细菌内毒素脂多糖对人蜕膜基质细胞单核细胞趋化蛋白-1表达影响的研究（可编辑）

细菌内毒素脂多糖对人蜕膜基质细胞单核细胞趋化蛋白-1表达影响的研究（可编辑） 细菌内毒素脂多糖对人蜕膜基质细胞单核细胞趋化蛋 白-1表达影响的研究 714(2 0 分类号:R 单位代码:1422 密 级: 学 号:032303087 ?厶 茹办孑 硕士学位 Shan do Unive MasterIsThesiS ng rsity 论文目:细菌内毒素脂多糖对人蜕膜基质细胞单核 细胞趋化蛋白一1表达的影响研究 REGULATIONoFMONoCYTE PRoTEIN(1BYLIPoPoLYSACCHARIDEINFIRST TRIMESTERCYTOTRoPHOBLASTICCELLS 作 者 专 业 导 师 合作导师 201 0年3月24日 fIllll l llllll llllll llf 原创性声明 ,1791722 本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名:盘公:五 日 期: 砬l受!篁:堡 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定 论文作者签名: 盔坐堡导师签名:‘旌查!兰鉴日 期: 迎也;玉丕? 目 录 中文摘 要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„????1 英文摘 要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„????4 英文缩写词 表„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„7 前刖 言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„一8一吾„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„一 材料和方 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„??10 结 果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„18 讨 论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„20 结 论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„34 附 图„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„35 参考文 献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ „„??40 致 射„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„48 CATALoG in AbstractChinese„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„??l Abstractin English„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„????4 Symbolicdescription„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„。7 Preface„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„8 O Materialsandmethods„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„1 8 Results„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„??1 Discussion„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„??20 Discussion„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„??‘34 Summary graphs„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„????35 References„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„??4l Acknowledgments„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„??48 山东大学硕士学位论文 细菌内毒素脂多糖对人蜕膜基质细胞单核细胞趋化蛋白一1表达 影响的研究 硕士研究生:徐小飞( 专 业:妇产科学 导 师:孔北华 教授 中文摘要 从免疫学角度讲，妊娠相当于成功的半同种异体移植，妊娠建立与维持取决 于胚胎植入及发育过程中母体蜕膜局部乃至全身免疫系统的状态。