膈下逐瘀汤对大鼠纤维化肝组织CTGFmRNA和PDGF-A蛋白表达的影响

膈下逐瘀汤对大鼠纤维化肝组织CTGFmRNA和PDGF-A蛋白表达的影响 膈下逐瘀汤对大鼠纤维化肝组织CTGFmRNA和PDGF-A蛋白表达的影响 基础医学CHINAFOREIGNMEO『CAL墨固而圄誓U幽 膈下逐瘀汤对大鼠纤维化肝组织CTGFmRNA和 PDGF—A蛋白表达的影响? 吴琦'刘哲丞齐晓丹'张英博. (1.齐齐哈尔医学院生化教研室;2.齐齐哈尔医学院药学院;3.齐齐哈尔医学院实验中心黑龙江齐齐哈尔161006) 【摘要】目的观察膈下逐瘀汤对肝纤维化大鼠肝脏组织结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)mRNA和血小板 衍生生长因子(platelet—derivedgrowthfactor,PDGF)--A蛋白表达的影响.方法sprague—Dawley(sD)大鼠60只随机分为空白对照组 (20),模型对照组(刀:=20)和膈下逐瘀汤组(口=20),共3组.用40%四氯化~(carbontetrachloride,cc]4)复制大鼠肝纤维化模型,膈下 逐瘀汤干预l2周后处死大鼠.采用实时荧光定量PCR法检测大鼠肝组织CTGFmRNA的表达,免疫组化染色法检测PDGF--A蛋白表达.结果 模型组CTGFmRNA2一??ct值(3.59?0.52)和PDGF--A积分光密度(IOD)值(23.38?1.55),显着高于正常对照组(分别为1.02?0.23 和15.02?1.34)(P<0.o5),表明模型组CTGFmRNA和PDGF—A蛋白表达上调.与模型组比较,膈下逐瘀汤组CTGFmRNA2一??ct值 (1.62?0.25)和PDGF--AIOD值(18.04?0.83)显着降低(0.05),表明CTGFmRNA表达下调.结论膈下逐瘀汤可能通过下调CTGF mRNA和PDGF—A蛋白的表达而发挥抗肝纤维化作用. 【关键词】膈下逐瘀汤肝纤维化结缔组织生长因子血小板衍生生长因子 【中图分类号】R243:Q7【文献标识码】A【文章编号】1674—0742(201o)o8(c) 一0029-04 肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理基础,也是进一步向肝 硬化发展的中间环节_l】.结缔组织生长因子(connectivetis— suegrowthfactor,CTGF)是近年来发现的一种重要的促纤 维化细胞因子,不仅可以直接刺激成纤维细胞增殖和促进细胞外 基质(extrace11u1armatrix,ECM)合成,还可以专一介导化 生长因子一D(transforma—tiongrowthfactorbeta, TGF—日)的促纤维化作用,其异常表达在肝纤维化的发生发展 中起关键作用.血小板衍生生长因子(platelet—derived growthfactor,PDGF)是结缔组织来源细胞的主要有丝分裂 原,可调控成纤维细胞的分化增殖,具有诱导胶原和其他细胞外 基质成分合成的功能.有研究表明,PDGF与组织纤维化的关系 密切『3].中药复方的作用特点是多种成分和多个靶点的整体调 节,在防治肝纤维化的效果上往往明显优于单味药物或单一成 分.膈下逐瘀汤作为治疗膈下瘀血证的代表方剂,对肝纤维化的 预防,治疗具有良好临床基础[4].因此,本课题组利用实时荧光 定量PCR~[:I免疫组化技术,观察了膈下逐瘀汤对大鼠肝纤维化肝 组织中CTGFmRNA和PDGF—A蛋白表达的影响,旨在探讨膈下 逐瘀汤防治肝纤维化的作用. 1资料与方法 1.1一般资料 1.1.1药物膈下逐瘀汤取自《医林改错》原方.由五当归 9g,灵脂6g,红花9g,桃仁9g,川芎6g,乌药6g,丹皮6g,赤芍6g, 甘草9g,延胡索3g,枳壳5g,香附5g组成.方药按传统水煎成剂 并浓缩,4?冰箱保存.四氯化碳(CC14分析纯,北京北化精细化 学品有限责任公司). 1.1.2实验动物及分组实验动物及分组雄性SD大鼠60 只,清洁级,体重(200?1O)g,北京维通利华实验动物技术有限公 司购买,许可证编号SCXK(京)2002—0003.将SD大鼠随机分为空白 对照组,肝纤维化模型组和膈下逐瘀汤组共3组. 1.1.3仪器及试剂2700型PCRSystem扩增仪为Applied Biosystems公司产品,uV一2550型紫外分光光度计为日本岛津产品, ABI7300荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品.RNA抽提试剂 RNAiso;~NSYBR(r)ExScript(tm)RT-PCR试齐4盒购自TAKARA公 司.