胚泡与子宫内膜着床相关基因的筛选及其功能研究（可编辑）

胚泡与子宫内膜着床相关基因的筛选及其功能研究（可编辑） 胚泡与子宫内膜着床相关基因的筛选及其功能研究 jy’955D6《 复旦大学 博士研究生毕业论文 胚泡与子宫内膜着床相关基因的筛选及其功能的研究 博士研究生: 王健 导 师: 左嘉客 研究员 导师小组成员: 申庆祥 研究员 刘承权 研究员 国家重大基础研究规划项目 国家自然科学基金青年基金项目 资 助 WHO ect Re―entryProj 2005年10月 缩略词 r AP 氨苄青霉素 _aml2icillin APES 3一氨丙基(三乙氧基硅烷 3-aminol2ropyltri_ethoxy-silane BCIP 5-_bromo-4-_chloro一3面dolyl_卫 hosphate5一溴(4一氯(3一吲哚(磷酸 albumin BSA 牛血清白蛋白 bovine_serum CoX(2 环氧合酶_2 c_(yclox_xygenase-2 CTP 羧基末端肽段 C-_tetminal12epfide DD-RT-PCRDifferential 差异显示RT-PcR Display-RT-PCR DEPC 焦碳酸二乙酯 p_yro_carbonate di_ethyl DMEM minilYalrllessentialmedium Dulbecco极限必需培养基 D_ulbecco’s DMSo sulfoxide 二甲基亚砜 dimethyl E4BP4 factor NFIL3,E4BP4转录因子 NFIL3但型transcription EB bromide 溴化乙锭 e_thidium matrix ECM 细胞外基质 extra_cellular EDTA acid 乙二胺四乙酸 ethylene_diaminetetra-acetic EMO-l factor-1 胚泡着床因子一l embryoimplantation EMO-2 factor-I 胚泡着床因子-2 embryoimplantation ESceU cell 胚胎干细胞 embryonic_stem EST 达序列标签 expressed_sequence_tag FBS 胎牛血清 鸯talbovine_serum FITC fluorescein 异硫氰酸荧光素 iso_thiocvanate GST 谷胱甘肽(s(转移酶 glutathione-S-_tr?sferase HEPES N(2(羟乙基哌嗪(N’(2(乙磺酸 N??2-hydroxyethyl-oiperazine-N'-2-ethane_sul (fonicacid rLIF recombinant factor 重组白血病抑制因子 leukemia_inhibitory HRP 辣根过氧化物酶 horse_radishEeroxidase IHC 免疫组织化学 _immuno_histo_chemistry IL-3，IL(4 3,interleukin4 白介素3,白介素4 inter!eukin iNOS _inducible―n(itric―o(xide 诱导型一氧化氮合酶 s_2mthase IPTG 异丙基(B(D硫代半乳糖苷 _isol2ropyl一13-D-_thiogalactoside Proteinase2 ISP2 着床丝氨酸蛋白-2 Implantation_Serine IVT 体外转录 曲丑trotranscription IV LB culture LB培养基 ―Luria-一Bertani LPS 脂多糖 _lipoDoly_saccharide MMP-9 基质金属蛋白酶(9 一matrixmetallollroteinase-9 MNSFD monoclonalnonspecific 单克隆非特异性抑制因子(B suppressor_factor-13 NAA nonessential垦nlillo_acids 非必需氨基酸 NBT nitro-blue_tetrazolium 氮蓝四唑 NTP _N-_terminall!eptide 氨基末端肽段 ORF 开放阅读框 open_reading_frame PAGE gel 聚丙烯酰胺凝胶电泳 坠olyacrylamideelectrophoresis PCR ChainReaction _Polymerase 聚合酶链反应 RGS2 G蛋白信号调控子-2 RegulatorofG-protein_signalingproteins2 PMSF 苯甲基 磺酰氟 l!henylmethyl_sulfonyl_fluoride PVAL alcohol 聚乙烯 醇 l?lyx_myl RT-PCR 逆转录 PCR _Reverse_T(ranscription-PCR SDS sulfate sodium dodecyl 十二烷基磺酸钠 SSH subtractive suppression hybridization 抑制差减杂交 TFM medium _tissue_freezing 组织冷冻包埋剂 Thlcells Tcells 1-型辅助型T细胞 type-1helper Th T 2cells cells type-2 2-型辅助型T细胞 helper uIlA activator _urokinase-type121asminogen 尿激酶型纤溶酶原激活因子 X??GaI 5-溴(4- 氯一3-吲哚(B-D- 5_Brom04-chloro??3-indolyl-13-D-galactopyranoside 半乳糖苷 V 胚泡和子宫内膜着床相关基因的筛选及其功能的研究 中文摘要 胚胎着床 又称胚胎植入 是哺乳动物和人类生殖生理特有的一个环节，也是关系到 妊娠成功与否的关键步骤。