母体与胎儿之 间维持着精妙的免疫平衡，一方面耐受胎儿使其得以植入并在宫内正常发育，另 一方面适度活化抵抗病原体侵袭，以免感染后蜕膜局部免疫系统发生变化，打破 母胎间的免疫平衡，使母体排斥胎儿，进而引起流产、胎儿畸形、胎儿宫内生长 受限、子痫前期子痫等病理妊娠的发生。母胎之间的免疫平衡有赖于多种免疫细 胞和细胞因子的协调作用，研究发现单核细胞趋化蛋白(1 MCP(1 具有抗感染 及介导耐受的双向作用，妊娠早期蜕膜基质细胞高表达MCP(1及其受体CCR2， 多种炎性因子可刺激蜕膜基质细胞 DSC 分泌MCP(1，提示其在感染过程中 蜕膜局部免疫平衡的维持方面具有重要作用，因此推测感染可影响其在DSC的 表达。目前尚无DSC培养的公认方法，为建立一种科学的DSC体外培证明本实 验结果的可靠性，本实验同时进行了DSC体外培养的方法学探讨。 目的: 观察体外模拟早孕微环境 雌激素、孕激素 条件下革兰氏阴性细菌内毒素 脂多糖 LPS 对人蜕膜基质细胞MCP(1表达的影响，同时探讨蜕膜基质细胞 体外培养时传代纯化法对该表达的影响。 方法: 山东大学硕士学位论文 选取正常妊娠妇女人工流产蜕膜组织 6―8周 ，按常规方法分离蜕膜基质细 胞，在含有或不含有雌激素、孕激素培养基中传代培养，普通光镜下分别观察第 一代 P1 与第三代细胞 P3 的形态;采用免疫细胞化学法 细胞角蛋白7 和波形蛋白 分别鉴定两代细胞的纯度，采用流式细胞技术检测两代细胞表面 一代细胞和第三代细胞分别分为空白对照组、LPS 1垤,mL 刺激组。另外，细 胞分别在含与不含雌激素+孕激素的培养基中培养传代三次后各分为空白对照 提取总RNA，用RT(PCR与实时定量PCR技术检测MCP(1转录水平的表达， ELISA法检测上清中MCP(1的表达。 结果: 1、DSC体外培养的方法学探讨: ?与传代一次的细胞相比，传代三次的细胞形态变规则，细胞突起减少，胞 浆内颗粒明显减少，透明度增加，极性减弱或者消失。 ?免疫细胞化学染色显示，传代三次细胞较传代一次细胞DSC纯度增加 P 0(05 。 ?流式细胞仪检测结果显示，与传代一次细胞相比，传代三次细胞表面 TLR4、CCI毪分子表达下调 P O(05 。 2、LPS对DSCMCP(1表达水平的影响: 激后变化无统计学差异 PDO(05 ;与传代一次细胞空白对照组相比，传代三次 与传代一次细胞LPS刺激组无明显差异 PU0(05 。 胞LPS刺激组、雌激素+孕激素处理组、雌激素+孕激素+LPS处理组在转录水平 与分泌水平上MCP(1的表达显著上调 P o(05 :与雌激素+孕激素处理组和单 纯LPS刺激组相比，雌激素+孕激素+LPS处理组MCP(1表达水 平显著上调 P 0(05 。 2 山东大学硕士学位论文 结论: l、 传代可纯化分离培养的DSC，但也使其胞膜表面分子TLR4、CCR2表 达水平下降。 2、LPS通过与DSC表面TLR4作用，直接或间接地在转录水平与分泌水平 上调DSC的MCP―l表达，影响蜕膜局部免疫状态。 3、雌、孕激素联合作用可上调早孕期DSCMCP(1的表达， 提示MCP(1可 能对于正常妊娠的发生和维持具有不可忽视的作用。 4、雌、孕激素联合作用还可增强LPS对MCP(1的上调作用，说明MCP(1 在妊娠早期蜕膜抗感染方面有重要意义。 创新点: 1、取材新:目前国内外研究妊娠蜕膜微环境的实验室及相关文献报道较少。 2、本实验首次发现LPS可上调蜕膜基质细胞MCP(1表达水平。 3、本实验首次对传代培养DSC的方法进行了较完善的研究，发现传代可下 活性。 关键词:蜕膜基质细胞;传代次数;性激素;LPS;MCP(1 山东大学硕士学位论文 REGULATIONoFMoNoCYTE IN PRoTEIN(1BYLIPoPoLYSACCHARIDEFIRST TRIMESTERDECIDUALSTRoMALCELLS Xiaofei Postgraduate:Xu andobstetrics Speciality:gynaecology Beihua Tutor:Prof(Kong be asasuccessful Fromthe Can immunologicalangle，pregnancyperceived andthereisadelicatematemal-fetal enablethefetus semiallografl balance， which to establishmentandmaintenanceof isdecided developnormally(The pregnancy by one bothdecidual and conditionofthemother(On regionalsystemicimmunologic hasto toleranceto fetusto mother establish hand，the immunologicpermit implant and theother toactivate develop(On hand，decidualimmunologicsystemought