青霉素G酰基转移酶工艺过程研究

青霉素G酰基转移酶工艺过程研究 :兰:至.. 呵:塾垒堑堕 : 哪: 时 影 : 撕 “: 。 。血 姆: 血 啪 : 血 : 四煳 河北科技大学学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工 作所取得的成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以 明确方 式标明。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发 表或撰写过的作品或成果。本人完全意识到本声明的法律结果由本入承担。 学位论文作者签名: 指导教师签名:朝露 ;年/月;日 州年,月毋 河北科技大学学位论文版权使用#授权# 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本 人授权河北科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 口保密,在一年解密后适用本授权书。一一一?一一?一?~一~一 本学位论文属于 琳保密。 请在以上方框内打‘‘?’’ 学位论文作者签名: ?撇:趴疡依 戈壬、 年月“日 矽年月毋摘要 摘 要 阿莫西林是目前应用较广泛的.内酰胺类抗生素之一。由于反应条件温和、污 染少、转化率高等特点,酶法生产阿莫西林成了人们争相研究的热点。在酶法工艺 中,青霉素酰基转移酶是关键的催化用酶,因此,研究该酶的分离、纯化具有一定 的理论和现实意义。本文主要对青霉素酰基转移酶的分离、纯化、固定化步骤进行 了研究。 首先,通过对青霉素酰基转移酶细胞破碎的方法研究,本文得到最佳方法为 缸,收率达到.%,比活为. 均质破碎,其中均质的最佳条件为:均质压力 /。 其次,通过对热处理工艺中时间和温度的摸索实验,本文得到热处理的最佳时 间为,最佳温度为?。在硫酸铵沉淀工艺研究中,本文确定了硫酸铵沉淀 的最佳饱和度为%。‘ 再次,通过对比进口和国产两种层析树脂,进口树脂层析平均收率为.%, 国产树脂层析平均收率为.%,本文选择进口树脂进行层析。 最后,通过粒径、投酶比、盐浓度的对比,本文确定酶固定化时选用天津南开 /。 的树脂,固定化过程中适宜的投酶比为 儋,适宜的盐浓度为 关键词青霉素酰基转移酶:分离纯化;均质:沉淀:层析;固定化河北科技大学 硕士学位论文 . , , ,, ,.., : .. .%, /. % ?., , ..% .%, .。 ,,/. 眺, ;;;;;; 目 录 目 录 摘 要?..??.??. 第章绪论??. .抗生素? .. 抗生素的种类??.....抗生素的作用机理.阿莫西林。 青霉素酰基转移酶??. ..概述??. ..酶的传统分离纯化方法? ‘.. 固定化树脂??. .课题研究内容及意义? 第章实验方法与过程 .工艺图矗??” .实验准备?” .. 实验原?。 ..实验仪器??. .实验过程?叩? ..酶活的测定? ..蛋白质含量的测定?.. ..缓冲液的配制?。 ..发酵液细胞破碎??。 .。发酵液纯化??。 ..酶液层析??...? ..固定化??.....结果计算方法?。? 第章实验结果与分析? .细胞破碎方法??...??. ..均质方法. ..渗透方法??............河北科技大学硕士学位论文 ..超声波破碎法. ..细胞破壁方法的比较. .酶溶液的纯化??. ..酶溶液的热处理??. ..酶溶液的沉淀。 .层析试验结果??.. .固定化实验结果? ..树脂的选择?. ..投酶比的选择. .. 固定化盐浓度试验?. 结 论? 参考文献攻读硕士学位期间所发表的论文及专利. 致 谢? 个人简历?. 第章绪论 论 第章 绪 . 抗生素 ..抗生素的种类 抗生素是一些微生物在生长繁殖过程中产生的具有抑制或杀死其他微生物作用 的代谢产物。如今应用于临床的抗生素已达数千种,从来源分类,其可分为由微生 物培养液或动植物中提取的天然抗生素,用化学法或生物法得到的合成和半合成化 合物。【】通常情况下,根据化合物的结构不同,抗生素可分为以下类: .内酰胺类 此类化合物结构中都含有.内酰胺环,根据环的差异,其又可分为青霉素类、 头孢菌素类、碳青霉烯类、头霉素类、单环.内酰胺类等,其中的代表药物有青霉 素、阿莫西林、氨苄西林、苄星青霉素、普鲁卡因青霉素、头孢氨苄、头孢曲松、 美罗培南、法罗培南、氨曲南等,结构式如图.所示。.】 叭淋窆 娘 青霉素类:青霉素 头孢类:头孢氨苄 喾 碳青霉烯类:美罗培南 单酰胺环类:氨曲南 图肛内酰胺类抗生素 四环素类 此类化合物以四并苯为母核,代表药物有四环素、金霉素、土霉素等,结构式 如图.所示。