应用Vero细胞分离新型布尼亚病毒

应用Vero细胞分离新型布尼亚病毒 ero V应用 细胞分离新型布尼亚病毒 1 2 1 1 1 1 1 1，，，，，，，张永根谢琴秀孙永何军史永林刘红曹明华胡万富 【】 。Vero 摘要目的 从不明原因发热伴血小板减少综合征患者血液中分离新型布尼亚病毒方法 应用 细胞培 ，( IFA) 、( Real )t ime PCR) 。养法分离病毒并用间接免疫荧光检测法实时荧光聚合酶链反应技术进行鉴定结果 24 6 。Vero 从 份不明原因发热患者血液标本中分离出 株发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒结论 应用 细胞培 。养法可以直接从不明原因发热患者血液中分离发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒 IFA;【】 ; Vero ;实时荧光聚合酶链反应关键词布尼亚病毒细胞 【】1007 ) 1040(2012)04 ) 0249 ) 03文章编号 【】 R181, 32【】 A中图分类号文献标识码 Isolation of novel bunyavirus Using Vero cell ZHANG Yon)g g en，XIE Qin )x iu，SUN Yong ，HE Jun，SHI yong )li n，LIU Hong，CAO Ming )hu a，HU Wan )fu (Anhui Provincial Center foDr i sease Control and Prevention，Hefei 230601， Anhui，China) bsac bece To soate nove bunyavus from the bood specmens of patents wth severe fever wth thombo- 【Atrt】Ojtivillirliiiircytopenia syndrome( SFTS), Methods Vero cell lines was used toiso late severe fever iwth thrombocytopenia syndromev i- rus (SFTSV)，which was thenid entifiecl by indirect immunofluorescence assay( IFA) and real )t ime PCR, Results Of the 24 bood specmens of patents with fever ofu ndetemned ogn，6 were detected to pbose tve, oncson SFTSliiririiiiCluiV can bei solated directly from the lbood specimens of patients with SFTS using Vero cell lines, 【Key words】 Bunyavirus; Vero cell; IFA; Real )t ime PCR 2010 、、。年河南湖北山东等地相继发现不明原因如下 ，发热伴血小板减少病人中国疾病预防控制中心通过 1材料与方法，对疑似病例血标本的核酸检测发现了新病毒基因序 ，、、、、、6 列并从湖北山东河南安徽江苏辽宁 省送检 1, 1 24 2011 : 10 5 标本来源 份血液样本为 年 月 20 ，的血标本中分离到了 株新病毒通过基因测序和 安徽医科大学第一附属医院和安徽省立医院送检的 ，显微镜形态学比对确定为布尼亚病毒科白蛉病毒属 ( 临床疑 似 病 例 标 本 大部分病例发热伴血小板减 ，的一种新病毒命名为发热伴血小板减少综合征布尼 ) 。)8 0?少血标本离心后将血清分装到冻存管中 。保存备用 fever with thrombocytopenia syndrome( severe亚病 毒 ,1 ) 4, 1, 2检 测 布 尼亚病毒抗体试剂 试 剂 来 源 bunyavirus，SFTSV) 。安徽省近年来不断有发热 ，2011 伴血小板减少综合征病例的报告年安徽省疾 ( ELISA) 、Vero RT )P CR 细胞和 试剂均由中国疾控 ，PCR 病预防控制中心实验室对送检的临床病例血液标本 中心病毒病预防控制所提供核酸检测阳性对 。IgM IgG ，Vero 照由江苏省疾控中心赠送 进行布尼亚病毒抗体 和 检测同时用 ，细胞对病人的血清标本进行病毒分离培养现将结果 1, 3ELISA病人血清抗体检测 送检的血标本用 IgM IgG，试剂盒检测新型布尼亚病毒抗体 和 检验方 。