toeliminate lestinfectionwould thebalancebetween adequately pathogens damage motherandresultinsuch motherand willcontributetothe of fetus，which rejection asabortion，fetal and pathologicalpregnancy cellsand take inthebalancebetween cytokinespart eclampsia(Manyimmunologic motherandfetus(Itis that chemoattractant reportedmonocyte bilateralfunction aswellas duringimmunologicprocess， anti-inflammation stromal firsttrimesterMCP一1 tolerance(Decidual mediating cells DSC ofexpress Call andits ata levelandseveral factors receptor―CCR2high inflammatory DSCto indicatethatMCP-1an role MCP-1，which promote express playsimportant maintenanceof banlanceinfection(Sowe that inthe immunologicduring supposed infectionwouldaffectthe ofMCP-1onDSC(Therehasn’ tbeenaculture expression Our ofDSCthatis confirmthe of technique generallyacknowledged(Toreliability vitro( also thecutureconditionofDSCin result，weinvestigate objeetive- 4 山东大学硕士学位论文 infirst-trimesterdecidualstromal Toobservethe ofMCP-1LPS regulation by theconditionsofthemicro―environmentsimulation cellsofdifferent under passages of and vitro( 7一p―EstradiolProgesterone in earlypregnancy 1 Methods: firsttrimester toconventional isolated According methods，We decidua 6―8weeks ofnormal and withorwithoutthe of woman，cultivated presence pregnant passaged 1 and used immunocytochemical 7(p(EstradiolProgesterone(We cellsandFCMtodetect 7and the ofdecidualstromal vimentin toidentifypurity cell isolatedcells to TLR4andCCR2 onthe surface(When grown expression of 1 and 3are divided 80, ，DSC respectively confluence aboutpassagepassage intosuch ascontrolorLPSstimulationothercases，isolated groups group group(In with 1 and cellswereculturedin mediumorwithout complete 7??p―Estradiol 3 weredividedintocontrolorLPS Progesterone(Afterpassages，they group for24hintheenvironmentof stimulation 37"C、50,C02， grouprespectively(Cultured andtotalRNAwere ofMCP??1at level supematant collected(Expressiontranscription RT-PCRandreal-??time wasdetected method PCR, bysemi―quantitative quantitative whilethesecretionofMCP-1in WasdeterminedELISA( supemant by Results: 1、Resultsaboutthe ofDSCinvitro: technique withcellsof incellsof 3 OComparedpassage1(cytoplasmicgranulationspassage and of