河北科技大学硕士学位论文 金霉素 ,,, 土霉素 ,. 四环素 ,,. 图?四环素类抗生素 大环内酯类 根据酯环的不同,此类化合物可分为多氧大环内酯类大环内酯的配糖体以苷 键 与.个分子的糖相连、多烯大环内酯类.元的大环内酯,环中含有.个共 轭双链、蒽沙大环内酯类含有的脂肪链桥的立体化学结构与大环内酯相似, 代表 药物有红霉素、阿奇霉素等。 氨基糖苷类. 此类化合物结构中含有六元酯环,环上有氨基和羟基取代基,分子中有氨基 醇 环和氨基糖,并由配糖键连接成苷,代表药物有天然的庆大霉素、卡那霉素、 链霉 素等,以及半合成品阿米卡星、丁胺卡那霉素等,结构式如图.所示。】 , ‘ 卡那霉素 链霉素 图氨基糖苷类抗生素 其他类 这一类抗生素主要包括酰胺醇类如氯霉素、甲砜霉素,磷霉素类如磷霉素, 林 克胺类如林可霉素,多肽类如放线菌素,喹诺酮类如氟哌酸等,结构式如图所 示。第章绪论 氯霉素 林可霉素 图其他类抗生素 ..抗生素的作用机理 抗生素的杀菌、抑菌机理一般分为类: 抑制核酸的合成 核酸包括和,具有调控蛋白质合成的功能。】抗生素主要通过抑制 或的合成,抑制微生物的生长,如利福平通过与依赖的聚合酶转 录酶的亚单位结合,从而抑制心的转录达到抑菌。 抑制蛋白质的合成 通过抑制肽链的延长、蛋白的起始和终止、氨酰.的连接发挥作用,如氯 霉素通过进入细菌细胞内可逆性地结合在细菌核糖体的亚基上,使肽链增长受 阻而抑制细菌蛋白质的合成。 改变细胞膜的通透性 通过与细菌细胞膜相互作用,打开膜上的离子通道,增强细菌细胞膜的通 透性,使得细菌内部的重要物质如磷酸、氨基酸、核酸、酶等外漏或电解质平 衡失调而致死。】 干扰细胞壁的合成 通过阻碍细菌细胞壁的合成,造成细胞壁缺损,失去渗透屏障作用,导致细 菌在低渗透压环境下膨胀破裂死亡,以这种方式作用的抗生素主要是.内酰胺 类抗生素。细菌细胞壁的主要成分是黏肽,它需要在黏肽转肽酶的催化下进行转肽 反应合成细胞壁。.内酰胺类抗生素与黏肽.丙氨酰..丙氨酸的末端结构、 空间构象均类似,转肽过程中酶识别错误,使得细胞壁无法形成,进而引起溶菌。河北科技大学硕士学位论文 蟛铡台玻 影确臻自襞金戚 《陵诺蕊艇 糕基糖蕾类,四环絮 类.飙嚣素.红露豢 图抗生素的作用机制机理图 . 阿莫西林 阿莫西林,又名安莫西林,白色粉末,半衰期约为..分钟,由于选择性好,. 杀菌作用强,是目前应用较为广泛的口服广谱.内酰胺类抗生素之一。阿莫西 林主要作用是干扰细胞壁的合成,口服后药物分子中的内酰胺基立即发生水解反应 生成肽键,其迅速和菌体内的黏肽转肽酶结合使之失活,切断了建造细胞壁的唯一 途径,菌体最终因细胞壁损失,水份不断渗透而膨胀破裂死亡。阿莫西林可通过化 学法和酶法制得。 化学合成法 化学合成法是目前大部分生产企业通用的的工艺,主要分为步,如图所示。 首先,以对羟基苯甘氨酸为原料得到对羟基苯甘氨酸邓钾盐,其与特戊酰氯反应得 到混酐,进一步与的铵盐发生缩合反应得到氨基保护的化合物,最后 经水解、结晶等工序得到产品阿莫西林。】 该方法工艺路线长,存在着保护、去保护、活化、缩合等步骤,部分反应过程 需要无水环境,反应过程复杂,反应条件苛刻,且用到大量吡啶、特戊酰氯、二氯 甲烷和胺等毒性较大的物质,对操作工人和环境都造成较大污染。随着环保 意 识的增强,人们对酶法合成方法的研究越来越重视。 第章绪论 吣 四。锇?姒。入一阳 五坶“入一琊 亡 ‘ 四,七一斗。苫仅 。人..八,硝、彳\,、 一 州。双苫付 堡堂 图.化学法合成阿莫西林 酶促合成法 以对羟基苯甘氨酸甲酯和母核.?~为原料,加入青霉素酰化酶催化即 得阿莫西林,工艺流程见图.。?】反应条件为投酶量大于. /、:. .巧.。 大于.:、温度~?、 酶促合成法生产工艺简单,周期短,反应条件温和,去除了大量溶媒的使用, 减少了三废的排放,劳动环境得到改菩,有利于清洁生产,是绿色合成工艺路 线, 有利于社会经济长远利益的发展。其次,据朱科、王艳艳等人报道,与化学合成法 相比,酶法合成的阿莫西林虽然在酸度、水分、比旋、初始含量等方面相差不大, 但是单杂低,总杂低,纯度更高,且味觉、嗅觉、晶型、稳定性方面都占有很大优 势。由于同一物质的不同晶型在热力学方面的参数不同,这些差异直接影响了药物 的稳定性和内在质量,而且药物的晶型对制剂也有很大的影响,大的晶型有利于提 河北科技大学硕士学位论文 高药品粉子的流动性,因此在药物质量控制中晶型是重要质控指标之一。【.】显微? 镜观察两种方法制得的阿莫西林粉末显示,酶法的阿莫西林晶型较大,完整且规则, 而目前阿莫西林的制剂有胶囊、颗粒剂、片剂、分散片等,流动性好的粉末在制剂 过程中具有松密度大、操作粉尘少、分装收率高等优点。