大鼠胫前肌和比目鱼肌生后增龄的分析

大鼠胫前肌和比目鱼肌生后增龄的 20中国兽医杂志2011年(第47卷)第2期ChineseJournalofVeterinaryMedicine 大鼠胫前肌和比目鱼肌生后增龄的分析 王康乐,陈佩林,马以桐,叶辉,印庆艳,朱道立 (南通大学生命科学学院,江苏南通226019) 中图分类号:$852.21文献标识码:B文章编号:0529—6005(2011)02—0020—03 骨骼肌是一个非均质组织,存在功能多样性是 由于肌球蛋白存在多种亚型.肌球蛋白是热休克蛋 白,由2个重链(MHC)和4个轻链(MLC)组成. 肌球蛋白头部重链在N一末端包含大量球状的水解 ATP动力结构域和一个形成细丝的棒状C一末端. 肌球蛋白的这些部分被一个8.5rim长的a一螺旋连 接,称为"肌球蛋白的颈部",颈部与一个碱性的和一 个调控的MLC相关联.慢缩纤维通常含有碱性慢 型MLC的亚型MLC1s和调控MLC的亚型MIC2s. 同样,快缩纤维通常含有碱性快型MLC的亚型 MLC1f与不同比例的MLC3f及调控MLC的异构 体MLC2I.然而,IIA型纤维通常也包含慢型MLC 的亚型.我们应用解剖法结合电生理,SDH酶组化 和SDS—PAGE电泳l1],以生后各年龄组大鼠快肌 代胫前肌和慢肌代表比目鱼肌为对象,观察不同 发育阶段肌纤维改变,以期对快慢肌相互作用原理 及其运动机制有所了解. l材料与方法 1.1材料(1)主要仪器设备:RM6240多道生理 信号系统(成都仪器厂);恒冷切片箱(Leica CM3OO0型,德国产),DYY—III28C型电泳槽(北京 六一厂),DYY605稳压稳流电泳仪(南京新校园生 物技术研究所).(2)主要试剂药品:氯化硝基四氮 唑蓝,琥珀酸脱氢酶(SDH)为Sigma公司产品,丙 烯酰胺(分析纯),N,N'.亚甲基双丙烯酰胺(分析 纯),十二烷基磺酸钠(SDS),三(羟甲基)氨基甲烷 (Tris)(优级纯),2-巯基乙醇(2-Mercaptoethano1) (中国医药集团上海化学试剂公司). 1.2方法 1.2.1电生理生后2周,6周,12周健康sD(rat— tusnorvegicussprague—dawley)大鼠各6只,雌雄 不拘(由南通大学实验动物中心提供),以2O氨基 甲酸乙酯(乌拉糖)经腹腔注射麻醉(1g/kg体重), 收稿日期;201005—25 基金项目:南通市科技局社会发展科技资助项目 ($2008022) 作者简介:王康乐(1958一),女,副教授,本科,从事动物解剖生理 学研究,E—mail:ntwkl@ntu.edu.cn 通讯作者:朱道立,Email:zhudaoli@ntu.edu.eFt 剖检右后肢,用双电极分别插入胫前肌和比目鱼肌, 肌电参数为电压强度:0.1V,波宽:0.2ms,频率: 2.5Hz,正电压连续单刺激. 1.2.2肌肉蛋白质电泳分别取出胫前肌和比目 鱼肌,迅速置于研钵中,加以液氮(一196?)研磨成粉 状,加样品缓冲液(15mg/mL)溶解,放入高速冷冻 离心机中,12000r/min(4?)离心5min,取上清. 配制4浓缩胶和8分离胶,适当加入40 过硫酸铵与TEMED,依次制胶,加样与电泳.预电 泳控制电压70~80V,时间3O,60min;然后电泳 控制电压15OV,时间240,300min.接着实施银 染,拍照. 1.2.3酶组化从液氮内取出肌条置放于恒冷切 片箱(LeicaCM3000型,德国产),在一2O?条件下 切片,厚度为10m.置于室温干燥3O,60rain,做 琥珀酸脱氢酶(SDH)组化染色. 1.2.4观察计数与统计在光镜下观察肌纤维的 类型和结构.每张切片随机抽样10个点,放大100 倍后计数肌纤维类型,计算各型肌纤维的构成比例. 应用SPSS13.0统计软件进行双因素方差分析. 2结果 2.1大鼠各年龄组胫前肌和比目鱼肌肌电图(elec— tromyogram,EMG)分析本试验采用针电极分别 插入胫前肌和比目鱼肌,引导并各肌电图(见图 1,2所示). 