declinedwhenobservedunder werediminished cytomembrane optic protrution microscope( Wasshowed that withcellsof ?It byimmunocytochemicalstainingcompared 1,DSCofcellsof 3was passagepurity passageimproved P 0(05 ( of andCCR2 levelonDSCsurface resultsindicatedthatTLR4 ?FCM expression 3is thanthatof 1 DSC( higher passage passage DSC 2、ResultsabouttheeffectofLPSinfirsttrimester PCRandELISAshowedthatno resultsofRT―PCR、real-time ?The quantitative levelorat of 1 MCP-lat matterat level，cells protein passageexpress transcription a levelbeforethestimulationof treatmentof high LPS(However,afterLPS， changes 气 山东大学硕士学位论文 levelhasno tocells 3， ofexpressionsignificantdifference P00(05 (Asofpassage the ofMCP一1Was inLPStreatment expression significantlyup-regulated group， with is that levelof control compared group 尸( 0(05 (Itinterestingexpression MCP一1wasmuchlowerincontrolof 3thanthatof passage passage1 P 0(05 ， group but inLPStreatment higher group俨 0(05 ( at real(time PCRandELISAshowedthatboth g RT(PCR、 quantitative levelandattranslation DSCwithouttreatment transcription level(compared、枋t11any or1 and ofMCP-1Was LPS7一p-EstradiolProgesterone ，theexpression significantly inotherthree stimulated and up-regulated groups:LPS group，17-p-Estradiol treated 1 and treated progesteronegroup， LPSplus7-p-Estradiolprogesteronegroup( 1 treatedorLPStreated group group，the Compared晰m7-B-Estradiol+progesterone levelofMCP-11 and LPScombined expression 7一p-Estradiolprogesteroneplus treatmentwas groupsignificantlyup-regulated妒 0(05 ( Conelusions: 1、The ofDSCincellsweisolatedCanbe purity improvedthroughpassage， the of ofTLR4andCCR2onthe however，duringprocesspassage，theexpression ofDSC( affectthefunction declined，which cytomembrane maybe withitsmembrane Can or combination 2、Through receptor--TLR4(LPSdirectly ofMCP--1inDSCatboth leveland indirectlyup??-regulateexpression transcription translation decidual wasdisturbed( level，thus regionalimmunological thefirst ofDSCWas trimester，MCP一1 3、Meanwhile，during expression MCP-1anessentialroleintheoccurrenceand up??regulated，whichsuggestedplays maintenanceofnormal pregnancy( of1 and could the 4、Moreover，combination 7-p-Estradiolprogesteroneaugment effectofLPSon isindicativeofthe ofMCP一 1 