细菌脂多糖诱导小鼠DC2.4细胞TLR7蛋白的表达

细菌脂多糖诱导小鼠DC2.4细胞TLR7蛋白的达 论文范文 目:细菌脂多糖诱导小鼠DC2.4细胞TLR7 蛋白的表达 编辑:司马小 【摘要】 目的: 探讨细菌脂多糖,LPS,对小鼠树突状细胞(DC)系DC2.4 TLR7蛋白表达的诱导作用。方法: 用RPMI1640完全培养液培养DC2.4细胞, 光学显微镜观察LPS刺激前后的细胞形态特征和Western blot分别测定TLR7 mRNA和蛋白表达。结果: LPS刺激前后, 细胞中均有TLR7 mRNA 转录。LPS刺激前, 细胞较小而透亮, 树突较少, 无TLR7蛋白表达; LPS刺激后, 细胞体积增大, 树突增粗增多, 刺激后12 h、24 h、 48 h, TLR7蛋白均有表达, 且在3个时间点的表达量基本一致。结论: LPS可诱导DC2.4中TLR7蛋白的表达。 【关键词】 脂多糖 DC2.4细胞 TLR7 Toll样受体,ke receptors, TLRs,是一种模式识别受体,pattern recognition receptors, PRRs,, 可以识别病原体高度保守的结构基序——病原相关分子模式, molecular patterns, PAMPs,。近年的研究发现, TLRs在抗感染固有免疫和介导获得性免疫应答中起关键作用。Toll样受体7,,主要在树突状细胞,dendritic cells, DC,及巨噬细胞中表达, 可识别单链RNA病毒, 在宿主抗单链RNA病毒,如HIV、 HCV、 流感病毒等,的免疫应答中发挥重要作用。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是Toll样受体4,receptor 4, TLR4,的天然配体, 可诱导DC成熟及强烈的Th1型免疫应答, 最近Severa等研究发现, TLR3和TLR4的活化可增加DC中TLR7 mRNA的表达, 提示同一配体可能活化多种TLRs, 有利于扩大宿主抗病原微生物免疫应答的范围。DC2.4细胞是源于C57BL/6小鼠骨髓DC的一个永生化DC系, 其表面低表达TLR4。为了解LPS对TLR7表达的诱导作用, 我 们以DC2.4细胞为靶细胞, 用LPS刺激, 检测TLR7 mRNA和蛋白表达, 为TLRs介导的固有免疫及其信号转导研究提供重要资料。 1 材料和方法 1.1 材料 RPMI1640培养液购自Hyclone公司; 牛血清购自Gibco公司盒子、 TRIzolTM kit购自Invitrogen公司; Western blot发光 试剂盒、 羊抗鼠一抗,多克隆抗体,、 兔抗羊二抗、 人抗鼠 in一抗(单克隆抗体)均购自美国Santa Cruz公司; RIPA液购自中美泰克公司; DNA marker购自天根公司; 蛋白marker购自TaKaRa公司; 胰酶、 EDTA、 PBS、 LPS均购自Sigma公司; 胰蛋白酶抑制剂cocktail购自Roches公司; DC系DC2.4由美国哈佛大学陈振海博士惠赠, 第四军医大学唐都医院感染科实验室保存。 1.2 方法 1.2.1 DC2.4细胞的培养与LPS刺激 用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640完全培养液培养DC2.4细胞于50 mL培养瓶中, 待细胞长至约80%, 弃培养液, PBS清洗细胞2次, 2.5 g/L胰蛋白酶, 0.2 g/L EDTA消化细胞8，10 min, 血清终止消化后, 以1000 r/min离心5 min, 弃上清, 新鲜培养液重悬细胞, 计数, 按1×108/L的密度接种细胞于2个6孔板中, 37?