡旋,冰浴后,?热激后立即置于冰上 ,加入 ,。,震荡复苏小时。取分别取,和 均匀涂布含有/卡那霉素、/庆大霉素、/四环素、/ . 华中农业人学届硕毕业论文 的平板。。培养天。挑取三抗平板上白色菌落划线选择性 和/ 平板,再次确认菌落为白色。挑取白色单菌落,于含有三抗的 液体培养基中, ,。震荡培养小时左右。取新鲜的菌液进行重组粘粒的抽提。转移的 培养物到管,离心。弃培养液上清,并用.溶液., , 混匀到没有团状菌体。加 入溶液 ? / . ,%.,轻微混悬。并于室温放置,至外观清澈透明。 缓慢加入/的乙酸钾溶液..,立即混匀,冰上放置。 离心样品。取新的管,并加入.异丙醇。将离心的上清轻轻加入到异丙醇 中,避免触及或者吸到离心的白色沉淀物。温柔混合样品,并置于冰上。室温, 再次离心样品,弃上清,并以%乙醇漂洗沉淀次,离心 ,弃上清,沉淀于空气中干燥。 溶解沉淀。取抽 灭菌的 提的粘粒.?,用引物来进行反应。反应混合物配制如下: 重组粘粒 .?各. ? 引物 . 补充灭菌去离子水 .? 。 ,。,。 ,个循环:。 程序为:。;。 产物立即电泳或保存于。。产物进行%琼脂糖凝胶电泳分析,根据扩增产物 的大小确证重组粘粒制备成功。鉴定阳性的重组