此外,随着技术的发展, 酶促合成法中所用的青霉素酰化酶能实现固定化,使得其能回收并加以重复利用, 提高了原材料的使用效率,降低能耗,再次体现了精益生产、绿色化学的优 势。 青霉素酰化酶 。镞呲娜 ?《?洲承 图.酶法合成阿莫西林 .青霉素酰基转移酶 .. 概述 青霉素酰化酶 ,,又称为青霉素酰基转移酶,其 在.内酰胺类抗生索的生产中占有很重要的地位,是一种重要的医药工业用 酶。 酶既可在碱性条件下催化青霉素水解为母核和苯乙酸,又可作用于头孢菌素 使其脱去苯乙酰生成,而和均是生产内酰胺类半合成 抗生素的重要中间体,结构式如图.所示。.】另一方面,该酶还可催化、 或发生酰胺化缩合反应制得.内酰胺类半合成抗生素,如以 为母核的阿莫西林、氨苄西林,以为母核的头孢唑林,以为母核的 头孢氨苄、头孢羟氨苄等。 :工二忑二?三:: 产彳?叱 犷心 毪一 图抗生素母核 由于酶法合成生产工艺简单,周期短,反应条件温和,三废排放少的独特优势, 多年来一直引起众多研究者的注意。舢】近年来,人们对青霉素酰化酶的研究主要 分为三个方向:一是运用基因工程的方法寻找和改造能产生该酶的高产菌株和性能 优良菌株;二是探索简单有效的分离纯化方法;三是尝试新的高效的固定化方法, 第章绪论 提高酶活力、稳定性以及利用率,改善酶的特性。 本文的主要研究内容是青霉素酰化酶的分离纯化以及固定化,以下就与本论文 有关的部分进行综述。 。。酶的传统分离纯化方法 生物细胞产生的酶有两类:一类是在细胞内起催化作用的细胞内酶;另一类是 在细胞内产生,在细胞外进行作用的细胞外酶。酶分离纯化的一般程序包括:材料 预处理及细胞破碎、粗制品的获得、进一步分离提纯。. ...细胞破碎 分离提纯某种酶时,首先要在保持原来活性的条件下把酶从组织或细胞中释放 出来。常用的组织细胞的破碎方法主要有机械破碎、化学破碎、物理破碎、酶解破 碎。其中机械破碎是通过机械运动产生的剪切力使细胞破碎,包括机械捣碎法、匀 浆法、研磨法;化学破碎是通过化学试剂如有机溶剂丙酮、甲苯、表面活性剂吐温、 特里顿等破坏细胞膜结构而破碎;物理破碎是通过各种物理因素如温度差、压力差、 超声等的作用使组织细胞破碎;酶解破碎是通过细胞本身的酶或外加酶制剂的催化 作用达到细胞破碎,包括自溶法和外加酶处理法。】 ...粗制品的获得 固液分离方法 酶的固液分离一般分为离心分离、过滤与膜分离。离心分离是借助于离心机转 鼓旋转所产生的离心力将大小、密度不同的物质分离的技术。过滤是借助于过滤介 质将不同大小、形状的物质进行分离,过滤介质有滤纸、滤布、多孔陶瓷、高分子 膜、纤维等,根据截留颗粒的大小可分为粗滤、微滤、超滤、反渗透。其中借助于 一定孔径的高分子薄膜进行分离的技术称为膜分离。膜分离所使用的薄膜主 要是由 醋酸纤维素、丙烯腈、尼龙以及赛璐玢等高分子聚合物制成的高分子膜。 提纯方法 比较有效的方法是根据蛋白质溶解度的差异进行沉淀分离。常用的沉淀方法有 盐析法、等电点沉淀法、复合沉淀法、有机溶剂沉淀法。.每种蛋白质都有其最 适合的盐浓度,在此盐浓度下它的溶解性最好,通过调节盐浓度将不同蛋白质分离 的方法称为盐析法,被盐析沉淀下来的蛋白质仍可保持其天然性质,并能再度溶解 而不变性。蛋白质盐析中最常用的中性盐是硫酸铵,因其在水中的溶解度大而温度 系数溶解度 /,溶解度 /,不影响酶活且价廉易得。等电点 沉淀是利用不同的两性电解质有不同的等电点,两性电解质在等电点时溶解度最低 的特性,通过调节值,使酶或杂质沉淀析出,从而达到分离的方法。复合沉淀法 是在酶液中加入某些物质如单宁、聚丙烯酸等,使它与酶形成复合物而沉淀分离, 分离沉淀后,通过适当的方法还可将酶从复合物中重新析出。有机溶剂沉淀法是利 河北科技大学硕士学位论文 用蛋白质或杂质在乙醇、丙酮等有机溶剂中溶解度不同而分离,‘该方法易使酶发生 变性。 ...样品的进一步分离纯化 通过沉淀法得到的样品一般含有杂质,需进一步的分离纯化,常用的方法有层 析、电泳、结晶等。层析是利用混合物中各组分物理化学性质的差异,如分子形状 及大小、分子质量大小、分配系数、吸附力、分子亲和力等,使各组分在流动相和 固定相中的分布程度不同,并以不同的速度移动而达到分离的目的。根据层析机理 的不同,可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析、层析 聚焦等。电泳是带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程。 按其使用的支持体的不同,电泳可以分为纸电泳、薄膜电泳、薄层电泳、等电聚焦 电泳、自由电泳、凝胶电泳。结晶是酶分离纯化的一种手段,它不仅为酶的结构与 功能等的研究提供了适宜的样品,而且为较高纯度的酶的获得和应用创造了 条件。 常用的结晶方法有盐析结晶、有机溶剂结晶、透析平衡结晶、等电点结晶。 ..