、 50 mL/L CO2孵 箱培养, 待细胞长至50%，60%, 换新鲜培养液, 同时每孔按1 mg/L的浓度加入LPS, 未加LPS的孔作为阴性对照。 1.2.2 引物合成 根据GenBank上小鼠TLR7及基因的序列, 如下PCR引物: (1)TLR7引物, 上游链 3′, 下游链。上游链下游链 。均由上海生工合成。 1.2.3 DC2.4细胞形态的观察与蛋白提取 分别在加LPS前及加LPS后12、 24、 48和72 h用倒臵相差显微镜观察细胞的形态特征。冷PBS洗涤细胞后, 用已加入蛋白酶抑制剂,cocktail 1?50,的细胞裂解液冰上裂解细胞20 min, 细胞刮刀剔刮培养孔底部, 收集裂解液, 低温离心, 12000 r/min, 10 min, 吸取上清液并分装于1.5 mL离心管中, 标记, 放-80?保存备用。以胎盘组织提取蛋白作为阳性对照。 1.2.4 反转录扩增TLR7基因 以胎盘细胞总RNA作为阳性对照[8], 未加TLR7引物的PCR反应体系作为阴性对照n作为内参照。采用3步法 总RNA的提取: 分别离心收集DC2.4细胞和胎盘细胞约2×106个, 按照TRIzolTM kit提取细胞总RNA, 用紫外分光光度计测定RNA含量。 (2)cDNA链的合成: 参照Invitrogen说明书由random hexamers primers和SuperScriptTM ? RT反应完成。(3)PCR扩增: 取cDNA 4 μL, Taq DNA多聚酶1.25 U, 上、 下游引物各10 μmol/L, dNTP 2.5 mmol/L, 10×buffer5 μL, 构成总反应体系50 μL。另设一管未加引物的50 μL反应体系作为阴性对照。各管反应混和物同时在95?加热2 min 30 s, PCR扩增30个循环,95? 30 s, 51? 45 s, 72? 45 s,, 最后延伸在72?进行8 min。内参 的反应体系及反应条件均与以上相同。反应产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳后用溴化乙啶染色检测, 并以UVI凝胶成像系统摄像。 1.2.5 Western blot 以胎盘细胞提取蛋白作为阳性对照n作为内参照。取前面提取的各个时段的DC2.4蛋白连同胎盘组织蛋白各15 μL, 各加入4×Loading buffer 5μL, 混匀, 100?煮沸5min, 低速离心, 依次加样于胶的加样孔中, 第1个加样孔中 加入4 μL蛋白Marker。120 V, 2 h, 电泳, 待溴酚蓝跑至凝胶底部时, 取出凝胶, 用硝酸纤维素膜,NC膜,在半干转膜机中进行转膜, 40 mA, 1 h30 min转膜完毕, 对照蛋白Marker条带, 按照TLR7蛋白与蛋白分子质量大小将NC膜剪开, 50 mL/L脱脂牛奶封闭液封闭1 h, 取出膜, 配制20 mL/L脱脂牛奶, 分别加入1?500 羊抗鼠TLR7一抗, 1?500人抗鼠一抗, 4?过夜孵育; TBST洗膜3次, 10 min/次; 重新将膜放入新鲜的20 g/L脱脂牛奶中, 分别加入1?1000“兔抗羊二抗, 1?1000“羊抗人二抗, 37?摇床孵育2 h; TBST洗膜3次, 15，20 min/次。将洗好的NC膜分别放在干净的平皿中, 取等量显影液A液与B液在离心管中混匀, 用枪头将其均匀撒在NC膜上, 臵于凝胶成像仪的暗室中曝光, 显影, 电脑采集图片。 2 结果 2.1 LPS刺激DC2.4前后细胞形态的变化 LPS刺激前, 细胞形态偏圆形、 较小、 透亮, 树突较少。LPS刺激后分别于12、 24、 48和72 h观察细胞, 发现细胞树突增多增粗, 部分细胞体积增大(图1)。 