随着大鼠年龄增长,肌肉动作电位图谱也不断 变化.胫前肌和比目鱼肌的肌电图振幅随年龄的增 长,振幅都不断增大,持续时间变长,波动也变大;将 胫前肌和比目鱼肌的肌电图相比较,在同一年龄组 中胫前肌肌电图的振幅,持续时间均大于比目鱼肌. 2.2大鼠胫前肌和比目鱼肌肌纤维的肌球蛋白轻 链异构体(MyLCs)发现胫前肌的电泳图谱上均 可分出5种MyLCs,即MyLCs3,MyLCs2F, MyLCs2S,MyLCs1F,MyLCs1S的条带,而比目 鱼肌的电泳图谱上只能分出4种MyLCs,即: MyLCs2F.MyLCs2S,MyLCs1F,MyLCs1S的条 带(见图3).同时胫前肌MLCs3,MLCs2F,MLCs 1F的条带要比MLCs2S和MLCs1S的深,而比目鱼 肌MLCs2S与MLCs1S条带要比MLCs2F,MLCs ChineseJournalofVeterinaryMedicine中国兽医杂志2011年(第47卷)第2期21 1F深,这与酶组织化学染色分型的结果相一致. 彦袋蓠—量魏鳓r皇{匿宽?皇褥箍曼 挺式疆西灌一,舞时螽》f… 触搀升培触爨礴砖蛾阑—,然 图1生后各年龄组sD大鼠胫前肌肌电图从左到右依次为:生后2周,6周,l2周 触翩…曩雠;旌=爨》{蔓馘率?蔓 镬芄…继黼?蔓— 齄擞赫媲上弛话馘齄,鼯语魄髋蹬塑酗,誊一 左到右依次为:生后2周,6周,12周 图2生后各年龄组SD大鼠比目鱼肌肌电图从表1生后各年龄组SD大鼠快慢肌肌电图持续时间, 波动幅度平均值 注:P<O.05,差异显着 2.3大鼠各年龄组胫前肌,比目鱼肌肌纤维分布 在SDH染色切片上,胫前肌的肌纤维可分为I型, IIA型,IIX(IID)型,IIB型.比目鱼肌的肌纤维可 分为I型,IIA型,IIX(IID)型,没有IIB型.I型肌 纤维细,染色深;IIA型肌纤维中等,染色浅;IIX (IID)型肌纤维最细,染色最深;IIB型肌纤维最粗, 染色居最浅(如图4,5所示). kDa 200 lO5 97 5l 31 15 2 Marker比前比前比前 2W6W12W LCS.IF LCs.1F LCs.2S LCs.2F LCs.3 图3大鼠比目鱼肌和胫前肌的肌球蛋白 轻链异构体银染电泳图 MyLCslS:肌球蛋白轻链异构体1S;MyLCslF:肌球蛋白轻链 异构体1F;MyLCs2S:肌球蛋白轻链异构体2S;MyLCs2F:肌球蛋白 轻链异构体2F;MyICs3:肌球蛋白轻链异构体3(仅胫前肌有) 图4生后各年龄组sD大鼠比目鱼肌的SDH组织化学染色生后2周(左),6周(中).12 周(右)(400×) ?X型:最深染色纤维;I型:深染色纤维;?A型:浅染色纤维 22中国兽医杂志2011年(第47卷)第2期ChineseJournal.fVeterinaryMedicine 豳一一一 ??圈曩_, 胫前肌比目鱼肌 …1IXI1IAIIB11XI1IA 6周12.6?1.4 12周7.2?2.2 15.4?2.7 l2.9?2.3 24.8?2.9 26.2?3.2 47.2?6.8 53.7?8.3 9.5--+2.4 5.2?1.7 59.6?4.2 72.3土6.3 30.9?2.8 22.5?2.5 注:P<0.05,差异显着 从表2看出,大鼠胫前肌纤维构成比例在生后 发育生长过程中liB型和IIA型较多,并且IIB型 和/IX型肌纤维构成比例随大鼠年龄增长而增加. 而比目鱼肌1型和IIA型纤维构成比例较高,这可 能和比目鱼肌是后肢重要的维持姿势肌有关. 3讨论 3.1肌电图图谱分析从图1,2中看出,大鼠胫前 肌,比目鱼肌在生后不同年龄阶段接受刺激后所产 生的动作电位,幼年的波形简单平稳;随着年龄的增 加,刺激产生的动作电位波动逐渐变得复杂,持续的 时间和频率也较幼年的长,并且12周龄大鼠的棘波 清晰可见.重要的是,比目鱼肌动作电位波形比胫 前肌的棘波更为复杂.