the DSC，which importanceduring relatedtodecidual inflammatory immunologicalsystem( process words:Decidualstromal MCP一1 hormones; LPS; Key cells;Passage;Sex 6 山东大学硕士学位论文 英文缩写词表 英文缩写 英文全称 中文名称 E 17一p-Estradiol 雌激素 P progesterone 孕激素 P1 1 传代一次 passage P3 3 传代三次 passage CK(7 7 细 胞角蛋白7 eytokeratin MCP(1 chemoattractant 单核 细胞趋化蛋白(1 monocyte protein-1 LPS lipopolysaccharide 脂多糖 CCl也 C-C C(C 趋化细胞因子因子受 receptor-2 体(2 DSC decidualstromalcell 蜕 膜基质细胞 TLR4 toll-like Toll样受体(4 receptor-4 PBS bufferedsaline 磷酸 盐缓冲液 phosphate FCM flow 流 式细胞术 c”ome蚵 RT-PCRreverse 逆 转录多聚酶链反应 transcription??polymerase chainreaction ELISA linkedimmunosorbent 酶 联免疫吸附测定 enzyme assay 7 山东人学硕十学位论文 细菌内毒素脂多糖对人蜕膜基质细胞单核细胞趋化蛋白一1表 达 影响的研究 _?‘-?鱼 莉 置 妊娠是一个复杂而精妙的过程，它既指母体孕育胎儿的状态，也是胎儿在母 体内发育成熟的过程。从免疫学角度讲，妊娠相当于成功的半同种异体移植，胎 儿在妊娠期不受排斥是因为胎盘的免疫屏障作用、母体内免疫抑制细胞和免疫抑 制因子的作用【【1’2】。正常情况下，胎儿与母体之间保持一个稳定的免疫平衡，母 体蜕膜免疫系统在胎儿耐受与抗感染间也保持平衡。一旦由于某种原因如细菌、 病毒感染等导致该免疫平衡失调，即可能导致病理妊娠如流产、胎儿畸形、子痫 前期――子痫等的发生。因此，正常妊娠的维持有赖于蜕膜局部免疫系统乃至全 身免疫系统正常协调的运作【3’4，51。 子宫内膜是女性生殖器官的重要组成部分，妊娠后，蜕膜化的子宫内膜和发 育着的滋养层细胞共同构成了母(胎界面【6l。孕期蜕膜作为母胎界面的重要组成 部分，具有其特殊性。一方面，需耐受胚胎植入，避免母体免疫排斥损害胎儿。 同时由于女性生殖系统的解剖特点，其又易受病原体侵袭，需及时控制控制感染 以免妊娠微环境改变而影响胎儿发育。正常妊娠的维持需要蜕膜免疫系统适度活 化，细胞因子和趋化因子是蜕膜免疫系统的重要调节因子【7，8】。 MCP(1为首个鉴定的C(C基序趋化因子，可由多种类型细胞分泌，通过与 其主要受体CCR2相互作用，趋化免疫细胞并调节免疫细胞功能， 参与多种疾病 的病理生理过程【9Ao]。MCP(1的作用具有双向性。在多种病原体感染过程中 MCP(1表达均上调，通过选择性募集白细胞、诱导单核细胞分化、增强APC抗 原提呈、促进细胞因子分泌、诱导组织细胞增生等途径促使炎症局限化，清除病 原体【11,12,13,】。在耐受模型中，MCP(1可通过影响免疫调节细胞因子的分泌介导 耐受，参与免疫逃逸【14,15】。 蜕膜基质细胞 DSC 是蜕膜组织最主要的间质细胞，不仅可以为胚胎发育 8 参 山东大学硕士学位论文 志 提供营养，并且可通过多种方式调节母胎界面免疫系统，参与母一胎界面免疫耐 受状态的形成及孕期抗感染，维持妊娠的正常进行116】。妊娠早期DSC高表达 MCP(1及其受体CCR2，且存在自分泌作用【171，同时有研究证实多种炎性细胞因 系统的重要介质，更兼其作用的双向性，在胚胎耐受与抗炎反应的平衡中发挥重 要作用。 G一细菌是女性生殖系统感染的重要致病菌，其内毒素LPS通过与其受体 TLIH复合物 特异性结合，激活靶细胞一系列信号 传导通路，分泌多种细胞 的表达水平及分子活性，影响疾病的病理生理过程‘24-26]。DSC构成性表达TLR4 复合体，该复合体被LPS激活后可刺激IL(8、IFN(丫等细胞因子的分泌，进而对 蜕膜免疫系统进行调节，但其是否影响蜕膜基质细胞MCP(1的表达尚未阐明 [27,28] o 的重要激素，在妊娠时分泌增高数十倍，研究发现雌激素和孕激素可影响多种细 胞因子的表达，但妊娠早期蜕膜基质细胞MCP(1的表达是否受雌激素和孕激素 的影响有关尚未阐1明[29,30】。 早孕时，在妊娠相关激素的协同作用下，蜕膜基质细胞受LPS刺激，其 MCP(1,CCR2表达水平发生变化，进而通过自分泌作用调节其他细胞因子的分 泌，在不打破母胎免疫平衡的状态下抗感染，可能是感染状态下蜕膜一系列病理 生理变化的机制之一，阐明这一机制对于控制妊娠早期感染、减少病理妊娠的发 生具有重要意义。本研究分析了体外模拟孕早期雌、孕激素微环境中LPS对蜕 膜基质细胞MCP(1表达的调控，以期进一步了解感染时蜕膜局部免疫系统的状 态，为流产、FGR、子痫前期一子痫等病理妊娠的防治提供新思路。 