着床的顺利进行有赖于胚胎和子宫内膜的同步发育，即胚胎 发育至胚泡阶段并完成孵化过程，同时子宫也处于接受状态，从而使得活化状态的胚泡 能在“着床窗口”极其有限的开放时间内，及时与处于接受状态的子宫内膜建立紧密联 系。这一显得非常精致的协同发育过程受到来源于胚胎和母体子宫内膜双方的各种激素、 生长因子、细胞因子、蛋白酶等激素类分子和非激素类分子的调控，但其确切的分子机 制仍不是十分清楚。 为了寻找新的与胚胎着床相关的非激素类分子，以更深入地了解胚胎着床的分子机 制，并探寻进行生殖调控的新环节，本实验室以小鼠为动物模型，分别收集了着床当日 孕D5天 小鼠着床部位和非着床部位子宫组织，以及着床前 孕D4天 和着床当日 多在小鼠胚泡着床当日 孕D5天 的着床部位和非着床部位之间，或着床前后的胚泡之 间存在特异性表达差异的基因的EST片段。但因人力、物力的限制，我们仅对其中很小 一部分EST进行了测序分析，鉴别到5个新的着床相关基因，并在克隆获得这些基因的 经GenBank 因子，但未发现该基因与胚胎着床相关的研究报道:RGS2参与G蛋白信号转导途径的 调节，与细胞内钙离子浓度的调节以及T细胞增殖有关，其在着床中的作用未见有报道; ISP2是最近新发现的一种子宫组织特异基因，其表达受孕激素调节，并在胚胎着床期问 呈特异性高表达，但其在胚胎着床中的作用尚有待于阐明;EMO(1 与哺乳动物Sec63基 因有高度同源性，而Sec63参与多种蛋白前体分子的翻译后加工;EMO一2是新基因，与 正在研究的另一个新发现的着床相关因子，它是一种由抑制性T细胞合成的具有非特异 性免疫抑制作用的淋巴因子，因其能抑制IL(4的分泌和Th2细胞的产生，所以推测其可 能与母胎间免疫耐受的形成有关，但有待于研究证实。 因抗ISP2抗体和抗MNSFl3抗体尚未市场化，为了获得这些蛋白分子的特异性抗体， 1 复旦大学上海医学院上海市计划生育科学研究所博士研究生毕业论文 胚泡和子宫内膜着床相关基因的筛选及其功能的研究 融合蛋白，并进而以这些重组蛋白作为抗原，分别制备了抗ISP2抗体和抗MNSF[3抗体。 与此同时，本实验室的其他研究人员也分别制备了抗EMO一1氨基末端肽段抗体 抗 体 。这些抗体其后被用于免疫组化研究和体内抗体封闭实验。 胎着床期间小鼠子宫内膜中的表达模式进行了分析，发现这些基因在胚胎着床前、后的 表达均存在特异性差异，但表达部位各有不同，而且EMO(2的高表达不依赖于胚胎的存 在，用我们自己制备的抗ISP2抗体进行的免疫组化结果与文献报道的原位杂交结果也相 一致。 这些着床相关因子是否能成为发展新型抗生育技术的潜在靶分子，我们在小鼠体内进行 抗体都具有抑制小鼠胚胎着床的作用，并呈剂量反应关系。而本实验室此前应用反义核 酸技术进行的体内、外实验结果表明，EMO(1和EMO(2的反义核酸对胚胎的着床也有 明显的抑制作用。我们分别收集了经抗ISP2抗体和抗MNSFl3抗体处理过和未经抗体处 理过的孕D5天小鼠子宫组织，然后通过免疫组化研究，观察抗ISP2抗体对小鼠子宫中 uPA和MMP(9表达水平的影响，分析其抑制胚胎着床的可能机制;并应用基因芯片技术， 初步筛选出一些抗MNSFfl抗体处理后在小鼠子宫组织表达上调和下调的基因。 为了建立基因剔除小鼠模型的建模技术，为以后深入研究这 些基因功能缺陷对胚胎着 床的影响极其作用机制提供动物模型，我们建立了具生殖系嵌合能力的C57BL,6J小鼠胚 胎干细胞系，可用于今后制备转基因动物和基因剔除动物模型。 起着重要作用，并且是发展新型抗生育技术的潜在靶分子，应进一步深入探讨这些基因 在着床中的作用机制。 关键词:胚胎着床;E4BP4;RGS2 2 复旦大学上海医学院上海市计划生育科学研究所博士研究生毕业论文 胚泡和子宫内膜着床相关基因的筛选及其功能的研究 Abstract isa critical in owned Embryoimplantation step reproductiveprocessspecificallyby mammalianandhuman isthemostrelevant factorforsuccessful being(and limiting pregnancy( In ordertoestablishanactiveinteractionbetweenthe andthematemal implantingembryo endometriuma limited defmed