由此可以看出,生后发育过 程中大鼠比目鱼肌在稳定体位和调控运动中姿势与 关节角度,并选择精致细微动作.本研究发现,当胫 前肌作为主动肌疲劳而足背屈运动终止后,其拮抗肌 比目鱼肌并没有立即恢复,仍然低于运动前水平. 3.2肌球蛋白轻链异构体的多样性成年哺乳动 物骨骼肌中肌球蛋白轻链异构体(myosinlight chain,MyLCs)可以分为6种,即存在于快肌纤维中 的MyLCslf,MyLCs2f以及MyLCs3f和存在于慢 肌纤维中的MyLCslS,MyLCs2s,还有1种胚胎期 MyLCs:.我们试验中发现胫前肌的电泳图谱上 均可分出5种MyLCs,即MyLCs3,MyLCs2F, MyLCs2S,MyLCslF,MyLCslS的条带;而比目鱼 肌的电泳图谱上只可分出4种MyLCs,即: MyLCs2F,MyLCs2S,MyLCslF,MyLCslS的条 带,没有MyLCs3.研究证实,在无压力状态下肌纤 维的收缩率与MyLCs3的高含量有关,单个个体肌 纤维在MyLCs表达上的异质性和MyHCs含量的 不同导致肌纤维收缩功能的很大差异. 3.3肌纤维分布特征Pette等]根据肌球蛋白酶 组化分类法将肌纤维分为四型:I(SO)型肌纤维收 缩速度慢,肌纤维内琥珀酸脱氢酶活性高,有利于动 物维持平衡和姿势;IIX(FO)型肌纤维收缩速度快, 易发动而不易疲劳,保持张力和维持姿势的稳定; IIA(FOG)型肌纤维收缩速度相对较快,适合持久 快速运动;IIB(FG)型肌纤维收缩时以糖无氧酵解 代谢供能为主,易疲劳,产生暴发性短时高张力快速 运动.在比目鱼肌切片中未发现有IIB型肌纤 维,并且I型肌纤维47.9?3.4472.3?6.3 构成比例要明显高于IIA型22.5?2.5,38.89/6 ?3.7%和IIX型5.2?1.7,13.3?3.1o/6纤 维,并随年龄逐渐增多,也远远高于胫前肌I型 12.9?2.3,20.7?3.6纤维,充分说明该 肌在小腿三头肌稳定后肢过程中,首先募集I型慢 缩氧化肌纤维增加肌力以抵抗重力;而在胫前肌内 IIB型41.5?7.4,53.7?8.3纤维构成随年 龄增长,实施无氧酵解高速运动维持后肢的协调运动. 参考文献: ll1]AndruchovO,GallerS.Influenceoffastandslowalkalimyo— sinlightchainisoformsonthekineticsofstretch-inducedforce transients0ffast—twitchtypeIIAfibresofrat[J].Pflugers ArchEurJPhysiol,2008,455:1l651172. [27朱道立,陈佩林,叶辉,等.家兔生后快慢肌纤维MyHCs的转 化比较EJ].江苏农业科学,2009,44(1):208211. [3]AndrUChov0,AndruchovaO,WangY,eta1.Dependenceof CROSSbridgekineticsonmyosinlightchainisoformsinrabbit andratskeletalmuscleinfibers[J].JPhysiol,2006,571(Pt 1):23卜242. [43SabahattinB,PeterJR.Myosinlightchainisoformexpression amongsinglemammalianskeletalmusclefibers:speciesvaria— tions[J].JournalofMuscleResearchandCellMotility,2004, 25:623633. r5]PetteD,StaronRS.Transitionsofmusclefiberphenotypic profiles[J].HistochemCellBiol,2001,115(4):359—372. E6]朱道立,徐萍,谢锋,等.大鼠骨骼肌纤维组织化学分型与肌球 蛋白重链的功能[J].解剖,g007,38(1):93—97.