引物由TAKARA公司和合成,其序列如下:GAPDH引物序 歹0:forward5一GACAACTTI,GGCATCGTG—GA-3;reverse5一 ATGcAGGGATGATGTTCTGG一3.CTGF引物序歹U:CTGF~I物序 歹0:forward,5一CACCCGGGTTACCAATGACAA-3Ireverse,5一 AGCCCGGTAGGTCTTCACAC—TG一3;RabbitAnti-PDGF—A和 SABC免疫组化染色试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供. DAB显色试剂盒为福州迈新生物技术开发有限公司产品. 1.2方法 1.2.1肝纤维化模型的建立[】和药物干预模型组N40%CC1 (精制橄榄油配制)皮下注射法,剂量为2mL/kg体重,每周2次,共 12周.空白对照组以生理盐水代替CCl皮下注射,膈下逐瘀汤组按 7.0g?kg?d灌胃给予膈下逐瘀汤,每天1次,连续l2周.空白对 照组和模型组给予等体积蒸馏水,给药方法同模型组. ?作者简介:吴琦(1975,):男,黑龙江齐齐哈尔人,硕士,讲师,齐齐哈尔医学院生物化学教研室,研究方向:分子生物学. 刘哲丞(1980-):男,黑龙江齐齐哈尔人,本科,助理实验师,齐齐哈尔医学院生物化学实验室,研究方向:生物化学. 齐晓丹(1981,):黑龙江齐齐哈尔人,研究生,助教,齐齐哈尔医学院生物化学教研室,研究方向:分子生物学. 张英博(1973-):男,黑龙江齐齐哈尔人,研究生,副研究员,高级实验师,齐齐哈尔医学院中心实验室,研究方向:中医中药. CHINAFOREIGNMEDICALTREATMENT中外医疗29 墨固. CycleNumber CycleNumber 基础医学 1.2.2大鼠肝脏组织CTGFmRNA~达水平检测治疗结束后 第2天,每组随机取5只大鼠,戊巴比妥钠麻醉取肝脏后处死.用RNA~o Reagent(TaKaRa公司艉取肝组织总RNA,利用紫外分光光度分析及琼 脂糖凝胶电泳检测总RNA的含量,纯度及完整性.按SYBR(r)ExScript (tm)RT-PCRia~]盒方法将肝组织RNA逆转录成cDNA,cDNA中取1个 样本进行梯度稀释作为绘制标准曲线的样本,与其余样本同时进行PCR 反应.PCR反应采用sYBRPremixExTaq(PerfectRealTime)kit 试剂,反应体系为20L.热循环:95"C预变性lOs,共1个循环.95"C变性 5s,60?退火31s,40个循环.分别扩增GAPGH和CTGF,每个样本作2个 复孔,获得到2组ct,qz均值.用基于2一??Ct方法进行相对定量分析[61. ?ACt=(Ctl~的基因一ct管家基因)实验组-(ctN的基因-Ct管家基因) 对照组. 1.2.3大鼠肝组织PDGF—A蛋白质表达水平检测治疗结束 后第2d,每组都随机选出6只大鼠取肝组织,用4%多聚甲醛固定,石 蜡包埋,切片.采用SABC法进行免疫组化染色,石蜡切片脱蜡水化, 经0.3%H,O,室温25min灭活内源性酶,微波炉加热抗原修复.用5% BSA封闭液室温封闭20min,JJpPDGF—A抗体4"C冰箱过夜,滴加生物 素化山羊抗兔IgG37?20rain,滴加试剂SABc37?20min,以上 各步骤间均用0.02MPBS漂洗3次,DAB显色后苏木精淡染胞核,常 规脱水,透明,封片,光镜下观察,棕色着色处为阳性,对照组用未免 C.D— elt— aRnvsCycle. ,一 .\ .,-_L_二 {,入/|7 \, 一11— 13579"1315171921232527293133353730 一CycleNumber 图1各组样本CTGFmRNA的扩增曲线(A.空白对照组;B.模型对照组;C.治疗组) 3O中外医疗CHINAFOREIGNMEDICALTREATMENT . 基础医学CHINAFORElGNMEDlCAL盛固 疫的兔血清代替一抗,其他步骤相同.采用MoticMed6.O数码医学 图像分析系统,对每个统计场PDGF—A阳性细胞的积分光密度(IOD) 进行测量. 1.2.4统计方法数据资料用(j4-s)表示,采用SPSS14.0统 计分析软件,所有数据进行正态性和方差齐性检验,组间差异采 用单因素方差分析,组间两两比较用SNK检验法. 2结果 2.1膈下逐瘀汤对肝纤维化大鼠肝脏组织CTGFmRNA表达的 影响(图1和表1) 2.2膈下逐瘀汤对肝纤维化大鼠肝组织PDGF—A蛋白的影响 各组大鼠肝组织均见PDGF—A阳性细胞(图2),通过MoticMed 6.0数码医学图像分析系统分析各组IOD(图3). 3讨论 慢性肝病在我国的发病率很高,日益威胁我国人民的健康,其 中肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化的共同途径.在对慢性 乙型肝炎等原发疾病尚无有效病因治疗方法的情况下,减缓或阻 止肝纤维化进程是很重要的治疗对策.肝纤维化属中医"积聚"范 畴,中医药在防治肝纤维化方面积累了大量的临床经验,利用中药 多成分和多靶点的特点,从疗效确切的药方中寻找新的治疗效果 好,毒副作用较小的抗肝纤维化药物,是我们国家创制自主知识 产权新药物的捷径.膈下逐瘀汤出自清代医家王清任的《医林改 错》,临床应用比较广泛,对肝纤维化的治疗有良好的效果. 