window’’(the duringvery timespan as也e“implantation should tothe and fromthezona embryo blastocyst synchronouslydevelop stage escapte theendometriHalbecomes an COOrdinationinvolves pellucida，when receptive(Suchexquisite the andvarious ofhormones non-hormonalmolecules and regulation embryonic producedby matemal tissues，includinggrowthfactors，cytokines， proteinases( Withaviewtofurtherunderstandthe molecularmechanism precise underlyingembryo andtofindoutnew forthe ofnovel implantation targets developmentfertilityregulation as 1abusedthemouseamodelto thenovel techniques(our identify implantation(relatedgenes and therolesthese in mouseuterinetissuesof explored genesplayedembryoimplantation(The sitesand siteswere atthetime collected of implantationinter-implantationrespectively 5of the werealso implantation Daypregnancy ，andpre―and embryos post―implantation collectedon 4and 5of of cDNAsubtracted Day Daypregnancy(Subsequently,the techniques andDD-RT-PCRwere novel toscreenthe factorsinvolved hybridization respectivelyapplied inmouse number ofEST of embryoimplantationprocess(Alarge fragmentsgenes betweenthe and sites(orbetween也e differentiallyexpressed implantationinter-implantation screened been pre-and implantation post-implantationembryos，wereout(However,having shortin1abor andresearch asmall oftheEST were power funds，just part fragmentpools for further the 5 novel were sequenced analysis，andfinally implanta石 on―relatedgenes identified(ThecDNAofthese were clonedand inthe fIlll(1ength registered genes successively are GenBank(They AY238936 andEMO-2 AY372183 ( TheresultsofGenBankBlastsearchesandreferences an reviewshowedthat(E4BP4is IL3( nuclear no on E4BP4relatedto was regulatedtranscriptfactor,andreport implantationfound; RGS2 inthe of andisinvolvedinthe participatesregulationG-protein signalingpathway ofintercellularCa”mobilizationandTeell therewasalsono regulation proliferation(but onRGS2relatedto wasa mouseuterine report implantation;ISP2 newly-identifiedspecific was its and the gene，and regulated expression byprogesteronesharplyup―regulatedduring the of rolesofISP2 in wasstill Periodimplantation，but playedimplantationunclear;EMO(1 to was