固定化树脂 环氧树脂及固化后的复合材料具有优良的物理机械性能、电绝缘性能、耐药品 性能和粘结性能。树脂通常是指受热后有软化或熔融范围,软化时在外力作用下有 流动倾向,常温下是固态、半固态,有时也可以是液态的有机聚合物。广义地讲, 可以作为塑料制品加工原料的任何聚合物都称为树脂。 树脂有天然树脂和合成树脂之分。天然树脂是指由自然界中动植物分泌物所得 的无定形有机物质,如松香、琥珀、虫胶等。合成树脂是指由简单有机物经化学合 成或某些天然产物经化学反应而得到的树脂产物。删 树脂的分类方法很多,除按树脂来源可将其分为天然树脂和合成树脂外,还可 按合成反应和主链组成来进行分类。 按树脂合成反应分类 按此方法可将树脂分为加聚物和缩聚物。加聚物是指由加成聚合反应制得的聚 合物,其链节结构的化学式与单体的分子式相同,如聚乙烯、聚苯乙烯、聚四 氟乙 烯等。缩聚物是指由缩合聚合反应制得的聚合物,其结构单元的化学式与单体的分 子式不同,如酚醛树脂、聚酯树脂、聚酰胺树脂等。【彤】 按树脂分子主链组成分类 按此方法可将树脂分为碳链聚合物、杂链聚合物和元素有机聚合物, 碳链聚合物是指主链全由碳原子构成的聚合物,如聚乙烯、聚苯乙烯等。 杂链聚合物是指主链由碳和氧、氮、硫等两种以上元素的原子所构成的聚合物, 如聚甲醛、聚酰胺、聚砜、聚醚等。 元素有机聚合物是指主链上不一定含有碳原子,主要由硅、氧、铝、钛、硼、硫、 第章绪论 磷等元素的原子构成,如有机硅。 .课题研究内容及意义 本课题主要研究用于阿莫西林酶法合成的青霉素酰化酶的分离纯化及固定化方 法。首先,在参考文献的基础上将发酵液通过离心、均质、层析等过程,得到较高 比活的酶溶液。其次,通过树脂的筛选、条件的选择,将青霉素酰化酶加以固定化 得到酶活较高、稳定性较好的固定化酶,考察其在阿莫西林生产中的使用情 况。 目前阿莫西林的生产主要用化学合成法,该方法工艺路线长,且过程中用到了 大量的吡啶、二氯甲烷、特戊酰氯等毒性较大的试剂,对人体、环境都有较大的危 害。相比之下,酶合成法工艺流程简单,试剂用量小,且据文献报道,此方法较化 学合成法制备的阿莫西林在色泽、晶型、纯度上都有很大的优势。绿色环保、经济 实用的酶法已经引起各国科研人员和抗生素生产企业的高度重视,因此研究青霉素 酰化酶的工艺过程具有重要意义。 河北科技大学硕士学位论文 目自目自;;目目:自目自 第章实验方法与过程 第章 实验方法与过程 .工艺流程图 图. 工艺流程图 .实验准备 ..实验原材料 名称 等级 物料厂家 分析纯 成都利生化工有限公司 化学纯 成都利生化工有限公司 ‘ 分析纯 天津市永大化学试剂有限公司 化学纯 山东肥城精制盐厂 化学纯 天津市永大化学试剂有限公司 化学纯 南京帝斯曼东方化工有限公司 化学纯 广州市光恒化工有限公司 甲醇 分析纯 北京现代东方精细化学品公司 乙醇 分析纯。 北京现代东方精细化学品公司 冰醋酸 分析纯 天津市永大化学试剂有限公司河北科技大学硕士学位论文 .实验过程 ..酶活的测定 酶活测定采用滴定方法,以青霉素钾盐为底物,其在作用下生成.氨 基青霉烷酸和苯乙酸四,氨基青霉烷酸能与对二甲氨基苯作用,生成在 下具有最大吸收峰,而且颜色的深浅与 酸性溶液中呈黄绿色的物质,溶液在 .氨基青霉烷酸的生成量成正比。 第章实验方法与过程 ... 样品洗涤 纯化水搅拌后进行抽滤,重复 取样品 左右置于抽滤器中,加入 遍后改用. /、 .磷酸盐缓冲液再次洗涤三次后。抽干至分钟没有 液体滴下为止,把抽干的样品放入干燥密闭容器保存待用。 . .磷酸盐缓冲液配制: /, .称取. 磷酸二氢钾溶于 纯化水中,摇匀。此溶液即为. /的 磷酸二氢钾溶液简称溶液。 .再称取. 磷酸氢二钾置于另一个细口瓶中,加 纯化水溶解后摇匀。 此溶液即为. /的磷酸氢二钾溶液简称溶液。 .用溶液调节溶液至.,即得。 ...仪器设备 恒温水浴锅、电位滴定仪、 滴定杯、. 量筒、. 刻度吸 管、?温度计、电子天平、称量纸。 ...检验方法 纯化水溶解, 称取 青霉素钾工业盐纯度?%放入滴定杯中,加 再加入. 磷酸盐缓冲液搅拌均匀,调整温度至?,用氢氧化钠滴定液. /调节到.后,用氢氧化钠滴定液. /开始滴定,秒表记时分钟, 维持.,记录反应分钟消耗氢氧化钠量空白。 精密称定. 左右的固化酶样品倒入上述溶液中,用氢氧化钠滴定液. /开始滴定,保持,记时分钟,维持.,记录反应分钟消耗氢氧 化钠滴定液的体积数样量。 ...计算 酶活/鳖当器牛竺 式中: 曩化饷: 氢氧化钠滴定液. /的摩尔溶度/; : 固化酶的重量曲; :毫摩尔与微摩尔换算比例; :反应时间分钟。 ..蛋白质含量的测定 蛋白含量采用检测法进行测定【’钔。检测法基于考马斯亮兰 .