另外，体外培养的DSC为本实验的研究对象，然文献报道DSC培养方法不 一，本实验室在前期试验过程中也发现不同培养方法的DSC其检测指标有所差 异，因此我们对DSC的体外培养进行了探讨，以使体外实验尽可能于体内生理 病理过程接近。 9 山东大学硕士学位论文 材料和方法 一、主要试剂与仪器 1(1主要试剂: l、RPMI 1640培养基 中国Hyclone生物化学制品有限公司 2、胎牛血清 美国GIBCO公司 3、胰酶 美msigma公司进口分装 山东爱博公司 4、胶原酶 美I雪sigma公司 5、Progesterone 美I$1sigma公司 6、13-Estradiol 美I雪sigma公司 7 鼠抗人单抗 福建迈新 7、Cytokeratin 8、Vimentin 鼠抗人单抗 北京 中山 9、生物素标记的二抗 英国DAKO公司 10、DAB显色试剂盒 福建迈新 11、新生牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司 12、Trizol 上海生工生物工程有限公司 Life 13、RT-PCR试剂盒 美国FermentasScience公司 14、CalibrateBeads 美国BD公司 15、MCP(1 ELISA试齐U盒 美国Biosource公司 16、PE(CCR2流式抗体 美国R&D Inc公司 system 17、APC(TLR4流式抗体 美国eBiosicence公司 18、LPS Escherichiacoli 美I垂Isigma公司 19、PBS溶液 20、SYBRGreenrealtimePCRmastermix 日本ToYOBO公司 21、HEPES 生工生物工程 上海 有限公司 22、D(Hank’S 链霉素，多聚甲醛，过氧化氢溶液，苏木素，酒精，异丙醇，DEPC，DNAaseI， 10 山东大学硕士学位论文 DNA Mix。 Oligo dT ，TaqPolymerase，琼脂糖，TAE溶液，M―MLV，EasyTaq 1(2主要试剂配制: 1、RPMI 1640培养基:取分装的RPMI1640粉剂一包倒入三角烧瓶，力H500ml DDW，摇动使其溶解。准确称量NaHC03 2(0009，HEPES2(3839，溶于上述溶 la 生物安全柜内0(22m滤膜过滤，一20?保存。 2、PBS溶液:准确称量NaCl 8(009、Na2HP04??12H203(499、 KH2P040(209、KCl 压灭菌后于4"C保存。 lam 以D(Hank’S定容 至200ml，0(22 4?存放6h，待其充分溶解后，调pH至8(0， 滤膜过滤，存于4?或一20?。 RPMI 1640 培养基中，4? 4、0(1,胶原酶:准确称取胶原酶100mg，溶于100ml 过夜， 0(22lam滤膜过滤，保存于4?或一20?。 0C冰 用无菌PBS调节体积至100ml，配制成1X10。3M的储存液。?取200ul1×10。M的 P，以RPMI 500ullxl0‘5M的P，以RPMI 1640培养基调节体积至5ml，稀释lO倍，配制为1×10击 M的储存液。 x10,M、lx10石M、l 存。再分别配制浓度为1 x10,M， 保于40C冰箱保存待用。 ?将lml 20ug,ml的储存液，2ml一瓶，分装于10个灭菌的锡箔纸包装 的小青瓶，避光保 7(34x10,mol,1，取300m RPMI 1640培养基，配置成 20u‖ml的存储液，以1(9ml 浓度为l 500u，加入 M的 13-Estradiol x10巧M的13-Estradiol。?取lxl0‘5 4(5m11640培养基，配成浓度为1x10击M 13-Estradiol 13-Estradiol。?取1x10击M RPMI x10。7 500ul，以4(5ml1640培养基配置成浓度为lM的13-Estradiol。 山东大学硕士学位论文 7、LPS-根据说明书，根据说明书，制成lmg,ml的储存液，并分装，避光保存 D(Hank’s溶液于原装瓶中。?待粉末充分溶解后，移至50mL无菌离心管中，再 取lmlD(Hank’s溶液加入原装瓶洗涤后，移至离心管。再向离心管中加无菌 于无菌小青瓶中，锡箔纸包装好，于-20。C冰箱保存。?取lmg,ml的LPS209L， 加入980此RPMI 箱备用。 8、DAB显色液:量取取Buffer 物50tttl，按照说明书配制DAB显色液。 9、D-Hank’S溶液:准确称量NaCl 8(009、KCl0(409、Na2HP04??12H200(1349、 KH2P04 0(0609，NaHC030(359，溶于900mLDDW@，调pH至7(2―7(4，定容至 1000ml，高压灭菌，于4。C保存。 10、TAE缓冲液: "Iris 2429 冰醋酸 37(1ml EDTA200ml 0(5mol,L 11、0(02,的EDTA: Na2EDTA??2H20 O(29 加蒸馏水至1000mL 12、蜕膜基质细胞培养基: RPMI164090mL 胎牛血清 10mL 青霉素钠 1009L 硫酸链霉素1009L 13、3,H202一甲醇: lml 30,H202 甲醇9ml 现配现用 12 山东大学硕士学位论文 14、1,的琼脂糖凝胶: 琼脂糖109 加TAE缓冲液至100mL，加热煮沸溶解，加入EB后即可灌胶。 