法按照说明书要求进行 【】 ( 2009ZX10004基金项目本研究由国家科技重大专项课题 1, 4 ，) 201) 将病人血清解冻后分别取资助病 毒 分 离 方 法 2 【】1, ，230601作者单位安徽省疾病预防控制中心安徽 合肥 1ml 12, 5 cm用除菌过滤器除菌后接种到 规格的长 2, ，230022安徽医科大学附属医院安徽 合肥 Vero ，4ml ，有 细胞的培养瓶中加入 细胞维持液置 【】 ( 1962 : )， ，，作者简介张永根男主管技师主要从事病原 CO36? ，1 。5%培养箱中培养第二天换液 次每天 。2 微生物检验工作 : 3) 。毒抗原 方法在生物安全柜中将培养至三代的细胞 ，PBS PBS ( ，倒去 培 养 液用 洗 两 遍留 少 许 液 约 0, 5m) ，，l用细胞刮除器将细胞从瓶壁刮下反复吹打 ，后滴于洁净的玻片孔中置于安全柜中紫外照射灭活 2 h，20 min 。干燥后用丙酮固定 备用将本实验室留 gG 3% PBS 1: 20;I存的 阳性血清用含 无脂奶粉 按 1: 40; 1: 80; 1: 160 ，倍稀释滴加于待检测的抗原片 30min 0, 01molPBS ，37? 上湿 盒 温 育 后 置 中 浸 泡 10 mn，2 ，，i用蒸馏水洗 遍干燥后加羊抗人荧光抗体 37?C 30min 0, 01mol PBS 湿 盒 温 育 后 置 中 浸 泡 Real )t ime PCR 2 6 图 分离到的 株病毒毒株 结果10min，2 ，，用蒸馏水洗 遍干燥后镜检阳性标本可见 ( 1 ) 6 ) 为分离到的毒株。细胞内有明显针尖样荧光颗粒 1, 6Real ) time PCR 检测 将细胞培养物紫外光照 ，射灭活以后提取核酸用布尼亚病毒特异性引物检测 。培养物中是否含有病毒核酸 3 L 图 病毒 片段序列相似性比较 2结果( 1 : 2 2 ，3 :8 为本实验室的 株病毒为新型布尼亚病 : 11 ，9 ，毒代株为白蛉病毒三株病毒图中数值为两对序 ，24 对血标本进行新型布尼亚病毒抗体检测份)d istance) 。，P 列间核苷酸差异率计算方法为 16 IgM ，1 份检出新型布尼亚病毒抗体 阳性血标本中 ，6 根据所做的检测结果以上 株病毒为发热伴血 IgG 。24 份 抗体阳性份细胞培养物的细胞滴片经间 。小板减少综合征布尼亚病毒 ，6 1: 80 接免疫荧光法检测有 份标本在 稀释度以下 ( 1) 。可见明显荧光颗粒见图 3 讨论 3, 1实验室诊断技术的建立 目前针对发热伴血小 ，板减少综合征病例的实验室诊断技术日趋完善中国 ELISA 疾控中心病毒病研究所已开发研制出 试剂 ，2h IgM、IgG ( 盒可以在 抗体发病早 内检测出病人的 ) 。PCR 期可能检测不到相关抗体用 技术检测病毒 ，，。核酸可以在当天出结果但费用较高病毒分离技 ，，术作为明确诊断的金标准是必须建立的实验方法 、获得毒株以后可以用来研制试剂盒疫苗和回顾性调 。Vero 查研究用 细胞分离发热伴血小板减少综合征 ，，。布尼亚病毒方法敏感分离率较高 3, 2 病毒分离培养技术探讨 1 图 免疫荧光阳性照片3, 2, 1FSTSV 细胞系的选择 人感染后可出现病毒 24 eal )T ime PCR ，6R 份细胞培养液做 检测有 ，。血症从早期患者血中可分离到病毒非洲绿猴肾细 ,5, 。( BHK ) 21) 、A549、可以通过接触传播从接收病人血标本到分离血细胞系人肺腺癌细胞 人胚肺成纤 2BS ，，，。细胞 等是否对病毒敏感尚需实验证实 清一定要带手套和口罩做好个人防护并且在安全 。，柜中操作病人血清接种细胞后病毒的浓度逐渐变 3, 2, 2PH 细胞培养中渗透压与 的掌握 养好细胞 ，、大细胞的换液滴片等操作要在全排式生物安全柜 。是分离病毒的首要条件动物细胞生长的最适渗透 ，，中操作以免发生接触感染和气溶胶感染不具备全 290 : 300mmol / L，pH 7, 2 ) 7, 4。压为 为 如渗透压超 排式生物安全柜条件的实验室不能进行此项病毒分 450mmol / L ，; pH 6, 8 过 细胞增殖终止低于 或高于 。离工作 7, 6 ，将对细胞产生不利影响严重时也可引起细胞退 参 考 文 献 ,3,。变或死亡配制好的培养液放置几天后会逐渐变 ，，pH 。碱颜色会变成紫红色使用时要重新调整 值 ,1,, 李德新发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒概述 3, 2, 3 。 