有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下,可配成淡 红 色的溶液,当与蛋白质结合后,产生蓝色化合物,反应迅速而稳定。反应化合 物在 ? 处有最大吸收值,化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比,因此检河北 科技大学硕士学位论文 测的值可计算蛋白含量。 ...测定步骤 取. 酶液,加入 的考马斯亮蓝.储存液,充分振荡混合。显色 后,在紫外分光光度计上测定的值。另做一空白实验,方法同上,将 酶液用等体积的缓冲液代替,根据曲线计算酶液中的蛋白质含量。 ...标准曲线的绘制 . 准确称取 容量瓶中,用蒸馏水溶解并定容至刻 ,置于 度。 取支试管,作两个平行,分别加入.、、.、、.、、.、 。 止标准蛋白溶液 /,用蒸馏水补足. 蒸馏水,作为空白对照。 另取支试管,加入. 蛋白质染色剂,充分振荡混合, / .号管依次加入 后于 测定吸光值。 绘出标准曲线,如图.,纵轴为溶液在 。下的吸光度,横轴为 的含量。 表标准曲线测定结果 图 标准曲线 ..缓冲液的配制 . ,.?.的磷酸钾缓冲液.%戊二醛溶液的配制 按./计算磷酸二氢钾用量,戴好胶皮手套、防护眼镜,然后用电子秤 称取磷酸二氢钾,启动搅拌,将称取好的. 放入烧杯中纯化水定容 至 。边搅拌边用%氧氧化钾溶液缓慢调节缓冲液到..,用便携 第章实验方法与过程 式计进行检测,然后把. /的戊二醛缓慢倒入其中。再搅拌均匀倒入 容量瓶中备用。 . ,.?.的甘氨酸溶液的配制 按. /计算甘氨酸用量,穿戴好胶皮手套、.防护眼镜,然后用电子秤 称取甘氨酸. 放入烧杯中纯化水定容至 ,边搅拌边用%氧氧化钾溶液 调节溶液值到.?.,再搅拌均匀倒入容量瓶中备用。 ,.?.的磷酸钾缓冲液的配制 按 /计算磷酸二氢钾用量,戴好胶皮手套、防护眼镜,然后用电子 秤称取磷酸二氢钾 ,边搅拌边加入 放入烧杯中,再加入纯化水 ,将缓冲液调节到.?.,调节好后,将溶液倒入量筒中定容至 ,再用便携式计进行检测,符合标准后,倒入容量瓶中备用。 .的配制 ,.?.磷酸钠缓冲液 按. /计算磷酸二氢钾用量,戴好胶皮手套、防护眼镜,用电子秤称取 磷酸二氢钾. 。边搅拌边用%氧氧化 ,放入烧杯中纯化水定容至 钾溶液缓慢调节缓冲液到.?.,用便携式计进行检测,再用电子 秤称取. 的,搅拌溶解后定容至,待用。 %溶液的配制 配制稀碱时,戴好防护眼罩,防酸碱手套。用电子秤称取氢氧化钠 于 烧杯中加入纯化水溶解,定容至 ,待用。 .?.的磷酸钾缓冲液的配制 按/计算磷酸二氢钾用量,穿戴好胶皮手套、防护眼镜,然后用电子 秤称取磷酸二氢钾 ,倒入烧杯中,向烧杯中加入纯化水 溶解,缓 慢向烧杯中加入氢氧化钾,搅拌分钟,用便携式计进行检测,至. 。 ?.停止加碱,用纯化水定容至 ..%甲醛溶液的配制 按/溶液计算%甲醛溶液用量,戴好胶皮手套、防毒面具, 然后将 甲醛溶液倒入量筒中加纯化水定容至 搅拌,倒入容量瓶中备用。 ..发酵液细胞破碎 ... 均质法 . 湿重细胞悬浮液于 取 /磷酸缓冲液.。 取样检测活力,直 冰浴,温度~?进行均质压: 。每隔 到活力达到最大值。 /离,二 均质后的样品, ,上清即为粗酶液。检测酶活力 和蛋白浓度,计算比活。 河北科技大学硕士学位论文 ... 渗透法 。 湿重细胞悬浮液于 取 .。 /磷酸缓冲液 加入%的渗透剂,升温?保温。每隔 取样检测活力,直到活 力达到最大值。 /离一二 渗透后样品, ,上清为粗酶液。检测酶活力和蛋白浓 度,计算比活。 ... 超声波破碎法 . 湿重菌体悬于冰冷的 取 /磷酸缓冲液 .。 ;每超声破碎 暂停 冰浴中超声破碎 冷却。间隔取样. 检测活力,直到活力达到最大值。 /离心 ,上清即为粗酶液。检测酶活 超声后的样品,? 力和蛋白浓度,计算比活。 ..发酵液纯化 ...酶溶液热处理 取粗酶液 ,加入%的硫酸铵,调节到.。 取样。 升温到?,保温。每隔 /离心 ,取上清检测酶活和蛋白,计算比酶活。 样品,? 。 ...酶溶液沉淀 取粗酶液 ,加入硫酸铵,硫酸铵分级加入%、%、%、% 调节到.。 保持酶液到...之间,搅拌小时后,取样检测上清酶活力。 加入 /的助滤剂,进行抽滤。 取样检测酶活力和酶蛋白,计算比酶活。 ..酶液层析 ... 层析柱再生 ,. 用缓冲液 ,.?.磷酸二氢钠 进行树脂清洗:将层析树脂装入树脂柱中,缓慢加入上述缓冲液,调节出料 阀。 控制层析柱流速 ,观察柱内一直有液面,防止层析柱走空。?当缓冲液 走完后,再用 缓冲液清洗完毕。 用 纯化水进行树脂清洗: 缓慢向层析柱内导入 纯化水,调节出料阿,控制流速 ,观 察柱内一直有液面,防止层析柱走空。当纯化水走完后,关闭层析柱出料阀, 纯化水清洗完毕。 