目前认为,肝纤维化是可以逆转的,在纤维化过程中肝星状细胞 (helmticstellatecell,HSC)活化起着重要的作用,而HSC活化主要涉 及一系列细胞因子的作用【7】.其中PDGF是目前已知的HSC最强丝裂 原,也是HSC迁移最有力的促进因子,对HSC的活化,增殖和迁移均有 明显的促进作用.PDGF~g够促进活化HSC产生胶原,尤其是I型和m 性胶原,PDGF还可以抑制胶原酶活性,减少细胞外基质(extraceUular matrix,ECM)的降.在肝纤维化的发生,发展过程中,PDGF的表达 明显高于正常肝组织,其活性随肝纤维化程度加重而升高,尤其在肝 (A,正常对照组:B.模型对照组;C.中药图2各组PGGF—A免疫阳性细胞IOD照片 组) CHINAFOREIGNMEDICALTREATMENT中外医疗31 匿固.2010一NO.24 星状细胞(helmtic~21ate0ell,HSC)内的表达量与肝纤维化程度呈显着 正相关.CTGF为PDGF的下游因子,是一种富含半胱氨酸的多肽,其主 要生物学效应为促进细胞增殖,参与细胞转分化过程和ECM的产生,诱导 黏附,参与组织的创伤修复.在正常状态下表达水平很低,且其作用限于 结缔组织,因此,阻断F表达或抑制其活性,将有望成为一种更特异, 更有效的长期防治肝纤维化的手段?明. 本课题组分别采用SYBRGreenI实时定量RT-PCR法和免疫 组织化学染色法检测各组大鼠肝组织cTGFInRNA和PDGF—A的表 达,结果显示,各组均有CTGFmRNA和PDGF—A的表达.模型对照 组与空白对照组相比cTGFrINA和PDGF—A的表达显着增加i膈 下逐瘀汤干预组与模型对照组相~LCTGFmRNA和PDGF—A的表达 则降低,因此,我们认为膈下逐瘀汤可调控肝组织CTGFmRNA;~N PDGF-A蛋白分子的表达,从而延缓甚至抑制肝纤维化的进程. 参考文献 [I]薛博瑜,胡荣昕,孙丽霞.中医药治疗肝纤维化临床研究思路 探讨[Jj.中华中医药杂志,2007,22(8):540,542. 【2】LiG,XieQ,ShiY,eta1.Inhibitionofconnectivetissuegrowthfac— torbysiRNApreventsliverfibrosisinrats[J].JGeneMed,2006,8 (7):889,900. [3】谢世平,司富春,赵君玫,等.鳖甲煎丸对免疫性肝纤维化大 鼠胶原及相关细胞因子表达的影响fJ】.中国医药,2004, 19(7):412,415. [4】刘红臣.膈下逐瘀汤治疗肝脏疾病332例观察[J】.实用中医内 25 2O 誉 15 10 (9 0 5 O 基础医学 科杂志,2005,l9(4):365. 【5]刘莺,刘平,胡义扬,等.纤维化大鼠肝组织与物质代谢相关 蛋白质动态变化及扶正化瘀方的调节作用[J].中国中西医结 合杂志,2006,26(3):224,227. [6】KennethJ,LivakK,ThomasD,eta1.Analysisofrelativegeneex- pressiondatausingreal—timequantitativePCRandthe2(一Delta DeltaCt)method[J】.Methods,2001,25(4):402,408. [7】LeeJS,KimJH.Theroleofactivatedhepaticstellatecellsinliver fibrosis,portalhypertensionandcancerangiogenesis[J].KoreanJ Hepatol,2007,13(3):309,319. [8】GonzaloT,BeljaarsL,vandeBovenkampM,eta1.Localinhibition ofliverfibrosisbyspecificdeliveryofaplatelet—derivedgrowth factorkinaseinhibitortohepaticstellatecells[J]-JPharmacolExp Ther,2007,321(3):856,865. [9】CzochraP,KlopcicB,MeyerE,eta1.Liverfibrosisinducedbyhe- patiooverexpressionofPDGF-Bintransgenicmice[J].JHepatol, 2006,45(3):419,428. [10]RockeyDC.Antifibrotictherapyinchronicliverdisease[J].Clin GastroenterolHepatol,2005,3(2):95,107. 空白组模型组中药组 图3各组大鼠肝脏组织;PDGF-A表达水平比较(,6) 注:与模型组比较:P<0.05 表1各组大鼠肝脏组织CTGF基因表达相对值比较(i?n=5) 注:与模型对照组比较,P<0.05 32中外医疗CHINAFOREIGNMEDICALTREATMENT 【收稿日期】2010--06--08