1(3主要仪器设备: 天平 BP(II型 上海医用激光仪器厂 磁力搅拌器 5―6 北京金北德工贸有限公司 CJN 冰箱 BCD(168K,A 青岛海尔股份有限公司电热恒 光学显微镜 CKX31 日本Olympus株式会社 空气摇床 OST(3000 上海精 宏实验设备有限公司 Heal safe1200 Force生物安全柜 HF 上海力申科学仪器有限公司 16UV,BB5060UV 德国贺力氏 HeraeusC02培养箱 BB SPDl010 德国贺力氏 离心机 Thermo 流式细胞仪 FACSCalibur 美国BD公司 5333 PCR仪 Msater cycler 德国eppendof公司 PACl000 电泳槽 Power 美国Biorad公司 Station2000 美国KODAK公司 柯达成像仪 Image 图像分析系统 WV(Bp330,G 日本Panasonic公司 2(0Real―time Roche公司 LightCycler PCR仪 酶标仪 InfiniteM200 瑞士TECAN公司 紫外分光光度计 UV2450 日本ShiMADZU公司 二、实验方法和步骤 2(1研究对象: 随机选择山东大学齐鲁医院生育门诊因非意愿妊娠要求行人工流产术 的孕6(8周的健康早孕妇女20例，年龄21(38岁，平素月经规律，术前3个月未用 过甾体类激素及抗早孕药物。通过人工流产术，获取新鲜无菌蜕膜组织。本研究 经山东大学齐鲁医院伦理委员会批准，所取标本均经患者同意并签署知情同意 书。 山东大学硕士学位论文 2(2人早孕蜕膜基质细胞分离培养: 参照文献【3l】方法分离、培养人蜕膜基质细胞。将人工流产术获得的蜕膜组 织迅速放入无菌的冰冷的生理盐水中并迅速送至实验室，以含有双抗的冰RPIdI 1640溶液充分洗涤三次，用眼科剪和镊子分离去除血块。完全清除绒毛组织后， 将蜕膜迅速置于无菌小青瓶瓶中，将组织剪碎，使剪碎的组织约lmm3大小。将 原酶体积比为l:1 后，在37?用空气摇床70 rpm振摇20分钟，静置1分钟后， 吸出细胞悬液，以含10,新生牛血清的RPMI1640培养液终止消 化，培养瓶底部 后静置1分钟，吸取细胞悬液终止消化。残留的蜕膜进行第三次消化，分别加入 悬液，终止消化。将三次所获的的细胞悬液混匀，先经120目筛网过滤，研磨棒 仔细研磨，再经200目筛网过滤，将滤好的悬液装至50ml离心管，120rpm离心 10min后，弃掉上清，底部细胞团块用含10,胎牛血清及双抗的RPMI1640培养液 重悬，以5×105,mL的密度接种于200mL培养瓶中，37?5,C02培养4h后换液，去 除未贴壁杂细胞成分。部分病例用含雌激素 10。8M,L 和孕激素 10‘7M,L 、 含10,胎牛血清及双抗的1640培养液重悬培养及换液。此后每2天换液一次，待 1640培养液重悬。 上述细胞吹打混匀计数后平分为两部分，重新以2(5×105,ml细胞密度接种于 培养瓶中，此即为第一代细胞 P1 。24h后，待细胞铺满率达80,，一部分细 胞弃上清，删alll ’s冲洗三遍，加入含10,胎牛血清及双抗的1640培养液，分 5,C02继续培养24,J'-时，收集 为LPS 1lag,mL 刺激组和空白对照组，置37。C 上清以备进行ELISA实验，加入Trizol裂解后冻存于(80?或收集细胞进行流式检 测。另一部分细胞则继续消化传代三次，如此得三代细胞 P3 ，待三代细胞铺 满率达80,，分为LPS束U激组和对照组，置37。C5,C02继续培养24小时，收集上 清与细胞备用。 部分病例基质细胞培养及传代过程中均使用含含雌激素 10‘8M,L 和孕激 14 山东大学硕士学位论文 素 10。。M,L 、含10,胎牛血清及双抗的1640培养基，P1代细胞不予以处理， P3代细胞处理方法同上。 2(3实验方法 2(3(1普通光镜下观察蜕膜基质细胞形态 Hank’S冲洗三遍，加入全培后置于光镜下观察。 2(3(2免疫细胞化学法鉴定DSC纯度 取盖玻片置于六孔板内，将处于对数生长期的蜕膜基质细胞消化后接种于盖 玻片上，六孔板置于37?，5,C02、100,饱和湿度的孵箱内培养，待细胞细胞 铺满率达80,90,时，进行SP法免疫细胞化学染色。简单步骤如下:取出六孔板， PBS溶液冲洗三遍，5分钟每次，用冰丙酮(甲醇 1:1 固定液室温固定细胞30分 钟，以PBS溶液充分洗涤三遍，5分钟每次，然后进行抗原修复。不同抗体其抗 原修复要求不同，根据细胞角蛋白(7一抗的要求，采用胰蛋白酶消化细胞，37? 孵育20分钟后，以PBS溶液冲洗3次，3分钟每次。为阻断内源性过氧化物酶，用 现配的3,过氧化氢溶液室温封闭5(10分钟，然后PBS溶液洗3次，每次5分钟。 继续用25,山羊血清室温封闭20分钟后，PBS清洗玻片，分别加入小鼠抗人波形 l，于4"C孵 蛋1白 200倍稀释 及小鼠抗人角蛋白(7 100倍稀释 单克隆抗体50p 育6h，37?孵箱内复温30分钟后用PBS溶液清洗三次，5分钟每次。再各加入50 tll生物素化的二抗，37"C孵箱内恒温孵育30分钟，PBS洗涤3次×3分钟。