第章实验方法与过程 用 %溶液进行树脂清洗: 缓慢向层析柱内导入 %溶液,调节出料阀,控制流速 /,观察柱内一直有液面,防止层析柱走空。当溶液走完后,关闭层 析柱出料阀,稀碱液清洗完毕。 用磷酸钠缓冲液. ,..清洗 继续向层析柱中加入. ,.。‘磷酸钠缓冲液,微开层析 柱出料阀,调节流速 /,取样用计进行检测,当层析柱流出液值 和磷酸钠缓冲液值相同时,缓冲液清洗完毕。 ...酶溶液层析 将酶溶液缓慢倒入层析柱中,调节出料阀,控制流速为 /,观察流出液 的颜色由澄清变为浅乳白色,取样检测酶活 /时,走缓冲液,继续接 /: 料,用试管取样观察,出料颜色更浅,关阀门,送样检测。当酶活 加入. 缓冲液,直到出料清澈,取样检测酶活、酶蛋白,计算比活,测 量层析液体积,计算收率。 ... 磷酸钾缓冲液沉淀 沉淀液:取上述层析后的酶溶液,用浓度为 ,.?.的磷酸钾 缓冲液等体积稀释,稀释后取样检测酶活、蛋白、磷含量。温度控制.~.?, 。 静置时间 .. 固定化 ...树脂预处理 取生产上批量使用的树脂,各称取 , 树脂,用倍体积含%戊二醛的. .士.的磷酸钾缓冲液将称量好的湿树脂,在室温下搅拌时,再分别用 体积纯化水洗涤至无戊二醛味为止抽干。 ... 固定化 将过滤好的酶溶液加入固定化设备中与树脂搅拌均匀,加入 的.:. 的磷酸缓冲液补足体积,使酶溶液总体积与树脂重量比为:。投入酶液的量 投酶比?树脂重量/ 沉淀酶活。 .. 固定化条件 搅拌频率 ,温度.~.?,周期 。 ...固定化酶洗涤 第一步洗涤:固定化结束后,将酶液倒掉,加入~倍体积的纯化水,室 温下搅拌~ 分钟。将液体排空,重复洗涤到洗酶水清澈。 , 第二步洗涤先交联,用倍体积.%戊二醛的磷酸钾缓冲液. ..室温下搅拌小时,将液体排空;再分别用倍体积的纯化水洗涤 河北科技大学硕士学位论文 次。 第三步洗涤:用倍体积的. 。 ..的甘氨酸溶液洗涤 再分别用倍体积的纯化水洗涤次。 第四步洗涤:用倍体积..%的甲醛溶液洗涤 。再分别用倍体 积的纯化水洗涤次。 第五步洗涤:将固定化酶溶液用软管排放到真空抽滤器中用 的 ..的磷酸钾缓冲液浸泡洗涤两次,抽干。 ..结果计算方法 比酶活 比酶活儋酶活/酶蛋白 层析收率 层析收率%层析后酶活×层析液体积 /层析前总酶活 固定化收率 固定化收率% 沉淀酶活×投酶比×树脂重量 沉淀酶活× 第章实验结果与分析 第章 实验结果与分析 .细胞破碎方法 衡量青霉素酰基转移酶细胞破碎程度主要标准为活力回收率和酶的比活值。 比活/蛋白酶活//蛋白浓度/。 ..均质方法 将菌悬液分别在 、 、 、 ‘ 压力条件下进行均 质,所得粗酶液酶活、收率及比活结果如表.所示。 表.均质压力对酶提取收率及比活的影响 结果表明酶活及收率随均质压力的提高而提高。活力回收率达到.%,比活 力.。进一步提高压力到 后活力并没有明显提高,然而杂蛋白的释放量却 随之提高,导致比活下降。另外,均质压力从 提高到 ,活力的释放量 为宜。 并无显著提高,因此本法以均质压力 ..渗透方法 将茵悬液分别在加入渗透剂各个加量下进行渗透,所得粗酶液酶活、收率及 比 活结果如表.所示。 表.均质压力对酶提取收率及比活的影响 . % . . . % . . . . 河北科技大学硕士学位论文 % . . . . % . . . . 结果表明酶活及收率随渗透剂加量的提高而提高。活力回收率达到.%,比 活力.。进一步提高渗透剂加量到%后活力并没有明显提高,然而杂蛋白的释 放量却随之提高,导致比活下降。另外,因此本法渗透加量%为宜。 ..超声波破碎法 将菌悬液分别在加入不同频率的各个加量下进行破碎,所得粗酶液酶活、收 率 及比活结果如表.所示。 表.超声波破碎法对酶提取收率及比活的影响 结果表明:酶活及收率随渗透剂加量的提高而提高。活力回收率达到.%, 比活力.。相对来说效果不佳。 ..细胞破壁方法的比较 图? 不同破碎方法收率比较 图.不同破碎方法比活力比较 各细胞破碎方法所得的结果见图.、图.。活力回收率最高的是均质法,为 .%;其次为渗透法.%;最低的为超声波破碎法.%。而比活均质法最 高为. /,渗透法为. /:最低的为超声波法. /。 综合收率和比活两方面考虑均质法为较优的破壁方法。第章实验结果与分析 .酶溶液的纯化 ..酶溶液的热处理 青霉素酰基转移酶热处理主要目的为利用高温使杂蛋白变性失活,从而提高 酶溶液的纯度。通过以下的实验 ... 热处理温度对酶活和比活的影响 热处理时间对酶活和比活的影响见下图.,从图.可以看出升温到不同温度, 保持一定时间对酶活的影响。收率随着温度的升高降低,而酶溶液的比活 在?时 达到峰值,温度升值?时比活有所下降。因此热处理的最佳温度为?。 图温度对酶活和比活的影响 ...