【doc】电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血再灌注后脑内神经干细胞增殖的影响

【doc】电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血再灌注后脑内神经干细胞增殖的影响 电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血再灌注 后脑内神经干细胞增殖的影响 中国康复医学杂志,2008年,第23卷,第3期ChineseJournalofRehabilitationMed&ine,Mar.2008,Vo1.23.No.3211 ? 基础研究? 电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血再灌注后 脑内神经干细胞增殖的影响 黄艳君l'z.罗勇1,2,4 摘要目的:研究电刺激小脑顶核(FNS)对成年大鼠局灶脑缺血再灌注后脑内不同部位,不同时间点神经干细胞增 殖的变化规律,探讨FNS治疗缺血性脑损伤的作用机制.方法:雄性Wistar大鼠随机分为正常组(NC组),假手术组 (SC组),局灶脑缺血再灌注组(I/R组),局灶脑缺血再灌注+小脑顶核假刺激组(I/RFs组),局灶脑缺血再灌注+小脑 顶核刺激组(I/RF组),每组根据再灌注时间的不同又分为第l,3,7,l4,2l,28天6个亚组(n=6).缺血时间均为lh/ 再灌注,于再灌注后立即刺激对侧小脑顶核lh.采用线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉局灶脑缺血再灌注模型.结果: 局灶脑缺血再灌注后不同时间点Brdu阳性细胞在缺血侧侧脑室区,海马齿状回的达均有增加,呈单峰变化趋势. 第l天开始增加(P<O.01),第7天达到高峰(P<O.01),第l4天后下降(P<O.01);第2l,28天时已明显下降(P<O.05), 而FNS后,Brdu阳性细胞数量在缺血/再灌注基础上增加更加明显(P<O.05,P<O.01),第7天达到高峰(P<O.01),峰值 更高,第l4天后仍维持在较高水平(P<O.01),第2l天后逐步下降(P<O.05),第28天已明显下降;且引起整个侧脑室 和海马齿状回,颗粒下层,锥体细胞层细胞增殖.Brdu阳性细胞有明显形态改变.结 论:FNS可促进局灶脑缺血再灌 注后脑内侧脑室和海马Brdu阳性细胞的增殖,提示这种作用可能是FNS治疗缺血 性脑损伤的重要作用机制之一. 关键词局灶脑缺血再灌注:神经干细胞;电刺激,小脑顶核 中图分类号:R364.1.R454.1文献标识码:A文章编号:100l—l242(2008)一03—02ll 一05 Effectofelectricalstimulatingtofastigialnucleusonproliferationofneur~stemcellinbrainofadultrat afterfocalcerebralANGYanjun.LUOYong//ChineseJournalofRehabilitation Medicine,2008,23(3):2ll一2l5 AbstractObjective:Tostudytheinfluenceofelectricalstimulatingtofastigialnucleusontheproliferation regularityofexpressionofBrduinadultratbrainafterfocalcerebralischemiaandtoexplorethemechanismof fastigialnucleuselectricalstimulation(FNS)intreatingischemicbraininjury.Method:Theratswererandomly dividedintofivegroups:normalcontrolgroup(NCgroup),shamoperationcontrolgroup(SCgroup),ischemia/ reperfusiongroup(I/Rgroup),ischemia/reperfusiontreatedwithshamFNSgroup(URFsgroup),andischemia/ reperfusiontreatedwithFNSgroup(I/RFgroup),eachgroupcontainedthe1st,3rd,7th,14th,21st,28thdsix timepoints.ateachpointn=6.Animalmodelsoffocalcerebralischemia/reperfusionweremadebyfilament occlusionoffightmiddlecerebralartery.Result:Afterfocalcerebralischemia/reperfusion,thenumberofBrdu positivecellsincreasedateachtimepoint,reachedsmallpeakvalueatthe7thd(P<0.01).WithFNS,thenumber ofBrdupositivecellsincreasedmorestrikinglyateachtimepoint(P<O.05,P<O.01),rea chedhigherpeakvalueat the7thd(P<0.01).Conclusion:Fastigialnucleuselectricalstimulationcanpromotethepro liferationofBrdupositive cellsinsomebrainregionsafterfocalcerebralischemia/reperfusion,whichmightbeoneofth eimportant mechanismsoffastigialnucleusstimulationintreatingischemicbraininjury. AuthorsaddressDept.ofNeurology,theFirstAffiliatedHospital,ChongqingUniversityof MedicalSciences, ChongqingKeyLaboratoryofNeurology,Chongqing,400016 Keywordsfocalcerebralischemia/reperfusion;neuralstemcell;electricalstimulation;fasti gialnucleus 缺血性脑血管病为临床常见病,多发病.以局灶 脑缺血最为多见.目前国内外对缺血性脑血管病的 治疗取得了一些成果.但仍不尽如人意.因此,寻找 新的治疗方法和有效的干预策略成了当前神经科学 领域研究的热点和难点.侧脑室外侧壁的室下带 (subventrieularzone.SVZ)和海马齿状回(dentate gyrus.DG)的颗粒下层是所有哺乳动物(包括人类) 脑内的2个神经干细胞富集区.这两个区域在成年 还存在着持续的神经发生现象I】1.神经干细胞具有自 我更新和多分化潜能.为治疗脑血管病等疾病造成 的神经功能缺失提供了新的思路.既往研究已经证 实.小脑顶核电刺激(fastigialnucleuselectrical 基金项目:重庆市科委攻关项目(渝科发计字[2003143号文,2003— 7),重庆市卫生局科研项目(渝卫科教[200513l号文,编号:2005—2— 179) l重庆医科大学附属第一医院神经内科,400016 2重庆市神经病学重点实验室 3四JlI省绵阳市第三人民医院神经内科 4通讯作者:罗勇(重庆医科大学附属第一医院神经内科,400016) 作者简介:黄艳君,女,硕士,主治医师 收稿13期:2o07一l2—5 212中国康复医学杂志,2008年,第23卷,第3期 ChineseJournalofRehabilitationMed&ine,Mar.2008,Vo1.23,No.3 stimulation,FNS)能启动内源性神经保护机制,产生 广泛,持久的神经保护作用,但机制尚未完全明了. 