将PBS 吸干后加入现配的DAB显色液进行显色，在普通光镜下观察以控制显色时间， 显色满意后以蒸馏水洗涤，苏木素复染2分钟，迅速过盐酸，再过70,、80,、 95,酒精各一次，100,酒精2次，每次漂两下，过二甲苯溶液2次进行透明处理。 待标本自然风干后，将有细胞的一面向下，用中性树胶封片，普通光学显微镜下 进行观察、拍照记录。将PBS溶液代替一抗设置为阴性对照。随机取5个非重复 视野，若细胞质内或细胞膜上出现棕黄色颗粒则视为阳性，计数每一个视野阳性 细胞数，分别计算阳性细胞百分比，并取其平均值以代表细胞纯度。 2(3(3流式细胞术检测蜕膜基质细胞表面CCR2、TLR4的表达 收集培养的Pl、P3代蜕膜基质细胞，0(25,胰酶消化后，将所收集的细胞制 成PBS细胞悬液，显微镜下进行细胞计数，调整细胞数至2×105,ml，标注CCR2 山东大学硕士学位论文 抗体管、TLR4抗体管、空白管，抗体管每管加入PE结合的CCR2或APC结合的 TLR4抗体10 2mL洗 J_tl，然后加入细胞悬液lml，室温避光孵育30分钟，加入PBS 2(8 流式细胞仪检测蜕膜基质细胞表面CCR2或TLR4表达。实验结果 用WiIlMDI 分析软件分析。 2(3(4 RT(PCR检测蜕膜基质细胞MCP(1mRNA的表达 本实验室采用Trizol法裂解细胞，将lmlTrizol溶液加入经过处理的蜕膜基质 细胞后冰浴10分钟，待细胞充分裂解后加入氯仿200p1，剧震15秒。冰浴10分钟， 吸取体积。各管分别加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置lO分钟以萃取核酸 DEPC水溶解RNA。检测总RNA浓度并记录， 据估计总RNA浓度加入201xl一50“l 进行DNAaseI处理:各管分别加总RNA llxg，根据所测浓度计算体积，加入1“l DNase I，37?反应30min，最后加入 10xBuffer，]?11DEPC水至91xl，然后加入1“l llxl lOmM的dNTP 应:各管加入ltxlOligo dT ，70"C5min，4"C冷却。依次加入2pl 5xreaction 37?反应5min。最后加入逆 mix，4“l Buffer，j b JIDEPC水至19I(tl， 体系为201al，其中cDNA1pl，上下游引物各0(81xl。PCR弓I物与反应条件如下:TLR4 GTGGAAGTTGAACGAATGGA， 引物: 上游引物: 下游引物: 引物: 上游引物: 5’(CTCAGCCAGATGCAATCAATGC(3’，下游引物: 5'-CCTCAAGTC 0C保存; PCR产物在1,的琼脂糖凝胶上进行电泳并进行半定量分析，电压80伏，电泳 16 山东大学硕士学位论文 30min。捷达专业数码凝胶成像与分析系统3(3软件进行成像分析，用目的条带灰 度值,B(actin灰度值表示实验结果。 2(3(5实时定量PCR检测DSC中MCP(1mRNA的表达 2(0Real―time PCR仪 Roche公司 按上述方法制得cDNA后，在LightCycler 上进行扩增反应。每例标本设置3个复孔，反应体系101aL，包括:20(L高压水，59L SYBR cDNA。标注MCP(1管与内参管，向MCP(1 mix，上下游引物各11(tL，llxL mix 管中分别加入SYBR40『此，高压水169L，共56此。混匀后吸取281(tL至内参 上下游引物各40(L 引物序列同RT(PCR ，充分混匀。将MCP(1管液体分别加入 3支毛细玻璃管，每管91xL，B(actin管液体同样加入3支毛细玻璃管，最后将lgL 性，95 5min。以三例复孔的平均Ct值代表每例样本的基因产物量，以待测基因值除以内 参值得到检测样本MCP(1基因相对含量。 2(3(6ELISA检测蜕膜基质细胞MCP(1的表达 根据MCP(1ELISA试剂盒按明书进行操作，检测蜕膜基质细胞培养上清中 MCP(1的表达水平。分别收集P1代、P3代细胞对照组与LPS束U激组的培养上清， ul稀释的RDlW，然后分别加入不同组 2000rpm离一t?,10分钟。每孔首先加入100 u 别的上清50l，同时设置空白孔和品系列孔，室温振荡 500rpm 孵育2 lal MCP(1 小时。吸出出每孔中的液体后用清洗液冲洗三次，各孔均加入200 IJ 三次，吸干残余液体，加入底物溶液200l，室温下避光孵育15分钟，最后加入 u 终止液50 根据标准曲线计算MCP(1的含量。 2(4统计分析 实验结果以x+s表示，实验数据用SAS软件进行分析，各组间比较采用 student台(f检验及单因素方差分析，P 0(05为差异具有统计学意义。 17 山东大学硕士学位论文 结 果 一、人妊娠早期蜕膜基质P1代细胞与P3代细胞形态 光镜下观察发现，Pl代细胞轮廓不规则，细胞突起多，呈较长的梭形和不规 则星形，核呈卵圆形，位于细胞中央，核仁清晰，胞浆颗粒丰富，细胞之间相互 连接，边界不清 图1(A ;P3代细胞细胞形态较均一，呈典型或不规则的梭形， 细胞突起少，胞浆颗粒少，细胞较透亮，细胞极性减弱甚至消失 图1(B 。 二，人妊娠早期P1代及P3代蜕膜基质细胞纯度鉴定 分离培养的人蜕膜基质细胞经免疫细