热处理时间对酶活和比活的影响 热处理时间对酶活和比活的影响见下图,从图可以看出升温到相同温度,保 持不同时间对酶活和比活的影响。收率在 之间收率没有明显变化, 而当热处理时间处理到 后收率明显下降较多;酶蛋白失活较快。比活没有明 。 显降低,所以热处理的最佳时间为 图时间对酶活和比活的影响 ..酶溶液的沉淀 硫酸铵沉淀法为常用的蛋白粗提法。主要原理是有机溶剂能降低溶液的介电 常 , 数,因而降低了蛋白质、酶等生物大分子的溶解度而使之沉淀析出。因此本 实验采河北科技大学硕士学位论文 用硫酸铵沉淀浓缩青霉素酰基转移鹃粗酶液用不同饱和度的硫酸铵分级沉 淀以达 到浓缩的目的,结果如图.所示。 如 ? ? ? 柏 乎烬苗茁罂耀懊? ? 硫酸铵饱和度% 图硫胺饱和度对上清液酶活的影响 由图.可知,当硫酸铵饱和度在%时,上清液酶活保留在.%以上:随 着硫酸铵饱和度的增大,上清液酶活下降很快;当硫酸铵饱和度为%时,上清 液 残留为.%。因此确定硫酸铵饱和范围为%%,即用%硫酸铵除去粗酶液 中的杂蛋白,然后用%硫酸铵沉淀浓缩粗酶液中的青霉素酰基转移酶。 .层析试验结果 青霉素酰基转移酶的层析过程,分别选用进口树脂和国产树脂按照..进行 试验,每种树脂进行三次平行试验,实验结果分别列于下表。 表?层析试验结果第章实验结果与分析 从上表中可以看出使用进口树脂进行层析试验时,层析后酶活较国产树脂偏 高, 同时可以看出进口树脂的层析收率高于国产树脂。因此在生产中选用进口树 脂进行 层析。 .固定化实验结果 ..树脂的选择 在固定化试验过程中选用两种不同的树脂进行固定化试验,分别选用西安蓝 晓 的树脂和天津南开的树脂。 天津南开树脂的粒度分布如图.;西安蓝晓树脂的粒度分布如图. 。 强 ? ? &? ? 瓶 。 。 ?% 叫 “ 。 ? ? ? ? ? 。 ‘】。? 鱼 ? .蹭 ? ? ? %弱 。 .龆 。 ?” ? ?? %上 。 ? ? 。 签 。 【吐? ? ? ,孵 ,鸵 。 。? ? ? ? 盈。? ? 。 ?【 叫 ?? ? ? ? 四 笠? & ? ? ? 。 ,。 四 髓。 ,。 。 ?孵 ? 靼? 。? ? ? ? 。 。 【 图?天津南开树脂粒度分布图河北科技大学硕士学位论文 ? 。 ? 。 。 西 。 &。。 ?拙 让 。 。。 。 ’ ? 瑚鸵 。 ? 。 .? ? 心 .“ ? 孙 ? 。 ? 。 ?? 。 ? ‘ ?? 趋 。 凹? ? ” ? 。 ? ’ &?。 田 。西 。 剥 ? 蛳 图西安蓝晓树脂粒度分布图 ..投酶比的选择 在固定化过程中分别选用不同的投酶比按照..进行试验,投酶比分别为 儋、 /、 /实验,每组实验做三次平行实验,取用上述试验中的层析液, 按照...进行 沉淀后的酶液进行固定化, 沉淀酶液酶活: /实 验结果于下表。 使用西安蓝晓的树脂试验结果于表.。 ? 们 州 。 ?表.西安蓝晓树脂固定化试验结果 结果分析:从上表中可以看出不同的投酶比条件下固定化的酶活不同,投酶 比 升高时固定化酶活提高,但从整体上看,固定化收率跟投酶比成反比,投酶比 升高 时,固定化收率降低。投酶比是影响固定化的重要因素,因此,对上表中的固 定化 收率结果,绘图.进行分析。 图.西安蓝晓树脂固定化收率趋势图 从图.可以看出当投酶比为 /时,固定化收率高于另外两种条件下的收 率。 使用天津南开的树脂试验结果于表?。 表.天津南开树脂固定化试验结果 结果分析:天津南开树脂固定化试验结果可以看出与西安蓝晓树脂固定化试 验 结果的趋势基本一致,随着投酶比的升高,固定化后的酶活逐渐提高,但固定 化收 率却不是升高的趋势。从上表中可以看出,当投酶比为 儋时,固定化收率最高。 因此,对上表中的固定化收率结果,绘图进行分析。 图.天津南开树脂固定化收率趋势图 第章实验结果与分析 从图看出当投酶比为 /时固定化收率比较高。 从综合上述两组试验结果分析,选择合适的投酶比为 /。故在进行下述固 定化盐浓度的试验中,选择在投酶比为 /的条件下进行分组试验。 .. 固定化盐浓度试验 在固定化过程中分别选用不同的盐浓度按照..进行试验,盐浓度分别为. /、 /、. /、. /、实验,每组实验做三次平行实验,取用上述 试验中的层析液,按照...进行 沉淀,用 沉淀酶液进行固定化,投酶比 根据上述试验结果选择投酶比为 /。 /,沉淀酶液酶活: 使用西安蓝晓的树脂试验结果于表.。 表.西安蓝晓树脂固定化试验结果 盐浓度 固定化前总酶 固定化后酶 固定化后总酶 一。 固定化收 ’ 平均固定 。~一 实验号 实验号 酶重量 酶重量/ 活/ 活/ 率,% // 活// 化收率肱 毫? 约 ? : 盯 . ?? 弘? 约加 . ?粥 弘 ? 鲐 掩 砉? 剪 坫 .? 配的 ?? 钉 ? 酩修 . 窘? 稻 ? ? ?粥 弘 ? 