mammalianSec63whichwas tobeinvolvedinthe highlyhomologous gene reported modificationofvarious wasanew and post―translation proteins;EMO(2 gene partly tothehuman on and MGC50372，andno EMO(2its homologous hypotheticalprotein report was wasa identified novel homologousgene found(MNSFl3previously factorthatneededtobefurther inour is lab，anda bv investigated lymphokineproduced itwas Tcell(As that couldinhibittheimlnurle inan suppressor reportedMNSFl3 response manner thesecretionofIL--4and of antigen????nonspecificsuppressivebyinhibiting production Th2 was to intheformationofimmune tolerancebetween cells(MNSFppresumedparticipate andmaternalendometrialtissues( embryo 3 复旦大学上海医学院上海市计划生育科学研究所博士研究生毕业论文 胚泡和子宫内膜着床相关基因的筛选及其功能的研究 Astheanti(ISP2 and werenotcommercialavailable，we antibodyanti―MNSFl3antibody recombinantISP2 as 也erefore the wellfusion and prepared protein，as proteinsMNSFl3_hCGB immunizedanimals these asthe GST-MNSFl3，respectively,andbyusing expressedproducts to theanti―ISP2and antigenrespectivelyprepare anti-MNSFl3 antibodies the andEMO一2CTP respectivelyagainstEMO-1NTP,EMO(1CTP(EMO(2NTP werealso inourlab(A1loftheseantibodieswereusedinthe IHC prepared subsequentstudy andinvivo10SSoffunction experiments( Theuterine of andEMO-2the expressionpaaemsE4BP4，RGS2，ISP2， EMO??1duringperiod were in―situ and,orIHC(The ofembryoimplantationrespectivelyinvestigatedby hybridization resultsshowed uterine ofthese5 were the that，the expression genes up??regulatedduring the localizationofthese werenotthesame( implantationprocess，butexpression gene levelofEMO-2was Particularly,thehighexpression ofISP2 WaswellconsistenttheISP2mRNAas with expressionpaaem protein previously reported( In therolesof ordertofurther andEMO(2 in investigate ISP2(MNSFl3(EMO(1played to whetherornotthe the process，and embryoimplantation explore potentialtarget s for of could novel befound these developmentcontraceptive amonggenes，the inmice(The were resultsshowed antibodies that。