本实验通过动态观察FNS对成年大鼠局灶脑缺血 再灌注后缺血侧侧脑室和海马神经干细胞增殖水平 的影响,以进一步了解FNS的神经保护作用及其神 经修复机制. 1材料与方法 1.1实验动物及分组 健康雄性Wistar大鼠180只,体重250--300g. 由重庆医科大学实验动物中心提供.大鼠术前12h 禁食不禁水.随机分为5组:正常对照组(NC组),假 手术组(SC组),局灶脑缺血再灌注组(I/R组),局灶 脑缺血再灌注+小脑顶核假刺激组(I/RFs组),局灶 脑缺血再灌注+小脑顶核刺激组(I/RF组),每组根 据再灌注时间的不同分为第1,3,7,14,21和28天 6个亚组(n=6),涉及缺血/再灌注动物均为缺血1h. 1.2大鼠大脑中动脉局灶脑缺血再灌注模型制备 根据Longa等121报道的方法,参照罗勇等131的经 验,采用线栓法制备右侧大脑中动脉局灶脑缺血再 灌注模型;栓塞成功的大鼠缺血1h,再次麻醉,拔出 线栓至颈外动脉残端内,实现再灌注(假手术组只进 行类似模型操作,但不插入丝线).模型成功:左 侧肢体疼痛回缩迟钝或消失,提尾倒悬时左上肢向 胸前屈曲,行走时向左侧倾倒或向左转圈;右侧出现 霍纳(HonerS)征.排除标准:神经学症状评分低于2 分者(评分标准参照1.4神经症状学评分);蛛网膜 下腔出血者;HE染色无缺血病理改变者:未到观察 时相点便死亡者.凡因各种因素导致各实验组动物 数不足预定数量者通过随机抽样原则补齐. 1.3电刺激小脑顶核 大鼠固定在立体定向仪上.根据Wistar大鼠脑 立体定向图谱结合鼠的大小确定小脑顶核的适当位 置,一般小脑顶核坐标为:以前囟后缘为零点,正中 线向后11.4—11.8mm.旁开O.8—1.Omm,深5.2— 5.7mm:于颅骨上钻1个孔,将同心圆电极插入病灶 对侧小脑顶核(选左侧).采用SEN一7233三通道电 子刺激器(13本),电流强度为501xA,频率为5O一 100Hz,时程为0.5ms的直角方波脉冲;于再灌注后 立即给予电刺激,持续时间1h;刺激过程中动物均 处于浅麻醉状态.假刺激组操作同小脑顶核刺激组, 电极插入小脑顶核但不通电流刺激,只留针1h. 1.4神经症状学评分 参照ZeaLonga5分制评分标准,大鼠清醒后 评分:O分,无神经功能缺失症状;1分,轻度局灶性 神经功能缺失(不能完全伸展左侧前肢);2分:中度 局灶性神经功能缺失(向左侧转圈);3分:中度局灶 性神经功能缺失(向左侧倾倒);4分:不能自发行 走,意识水平降低.评分时间点:于局灶脑缺血再灌 注后第1h,6h,12h,ld,3d,7d进行评定. 1.5神经干细胞标记 5一溴脱氧尿嘧啶核苷(5一bromo一2一deoxy, uridine,Brdu)是胸腺嘧啶的类似物,在细胞增殖周 期S期可以整合到细胞核DNA中,是一种细胞增殖 的标识物,常用来标记体内增殖的神经干细胞.用 法:用生理盐水稀释后腹腔注射:手术麻醉苏醒后 2h第1次给药,每天2次,间隔12h.时间点:手术当 天,手术后第2,6,13,2O,27天,在最后一次注射后 24h内处死动物;用量:50mg/kg. 1.6固定,取材,切片 实验动物到达观察时相点之后.经左心室常规 灌注固定,开颅取脑,由前向后作冠状切片,取经侧 脑室(包含室管膜下区)及海马中心脑组织块各1 块,行固定,脱水,浸蜡,包埋,石蜡切片(片厚 4m),用于HE染色,免疫组化检测.取材部位:侧 脑室(AP前囟一0.30mm至前囟一1.2mm),海马(AP 前囟一3.14至前囟一4.5mm). 1.7免疫组织化学检测Brdu阳性细胞(SABC法) 切片常规脱蜡至水,复合消化酶室温下孵育,蒸 馏水冲洗;5O%甲酰胺/2xSSC65oC孵育,2xSSC冲洗; 2N,L盐酸37?孵育30min,0.1M硼酸(pH8.5)室温 下孵育lOmin,1%过氧化氢室温下孵育15min,封闭 液室温孵育2h,甩去多余液体,勿洗;小鼠抗大鼠 Brdu抗体(1:200,武汉博士德)4?