弱射 . ?? 孙 ? 舄 . ?? 弱 ? 弱? 粥 ? 孔 ? ? 弛 乱 ?? 匏 ? ? 舛 乱 . ?? 如 ? 卯 结果分析:固定化过程中适宜的盐浓度,有利于固定化过程中酶活的吸附,通 过上述试验结果看出盐浓度过高时抑制酶活的吸附,致使固定化酶活降低, 固定化 收率降低。为了更好的分析实验结果,现绘制固定化收率趋势于下。~~” 。?????????????、.. ~,‘ 一 ?一 一一一 试粤叁号 图.西安蓝晓树脂固定化收率趋势图 从图.可以看出盐浓度为. /时,最适宜固定化过程的进行,高于此浓 度时固定化收率明显降低,。过高的盐浓度抑制树脂对酶的吸附。 使用天津南开的树脂试验结果于表?。 表.天津南开树脂固定化试验结果 结果分析:从表.中可以看出,使用天津南开树脂固定化后其结果的趋势与西 安蓝晓树脂固定化结果趋势相同,可见盐浓度对固定化过程的影响表现是一 致的。第章实验结果与分析 对表.的实验结果绘制折线图.进行分析。 ~ 一 一 一~ ~一 ~ ~‘. .一 , ‘. .//?? ?. 峄????甍?,. 同定化收翠掌图天津南开树脂固定化收率趋势图 从图?可以看出不同盐浓度对固定化的影响很明显,过高、过低的盐浓度抑 制树脂吸附酶溶液。盐浓度对固定化过程的影响仅次于投酶比的影响,两者 需结合 考虑,选用适宜的条件,同时不同的树脂,由于树脂的粒径、强度都有所差异,其 在固定化过程中的作用程度也会不同,故将本实验使用的两种树脂的固定化结果进 行比较,其结果列于下图。 图两种树脂不同盐浓度下固定化收率比较 从图?可以看出使用天津南开树脂进行固定化实验时,固定化收率在各浓度 条件下均高于使用西安蓝晓树脂进行固定化的收率,可见树脂的不同对酶的固定化 也有一定的影响。由于不同生产厂家制作树脂的工艺有一定差异,致使树脂本身存 在差异,树脂应为规则球形颗粒,不透明或半透明,颗粒之间不粘连,呈良好的分河北科技大学硕士学位论文 散状,并且要求颗粒膨胀系数小,刚性强,弹性高。因此,在固定化过程中,树脂 的均一度、强度等因素影响树脂对酶的吸附。结论 结 论 本论文通过对青霉素酰基转移酶提取过程的实验研究得到如下结论: 通过细胞破碎实验得到以下结论: 均质破碎方法是提取青霉素酰基转移酶细胞破碎的最佳方法。均质压力 ,收率达到.%,比活为. / 通过热处理实验得到以下结论: 通过对热处理的时间和温度的摸索实验得到:热处理的最佳时间,最佳温 度为?。 通过沉淀实验得到以下结论: 采用%饱和度的硫酸铵沉淀进行沉淀效果最好。 通过层析试验结果比较分析得到以下结论: 进口树脂层析平均收率为:.%,国产树脂层析平均收率为:.%。从实 验结果分析采用进口树脂更有利于层析试验,故选择进口树脂。 通过固定化试验结果比较分析得到以下结论: 分别对选用的两种树脂按照不同的投酶比进行试验结果显示,三种条件下按照 固定化收率判定当投酶比为 /时,固定化收率最高,分别为:西安蓝晓树脂平 均固定化收率为.%;天津南开树脂平均固定化收率为.%。 根据固定化投酶比实验结果,按照确定投酶比/,进行固定化过程中盐浓 度选择试验结果发现,在两种树脂情况下盐浓度为 /时,固定化收率相对较高, 结果为:西安蓝晓树脂平均固定化收率为.%;天津南开树脂平均固定化收率为 . %。 分别对两种树脂在上述两方面固定化试验结果中固定化收率分析,天津南开树 脂固定化收率均高于西安蓝晓树脂固定化收率。由此可见,天津南开树脂更 适于青 霉素酰基转移酶的固定化。河北科技大学硕士学位论文 ;目; ? ????????????????????????一一??日参考文献 参考文献 【梁鹏飞.重组青霉素酰化酶在大肠杆菌中的组成型表达及其固定化.北京 化工大学. 】, ,, 。龚翔宇.固定化粪产碱杆菌青霉素酰化酶的制备及动力学拆分.苯丙氨酸类 化合物的研 究.华东理工大学,. 【】 , ,,. . ?. 【】 , , , . 限 , 【】赵贵兴.交联酶聚集体的生物催化.黑龙江农业科学. 【】拜秀玲.青霉素酰化酶性质及应用研究.天津大学,. . , 】 , . . , , 【】 , . 曲一 . ,, :. .,.】 .,. . :?. ,. 】王艳艳,朱科,康辉,辛朝辉,郝晓霞狲磊.酶法阿奠西林质量研究.河北化 工. 【】朱颂成.内酰胺抗生素酰化酶产生菌 .的研究.中国科学院研究生院上 海生命科学研究院。. 【】张云茹,张彩琴,余瑛,等.生物化学实验“蛋白质沉淀反应与盐析作用” 解析.实验室科学,。 :. 【】杨正,青霉素酰化酶的分离纯化和固定化研究新进展.安徽化工,,:.. 【】孙风卿,罗建辉,康辉,等.碱滴定法测定发酵液中青霉素酰化酶酶活.现 代中西医结合杂志. ,. 【】赵献春.产脱枝酶菌株的筛选酶的分离纯化及酶学性质研究.江南大学.