the ISP2( experimentsperformed against EMO一2 a and caused effectsonmouse MNSFl3(EMO(1 dose(dependentinhibitory embryo in antisense of implantationvivo(Consistently,theprevious RNA(blockingexperiments EMO一1andEMO一2alsoshowedthe e饪bctson inhibitory embryoimplantation(D5pregnant mouseuterinetissuestreatedandnon-仃eatedbv or were ISP2(antibodyMNSFl3respectively collected(IHCwascarriedouttoobserve or uPA whethernotthe of and analysis expression MMP-9 wouldbeerectedthetreatment ofanti-ISP2 proteins by antibody(cDNAarray wasusedto the in treated technique identifyup-anddown-regulated genesMNSFp-antibody uterinetissues( Inorderto the relatedtothe ofknockoutmouse model，which developtechniques development couldbeusedto the effectsandthe mechanismcaused deeplyinvestigateinhibitory underlying the ofthese establisheda by function-deficiencyimplantation-related germ??line genes，we transmissionC57BL,6J stemceUlinesthatCan to be using embryonic appliedgenerate or knock-outmice( transgenicgene Tosum couldbeconcluded andEMO??2 thecritical up，it that，ISP2，MNSFp，EMO??1play rolesinmouse are forthe embryoimplantation，andconsequently targets potential ofnovel mechanismsandthe contraceptiveproduct(However,the potential development these factorsarestillneededfurther interaction tobe amongimplantation-related explored( words:embryo Key 复旦大学上海医学院上海市计划生育科学研究所博士研究生毕业论文4 胚泡和子宫内膜着床相关基因的筛选及其功能的研究 前言 子宫相互作用，导致胚胎滋养层与子宫内膜建立紧密联系并进一步发展的过程。它是哺 乳动物和人类特有的一个生殖生理步骤，也是进行生育调节的理想环节。着床过程一般 一个复杂的生理过程，涉及胚胎与子宫间极其复杂而精细的协同 作用，包括胚胎的发育 分化与子宫内膜的同步变化【3】，以及胚胎与子宫间的相互作用。研究和了解这些变化和 相互作用的分子基础，将有助于揭示细胞的生长、分化、迁移和侵入性，细胞间的相互 识别、粘附、信息交换、信号转导，以及局部免疫调节和免疫耐受的形成等具共性的生 理机制，并可为发展生育调节新技术提供新途径和新思科4】。因此，在过去的20多年里， 胚胎着床分子机制的研究一直都是生殖生物学领域的一个热点，也取得了的大量的研究 成果。特别是最近几年来，随着定量PCR、基因芯片、质谱、生物信息学等一系列现代 生物学研究技术的发展，使我们对胚胎着床的分子机制有了更深入和全面的了解，但至 今仍有许多问题有待于阐吲“。 雌激素、孕酮等等激素类分子在胚胎着床中的作用及其分子机制已比较清赳6’1。几 乎所有哺乳动物的子宫内膜仅在“着床窗”这一特定时间段内对胚胎呈接纳状态，而“着 床窗”的开放则有赖于雌、孕激素正确的序贯作用【8】;同时，主要由黄体合成的孕酮还 是绝大部分哺乳动物维持胚胎着床后的正常妊娠所必需的。正是基于对这一生殖生理知 识的了解，人类才得以在上世纪50年代末发明了口服避孕药，从而带来了现代避孕节育 技术发展的第一次革命性变革。此后，经研究发现，在灵长类动物和人类妊娠早期，由 胚胎滋养层细胞合成分泌的绒毛膜促性腺激素 cG 在维持黄体 功能和正常妊娠中起重 要作用，因而成为一个理想的抗生育靶抗原。自1970年代起，以人绒毛膜促性腺激素 hCG 为靶抗原的免疫避孕制剂开始成为新型避孕节育技术的一个重要研究方向，虽 然至今尚未得以实际应用，但仍是最有发展前景的一种免疫避孕制剂，它主要是通过间 接地阻断黄体继续合成孕酮，以致达到避孕目的f9，l们。 