过夜,生物素化山 羊抗小鼠IgG(武汉博士德)25~C孵育2h,SABC室温 下孵育2h,DAB显色,苏木素轻度复染(以上各步前 后用0.O1MPBS冲洗).脱水,透明,封片.阴性对照 用正常羊血清代替一抗.其余步骤同上. 1.8图像分析及统计学分析 切片在统一放大倍数(10x20)下,随机选择1O 个非重叠视野.以缺血侧侧脑室和海马回为观察部 位,每个时相点6只动物,每只动物的每个部位随机 取5张非连续切片.应用重庆医科大学电镜室北航 CM一2000B型生物医学图像分析系统进行自动计算 平均阳性细胞数,所得数据用均数?标准差表示,采 用SAS8.2统计软件进行统计学处理.选择P<O.05 为差异有显着性.P<O.O1为差异有非常显着性. 2结果 2.1电刺激小脑顶核(FNS)对脑缺血后大鼠神经功 !垦壅墨堕兰垄查!!笙堂!笙塑!型!丝堕:竺:!!!:望!!:! 能缺损的影响较差异无显着性(P>0.05),但I/RF组各时间点神经 大鼠脑缺血1h后均出现神经功能缺损,各组间功能评分均低于I/R组和I/RFs组. 比较差异有显 比较差异无显着性意义(P>0.05),说明各组脑缺血着性(P<O.05,P<O.O1), 提示FNS能有效改善大鼠脑 状况基本一致;随着缺血/再灌注时间的延长,各组缺血再灌注后的神经功能缺损, 见表1. 神经功能缺失症状逐渐减轻;I/R组和I/RFs组比2.2Brdu阳性细胞检测 2.2.1缺血侧侧脑室区Brdu阳性细胞计数及FNS 对其影响 2.2.1.1Brdu阳性细胞随时间的数量变化规律:正 常侧脑室区域Brdu阳性细胞主要分布在脉络丛,室 管膜,SVZ,细胞数量极少.局灶脑缺血再灌注后,缺 血侧侧脑室区域Brdu阳性细胞数量随着再灌注时 间延长呈现出单峰变化趋势,即第1天时开始增加 (P<O.05),第3天时增加明显(P<O.O1),第7天时达 峰值(P<O.O1),第14天后逐步下降(P<O.O1),第28 天时已明显下降(P<O.05);I/R组和I/RFs组两组 变化相似,各对应时间点比较差异无显着性(P> O.O5),而FNS后,I/RF组Brdu阳性细胞的表达虽具 有同样趋势,但在每一时间点上.Brdu阳性细胞的 数量增加明显,与I/R组和I/RFs组在第1,3,7,14 天时间点比较,差异有非常显着性(P<O.O1),在第 21,28天比较,差异有显着性(P<O.05),而与NC组 和SC组各对应时间点比较,P<O.O1,见表2. 2.2.1.2Brdu阳性细胞随时间的形态变化规律:正 表2各实验组侧脑室区Brdu阳性细胞数(互,I~IFIB2200倍视野,,n=6) ?与sc组比较P>O.05;?与I/RFs比较P>O.05?与Ns组和sc组比较 P<O.05;?与Ns组和sc组比较P<O.Ol;?与I/R组和1/RFs组比 较P<O.Ol 常侧脑室区域,Brdu阳性细胞分布在室管膜上的为 单层柱状上皮,在SVZ呈散在分布,细胞数量极少. 局灶脑缺血再灌注后第1天.I/R组,I/RFs组分布在 室管膜上的Brdu阳性细胞增厚.变为两层或多层, 分布在SVZ区的Brdu阳性细胞可见呈成对和直线 排列的细胞;而I/RF组在室管膜上的阳性细胞增殖 更加明显,在SVZ区的Brdu阳性细胞成簇,成团更 加明显,细胞核深染.局灶脑缺血再灌注后第3天, I/R组,I/RFs组分布在室管膜上的Brdu阳性细胞继 续增厚为多层,在SVZ区的阳性细胞成簇,成团,而 I/RF组Brdu阳性细胞增殖更加明显.局灶脑缺血再 灌注后第7天,随着I/R组,I/RFs组,I/RF组Brdu 阳性细胞增殖到达高峰,室管膜上和SVZ区阳性细 胞形态呈多样化改变,可见两种Brdu阳性细胞:一 种反应强烈,染色为深棕色,另一种反应较弱,染色 相对较浅:核的形态有圆形,椭圆形和杆状三种.I/R 组和I/RFs组常见成对存在的杆状或椭圆形细胞核 的阳性细胞;而I/RF组成对存在的杆状或椭圆形细 胞核的阳性细胞数目增多,细胞核体积变大,管膜扩 增更明显,阳性细胞核反应显着增强,大部分细胞深 染为棕黑色.