2.2 反转录检测DC2.4中TLR7 mRNA 经EB染色的15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测, 紫外投射仪观察后凝胶成像系统成像,图2, 3,。 胎盘组织阳性对照与DC2.4细胞中均有TLR7 mRNA转录, 其扩增产物大小为314 bp, 阴性对照孔无扩增产物。内参照在胎盘组织与DC2.4细胞中均有扩增产物, 产物大小为437 bp, 与实验设计的目标产物大小一致。 2.3 Western blot分析LPS刺激DC2.4前后TLR7蛋白表达 在胎盘,阳性对照,及LPS刺激后12、 24和48 h的DC2.4细胞中, 均可见TLR7蛋白表达, 胎盘中表达最强, LPS刺激的DC2.4细胞TLR7蛋白表达相对较弱, 但3个时间的蛋白表达水平相当。在LPS刺激DC2.4前及刺激后72 h, 未见TLR7蛋白表达。 3 讨论 TLRs属?型跨膜蛋白。迄今, 已发现的TLRs家族成员有11种, 它们在细胞内均有一定的分布。TLR1、 2、 4、 5、 6表达于细胞表面, TLR3、 7、 8、 9存在于细胞的胞内体,endosome,。体内免疫细胞如巨噬细胞、 中性粒细胞、 DC均可高水平表达多种TLRs。DC是一群异质性的抗原提呈细胞,APC,, 是联系固有免疫和适应性免疫的桥梁。研究发现, TLR7在成熟的浆细胞样DC,pDC,和髓样DC,mDC,中均有表达。 要获得有TLR7表达的成熟DC, 以往大都采用从骨髓细胞或外周单核细胞分离不成熟DC进行培养8，10 d, 再往培养基中添加 、 、、 LPS等诱导其成熟。这种方法既费时又昂贵。也曾有报道用TLRs配体或刺激不成熟树突状细胞, 可使其表面CD80、 CD86、等共刺激分子的表达上调[9, 10], 活化T细胞, 介导适应性免疫。本研究中, 采用小鼠骨髓来源的永生化细胞系DC2.4, 可以克服体外分离培养DC成本高, 费时费力的缺点。该细胞系在普通培养基中即可生长, 且易于大量传代, 适于DC功能及抗感染免疫研究[9]。 本研究结果显示, 未被LPS刺激的DC2.4有TLR7 mRNA转录, 但未见TLR7蛋白表达, 提示DC2.4中TLR7基因只有转录而无蛋白翻译。其原因可能是DC2.4系不成熟DC, 其中某些信号系统没有被激活, 导致TLR7 mRNA 翻译蛋白受阻。本实验用TLR4的天然配体LPS刺激DC2.4细胞, 在刺激后的12、 24、 48和72 h分别提取蛋白, Western blot分析, 发现在刺激后12、 24、 48 h均有TLR7蛋白的表达, 但在72 h后TLR7蛋白表达即消失。因此, 我们推测LPS可能通过DC2.4表面的TLR4激活TLR7相关信号途径, 并进一步激活了TLR7 mRNA翻 译蛋白途径, 从而诱导TLR7蛋白在DC2.4中的表达, 这种作用大约能 维持48 h。上述结果提示, 存在于DC中的TLR4与TLR7在特异性识别 病原微生物配体时, 并不是孤立地跟自己特定的配体结合诱导天然免 疫应答反应, 而是存在协同作用, 至于TLR4与配体LPS结合后如何引 起TLR7蛋白的表达, Severa 等认为可能是 由于LPS刺激TLR4后诱导了?型干扰素的表达, 从而进一步激活了干 扰素调节因子,,转录, 而基因的绑定位点刚好位 于TLR7基因的启动子内, 又激活了TLR7转录。值得注意的是, 本研 究显示DC2.4有TLR7 mRNA转录, 而无TLR7蛋白翻译, 说明LPS刺激 TLR4诱导TLR7蛋白表达不仅仅靠转录激活引起, 可能还存在 其他通路, 但其路径以及TLR4与TLR7间存在怎样的协同作用, 将有 待进一步研究。 【参考文献】 赵甫涛, 姬新颖, 潘 蕾, 等. 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