从1990年代起，越来越多的科研人员开始将注意力转到由胚胎和子宫内膜上皮细胞 合成分泌的、参与调控胚胎和子宫内膜的同步发育和相互识别、子宫内膜接纳性的形成、 胚胎滋养层对子宫内膜的有限侵入，以及母胎界面免疫耐受的形成等着床过程中不同环 节的非激素类分子，包括各类转录因子、细胞因子、生长因子、粘附分子、蛋白酶及其 抑制物等，并相继发现了许多与胚胎着床相关的非激素类分子，为进一步深入了解着床 5 复旦大学上海医学院上海市计划生育科学研究所博士研究生毕业论文 胚泡和子宫内膜着床相关基因的筛选及其功能的研究 黏附相关，且两者的作用正好相反;Intergfin也参与调控胚胎和子宫内膜相互作用和黏附 制剂PAI等蛋白酶都与滋养层侵入子宫内膜过程中细胞外基质的消化和重建有关[25,26]: 以上只是列举了一部分目前己发现的非激素类胚胎着床相关分 子，而在所有目前已鉴别 到的分子中，LIF是研究得较为广泛和深入的一个非激素类着床相关分子，它在排卵、着 床及胎儿发育中均起重要作用，故不适于作为发展新型避孕节育技术的靶分子[37,38,39】。 虽然现已发现很多理论上能成为避孕药物攻击目标的胚胎着床相关分子，但由于它们大 都在机体其它组织器官的正常生理活动中也起重要作用，这就大大降低了它们作为抗生 育药物靶分子的可能性。因此，人们仍在不断筛选和鉴别新的着床相关分子，以期能更 全面地揭示胚胎着床的分子机制，并希望能从中发现更理想的抗生育药物靶分子，从而 带来现代避孕节育技术的又一次革命性变革。 为了提高在生殖调控基础研究领域的整体研究水平，促进原始创新性成果的获得，我 国于2000年启动了国家重大基础规划项目《生殖健康的基础研究》，试图从生殖细胞的 发生和成熟、受精和早胚发育、胚胎着床等生殖过程的不同环节，深入阐明生殖调控的 分子机制，并为发展全新意义的避孕节育技术奠定基础。本论文课题《胚泡与子宫内膜 着床相关基因的筛选及其功能的研究》作为此项目的一个三级子课题，研究目标就是以 小鼠为动物模型，应用现代分子生物学技术，鉴别筛选新的胚胎着床相关基因:通过对 这些基因的功能及其在胚胎着床中的作用进行初步研究，以进一步揭示胚胎着床的分子 机制，并从中寻找潜在的可实现生育调控目的的新环节或新的靶 分子。 6 复旦大学上海医学院上海市计划生育科学研究所博士研究生毕业论文 胚泡和子宫内膜着床相关基因的筛选及其功能的研究 第一部分小鼠子宫内膜着床相关基因的筛选和克隆 虽然着床是哺乳动物共有的一个生殖环节，但胚胎着床的方式却多种多样，不尽相 同。由于小鼠和大鼠的胚胎着床方式与人相刨”，而且对小鼠的遗传背景也比较清楚， 因此以小鼠为动物模型获得的研究结果往往可以延伸到人类，成为胚胎着床研究比较理 想的一种动物模型。 小鼠胚胎着床是一种必须在特定时间和特定位置实现的过程。在着床过程中，着床 部位子宫内膜与非着床部位子宫内膜有明显不同的形态学变化。因此，虽然对胚胎定位 的分子机制尚不明确，但可以推断在胚胎着床过程中，子宫内膜着床部位和非着床部位 的基因表达及后修饰的调节也是不同的。鉴别筛选出在着床部位和非着床部位存在表达 差异的基因，并对这些基因的功能进行研究，无疑将有助于我们进一步了解胚胎着床的 分子机制。显然，胚胎着床过程是胚胎和子宫内膜相互作用的过程，不仅子宫内膜组织 在这一过程中产生基因表达上的变化，着床前后的胚胎组织也会有基因表达上的的变化。 从分子水平上揭示这些变化有助于我们了解胚胎着床过程中，胚胎与子宫内膜相互作用 的分子基础。 后期开始得到广泛应用，可用于比较源自不同组织细胞或不同状态细胞之间在基因表达 上的差掣“。人或小鼠的胚胎在进入子宫的同时形成胚泡，小鼠的胚胎是在孕D3天 见 阴栓的当天为孕D1天 形成胚泡并进入子宫，在孕D5天早期 孕D4(5天 开始着床„。 小鼠胚胎着床后首先出现的可见变化为胚胎定位处的子宫内膜血管通透性增加，通过静 脉注射染料 芝加哥蓝或台盼蓝 后便可在子宫内膜着床部位见到蓝色条带，能与非着 床部位区分开来【42】。 本部分工作就是运用SSH技术，筛选在小鼠胚胎着床当日 孕D5天 子宫内膜着 床部位和非着床部位存在特异性表达差异的新的胚胎着床相关基因，特别是新基因。同 孕D5天下午 胚泡组织中存在特异性表达差异的新的胚胎着床相关基因。 7 复旦大学上海医学院上海市计划生育科学研究所博士研究生毕业论文 胚泡和子宫内膜着床相关基因的筛选及其功能的研究 一、材料: 一 实验材料 ml, 于孕D5天上午8:00左右，Balb,C小鼠尾静脉注射1,芝加哥蓝溶液 0(1 只 ，5min后，以脱颈法处死。剖腹取子宫，分别收集呈蓝色的孕D5天着床部 位 含胚泡 和未着色的非着床部位的子宫组织，同时收集该小鼠的卵巢、心、 脾、肝、肌肉、脑组织;睾丸和附睾组织则取自Balb,C雄性成年小鼠。于孕D5 冰箱备用。 二 主要试剂 l、Trizol试剂盒购自Gibco(BRL公司: 2、PolyATtract@mRNA分离试剂盒和Universal 自Promega公司; 3、ClontechPCR(SelecteDNA 为Clontech公司产品; 4、Agarose购自Promega公司; 5、Bacto-tryptone、Yeastextract和Agar为Oxiod公司产品; 6、DNA限制性内切酶和修饰酶、Random primerDNA标记试剂盒、pMDl8(T Vector购白TaKaRa公司; 7、BSA、Salmon DNA为Sigma公司产品;Tris base为Boehringer公司产品; 8、10xMOPS电泳缓冲液、上样缓冲液、甲酰胺为华舜公司产品; 9、 biotech公司产品; 缸’ -dCTP 3000Ci,mm01 为Amersham pharmacia 10、其它试剂均为国产分析纯; 11、PCR引物由上海博亚公司合成; 12、基因测序由联合基因科技 集团 有限公司进行。 