一部分阳性细胞聚集在侧脑室前外侧 角,成簇,成团更加明显;局灶脑缺血再灌注后第14 天,I/R组,I/RFs组阳性细胞反应程度减弱,室管膜 细胞分层现象也减弱.而I/RF组变化不明显:缺血/ 再灌注后第21天,I/R组,I/RFs组室管膜上阳性细 胞分层现象消失,I/RF组室管膜上阳性细胞分层现 象仍然存在,缺血/再灌注后第28天,Brdu阳性细 胞已接近正常状态. 2.2.2缺血侧海马Brdu阳性细胞计数及FNS对其 影响 2.2.2.1Brdu阳性细胞随时间的数量变化规律:正 常大鼠海马区域存在少量的Brdu阳性细胞,局灶脑 缺血再灌注后,缺血侧海马Brdu阳性细胞数量随着 再灌注时间延长呈现出单峰变化趋势,即第1d时开 始增加(P<O.05),第3天增加明显(P<O.O1),第7天 达峰值(P<O.O1),第14天后逐步下降(P<O.O1),第 28天已明显下降(P<O.05);I/R组和I/RFs组两组变 化相似,各对应时间点比较差异无显着性(P>O.05), 而FNS后.I/RF组Brdu阳性细胞的表达虽具有同 样趋势,但在每一时间点上,Brdu阳性细胞的数量 !!垦壁墨垦兰墨查!竺!笙垫堂!篁塑!型!垄!!!!:望!!: 增加明显,与I/R组和I/RFs组在第1,3,7,l4天时SC组各对应时间点比较,差异有 非常显着性(P< 间点比较,差异有非常显着性(P<0.01),在第2l天,0.01)(表3). 28天比较,差异有显着性(P<0.05),而与NC组和2.2.2.2Brdu阳性细胞随时间的 分布和形态变化规 表3各实验组海马Brdu阳性细胞数(;,n/mm2,200倍视野一,n=6 ?与sc组比较P>0.05;?与I/RFs比较P>0.05;(与Ns组和sc组比较 P<0.05;(与Ns组和sc组比较P<0.Ol;?与I/R组和I/RFs组比较 P<0.0l 律:正常大鼠海马区域存在少量的Brdu阳性细胞. 主要分布于颗粒细胞层和门区.细胞排列稀疏.局灶 脑缺血再灌注后第1天.I/R组和I/RFs组阳性细胞 略有增加.而I/RF组增加明显.可看到增殖的Brdu 阳性细胞成对,成团排列;局灶脑缺血再灌注后第3 天.随着阳性细胞数量继续增加.阳性细胞分布在齿 状回,颗粒下层,锥体细胞层.而I/RF组分布在齿状 回的阳性细胞形成非连续性排列:局灶脑缺血再灌 注后第7天.Brdu阳性细胞增殖达高峰.阳性细胞 成队,成团主要表现为两种模式:一类细胞呈丛集 性.细胞核形态不规则:另一类细胞呈单个或两个. 无丛集性.但细胞核形态相对比较规则:I/R组和I/ RFs组以这两种形式为主.而I/RF组阳性细胞"丛 集"现象更加明显.沿齿状回的颗粒下层非连续性排 列.一些Brdu阳性细胞从颗粒细胞下层迁移至颗粒 细胞层.细胞核较颗粒细胞下层增大.呈圆形.表现 出成熟颗粒细胞的特征;缺血/再灌注后第l4天.I/ R组和I/RFs组Brdu阳性细胞形态和分布同再灌 注后第7天基本相似;而I/RF组"丛集"现象仍较明 显;缺血/再灌注后第2l天.阳性细胞形态和分布同 再灌注后第1天基本相似.缺血/再灌注后第28天. Brdu阳性细胞已接近正常状态. 3讨论 传统观点认为中枢神经系统在发育成熟和损伤 后不能再生.但近年来研究证实.人类及成年动物神 经系统中均存在神经干细胞.在正常情况下处于静 息状态.在缺血缺氧,外伤,氧化应激等多种因素刺 激下.神经干细胞可再次增殖和分化.参与修复缺损 的神经功能. Brdu是一种胸腺嘧啶脱氧核苷类似物.在细胞 增殖周期S期可整合到细胞核DNA中.被用作神经 干细胞的标识物.其阳性细胞被看成是具有增殖活 性的细胞.本实验证明,在正常成年脑组织侧脑室区 域Brdu阳性细胞仅局限在脉络丛,室管膜,SVZ,且 数量极少.局灶脑缺血再灌注后.I/R组,I/RFs组上 述区域Brdu阳性细胞数量表现为随时间单峰增加 的动态变化趋势.即第1天时开始增加.第3天时 增加明显.第7天达一小高峰.然后迅速下降.第 28天时细胞数量已甚少.这与既往相关研究结果一 致【5-91.但国外一些报道【.Ol细胞增殖达到高峰的时间 是第l4天,和我们略有差别,可能与模型的选择,动 物的种属,缺血时间的不同等有关.