病人血清标本的新鲜度 标本越新鲜越好,J,, ，2011，25 ( 2 ) : 81 )中华实验和临床病毒学杂志 84, ，血标本送来后立即将血清分离出来贴好标签后低温 ,2,Yu XJ，Liang MF，Zhang SY，et al, Fever with Throm-。，保存如果已经有培养好的细胞可以将血清标本作 bocytopenia Associated with a Novel Bunyavirus in Chi-，。无菌处理后立即上细胞这样分离率最高血清标本 na, N Eng J Med，2011，364( 16) : 1523 ) 32,，。避免反复冻融否则会影响病毒的分离率 , eo Vr张丽旌细胞微载体不同培养方法的评价 ,3,,J,, ，2001，12( 2) :9 9 ) 102, 3, 2, 4 ，生物技术通讯中华人民共细胞病变的特点 接种病人血清的细胞在 《》和国国务院病原微生物实验室生物安全 管理条例，第二天一定要换一次维持液因为病人血清对细胞有 ,4,Z,, ,。一定的毒性作用一般传至第三代时细胞会出现空 ，, 陶文元陶欣新型布尼亚病毒感染致发热伴血小板 ,5,、，泡变圆和聚集现象继续培养细胞会出现部分脱落 8 ,J,, ( ) ，减少综合征 例报告江苏大学学报医学版，，。现象此时做细胞滴片用免疫荧光法观察 2011，21( 1): 91 ) 92, :2012 ) 04 ) 03收稿日期 3, 2, 5病毒分离培养中的生物安全问题 实验操作 ( 241 )ulation : Inter )n ational collaborative study of crdaiovas-上接 页 ，，宣传教育让人们形成健康的生活方式对经济条件 cular Disease in Asia. ( InterASIA) . Diabetologia，2003，、， 较好体力活动较少的人群应该注意饮食合理经常 46( 9) : 1190 ) 1198 . ，，，. 白玉银张淑娟杨晓丽等 辽宁省城乡居民糖尿 ，。 参加运动控制体重马鞍山市某区居民糖尿病患病 ,5,J. ,,病及其并发症疾病负担研究中国慢性病预防与 ，，率已经处于较高水平应针对当地人群的特点采取 ，2007，15( 1) :5 2 ) 53.控制 ，、，有效的预防控制措施尤其是一二级预防措施开展 ，，，. 李红刘云方向明等 北川县地震后糖尿病现状 ,6,、 糖尿病健康教育和预防控制以及糖尿病筛查和早诊,J,. ，2010，12，2011:和影响因素调查研究当代护士 ，。早治以控制糖尿病患病上升趋势 70 ) 71. ，，. 2 肖卉王建华职心乐 天津市农村人群 型糖尿病 参 考 文 献 ,7, ,J,. ，危险因素的病例对照研究中华疾病控制杂志 ,1,WHO. Diabetes epidemic in Europe., 2011 )1 1 )1 1, 2010. 14( 2)9 5: ) 98.. Available from: http:/ / www. euro. whion.t / en / what ) oss Tuco Ogan G，et a . Type 2 dabetes RiR，rV，riliiliwe )do / health )t opics / health )d eterminants / sections / ,8,meituss a risk factor for the edveopment of hypertension lllnews /2011 /11 / diabetes )e pidemic )in )e urope. in postmenopausa women. JH ypertens，2006，24 ( 10 ) : lWHO. Diabetes. ,2011 ) 8 ,. Availablefrom: http: / / ,2,2017 ) 2022. www. whoi.n t / mediacentre / factsheets / fs312 / en /. 王寒，，，. 2 马骏王建华王正伦等 型糖尿病与遗传和环境 ，. 旭张德太 我国糖尿病流行病学危险因素分析 ,9, ,3, ,J,. ，2011，37( 4) : 248) 250.现代临床医学 ,J,. ，2001，因素相互关系的研究中华流行病学杂志 36( 3) : 365) 367. ,4, Gu D，Reynolds K，Duan X，et al. Prevalence of diabe- ) 02 ) 16:2012 收稿日期tes and mpaed fastng gucose in the Chnese adut pop- iirilil