三 培养基和常用溶液 迪壁差遗 10 Bacto―tryptone g Yeastextract 5 g NaCI 10 g 加水至1000mL，调pH至7(4，高压灭菌后使用。 复旦大学上海医学院上海市计划生育 科学研究所博士研究生毕业论文8 胚泡和子宫内膜着床相关基因的筛选及其功能的研 究 ,星固佳墙差基 10 Bacto??tryptone g Yeastextract 5 g NaCI 10 g 15 Agar g 加水至1000 mL，调pH至7(4，高压灭菌后铺平板使用。 2Q!S墨,!乜H2:Q2 NaCl 3mo儿 0(3mol,L Na3Citrate(2H20 !M旦?:H,l,pH8:Q2 Tris―base 121(1 g 800mL HEO mL，高压灭菌。 用浓盐酸将pH调至8(0，加水至终体积1000 !垦垒旦I目匿!,pH8:Q2 Tris(HCl 100mm01,L EDTA 1mm01,L Q:』丛婴坠,乜珏8:Q 186(1 EDTA-Na(2H20 g 800mL HEO NaOH调PH至8(0，加水至1000mL，高压灭菌。 验;氢值;昱虐醒 25;2垒;!:业吐 3M NaOAC pH4(7 NaOAC 49(22 g mL 70 H20 mL，加DEPC至终浓 度为0(01, 用冰醋酸调pH至4(7，加水定容至200 分装后高压灭菌。 9 复旦大学上海医学院上海市计划生育科学研究所博士研究生毕业论文 胚泡和子宫内膜着床相关基因的筛选及其功能的研究 二、方法: 一 子宫组织总RNA的提取: l mL，匀 l、冻存于液氮中的子宫组织，立即放入匀浆器中，每50(100mg加入Trizol rain。 浆后于室温保温5 min。 2、加I,5体积的氯仿，用手激烈摇荡15sec后于室温放置3 3、4。C下，11000 rain，见混合物分为三相，取上层水相。 rpm，离心15 min，同 4、按lmLTrizol加0(5mL异丙醇的比例加入异丙醇，混匀，室温下放置10 上离心。 5、按每mLTrizol不少于lmL75,乙醇的比例，加入乙醇溶液，悬浮沉淀物，4。C下， 7500 rain，弃上清，沉淀晾干，溶于DEPC―H20。 rpm，离心5 7、取51(tL作琼脂糖凝胶电泳估测总RNA是否降解。 二 用PolyATtract@mRNA试剂盒从总RNA中分离mRNA: 1、总RNA1 min，加入3 IxL 65。C温育10 mg 500 针和13uL20×SSC，轻轻颠倒混匀，室温放置10rain，至完全冷却。 2、准备1(2mLO(5×SSC及1(4mL0(1×SSC各一管。 see 3、准备磁珠管:倾斜磁珠管，轻轻弹匀，放在磁座上至磁珠聚集于管的一侧，30 后仔细吸弃上清。用0(5×SSC洗磁珠，共三次，每次O(3mL。将洗过的磁珠重 悬于0(1mL0(5×SSC中。 4、将步骤1中的混合物加入含磁珠的管中，室温下温育10min，期间经常弹匀。磁 mL。 珠吸至一侧，吸弃上清。用O(1×SSC洗磁珠，共四次，每次用0(3 5、最后加入O(1mLDEPC(H20悬浮磁珠，靠磁性将水相和磁珠分开，吸取水相，再 加入O(15mLDEPC(H20，按相同方法处理后再次吸取水相，并将两次水相合并。 6、4。C下，11000 rpm，离心10min，上清移至新管。 7、取15“L用分光光度法估测mRNA的含量和纯度，其余加1,10体积的醋酸钠和 等体积的异丙醇，一70。C过夜。 8、沉淀过夜的mRNA于40C下，14000min。沉淀用75,乙醇洗一次， rpm，离心20 370C水浴烘干。 测A260和A280，估测mRNA的含量和纯度。 10 复旦大学上海医学院上海市计划生育科学研究所博士研究生毕业论文 胚泡和子宫内膜着床相关基因的筛选及其功能的研究 三 eDNA的合成: 按Clont chPCR-SelccteDNA subtraction试弃嗌韵操作指南进行，步骤如下 l、第―链c跳合:J堍 1 按下列次序加样: mRNA 2岖 1 uL DNA合成引物 10pmol,L 加水至5uL，700C温育2min。 min后，稍微离心。 2 冰浴中放置2 3 按下列次序加样: 5 退火反应液 uL 第一链反应缓冲液 5× 2此 dNTPMix 10mmol,Leach luL AMV逆转录酶 20U,灶， 1“L 1uL ddH20 10 总体积 uL 4 轻轻混匀后，稍微离心。 min后，置冰上。 5 反应物于420C水浴中温育90 2、第二琏蝴的俞扰 1 在并卜链cDNA合脚铲物 10ItL 牛力n久 48(4uL d?-120 5×第二链反应缓冲液 16(0LLL dNTPMix 10mmoI,Leach 1(60 I(tL 4(oo 20x第二链酶混合物 uL 总体积80(0uL 2 轻轻混匀后，稍微离心。