本实验观察到, 局灶脑缺血再灌注后再给予FNS.Brdu阳性细胞数 量随时间变化规律与I/R组,I/RFs组基本相似.但 在对应时间点上阳性细胞数量都比I/R组和URFs 组明显增加.且室管膜增殖为两层或多层.阳性细胞 聚集成簇,成团.形态多样.这提示.FNS可以进一步 促进脑内处于"静止"或"休眠期"的神经干细胞分裂 分化的潜能.既往研究大多是将目光集中在损伤侧 脑室前角水平.我们研究结果显示,FNS引起整个侧 脑室包括前角,下角,SVZ增殖.Brdu阳性细胞数量 明显增多.并伴有形态的明显改变.表现出活跃的分 裂相.这提示FNS刺激了整个侧脑室新生细胞增 殖.新生细胞增殖以侧脑室前角水平最为显着.但这 些细胞的来源和分化类型需进一步研究. 本实验还观察到.正常成年海马颗粒细胞层和 门区存在少量的Brdu阳性细胞.细胞排列稀疏.局 灶脑缺血再灌注后Brdu阳性细胞数量变化明显.表 现出与侧脑室区域相似的动态变化趋势,这与国内 外相关报道基本一致[H--I41.本结果显示,FNS后Brdu 阳性细胞数量在各时间点不仅数量明显增加.而且 细胞形态和分布也发生明显变化,尤其在细胞增殖 高峰第7天时.Brdu阳性细胞沿DG的颗粒下层非 连续性排列."丛集"现象更加明显,一些Brdu阳性 细胞从颗粒细胞下层迁移至颗粒细胞层,细胞核增 大呈圆形.表现出成熟颗粒细胞的特征,这种现象一 直持续到第l4天.这说明FNS也可以激活局灶脑 缺血再灌注后海马区域的神经干细胞分裂分化的潜 能.促进神经干细胞增殖.虽然本研究目前没有对 中国康复医学杂志,2008年,第23卷,第3期 ChineseJournalofRehabilitationMed&ine,Mar.2008,Vo1.23,No.3215 新生细胞进一步的分化情况进行深人探讨.但国外 已有研究证明,短暂性脑缺血大鼠齿状回Brdu阳 性细胞约6O%在2周后分化为幼稚神经元【151. 中枢神经再生主要包括神经干细胞的增殖,迁 移和向神经元方向分化3个环节.神经干细胞的增 殖是最基础的一步.强化神经干细胞的增殖可能促 进神经再生.目前认为,SVZ和DG的颗粒下层是所 有哺乳动物(包括人类)脑内的2个神经干细胞富集 区.本研究结果显示,FNS可以明显促进这两个区域 的神经干细胞增殖,不仅促进其数量增加,而且使其 形态也发生明显变化,促进新生细胞向成熟细胞分 化.从大鼠神经功能评分来看,第7天时I/RF组神 经病学评分最低.与对照组比较差异有显着性,表明 FNS促进大鼠患肢功能恢复,与Brdu升高同步进 行.提示FNS后Brdu阳性细胞的表达持续增强,参 与了局灶脑缺血再灌注后神经组织的重建.Zhang 等【l6】却认为.MCAO造成的脑缺血仅能影响SVZ,不 能促进DG细胞的增殖,细胞增殖的标识物Brdu在 大脑皮质也有表达.主要分布在缺血灶周围.本研究 结果显示.FNS不但可促使脑缺血后SVZ的神经干 细胞增殖.也可以促进DG的神经干细胞分裂.说明 FNS所引起的脑保护作用是广泛的.有研究表明.脑 缺血后8O%的新生神经元死亡,只有2O%的新生神 经元存活.存活的新生神经元也只替代了O.2%的坏 死细胞【171.这说明了脑缺血后内源性神经干细胞若 要修复受损的神经功能,需要是一系列基因和蛋白 在时间,空间和浓度上的精确调控.但FNS后产生 的新生细胞能否迁移至缺血损伤区域,能否转化成 有功能的神经元.以及FNS调控神经干细胞的确切 机制有待更深人的研究. 参考文献 [1]GageFH.Mammalianneuralstemcell【J1.Science,2000,287 (5457):1433--1438. 『21LongaEZ,WeinsteinPR,CarlsonS,eta1.Reversiblemiddie cerebralarteryocclusionwithouterani~tomyinrats『J1.Stroke, l989,20(1):84—91. 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