宁夏回族人群CYP3A4-6等位基因多态性的研究

宁夏回族人群CYP3A4-6等位基因多态性的研究 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 宁夏回族人群CYP3A4*6等位基因多态 性的研究 (作者:___________单位: ___________邮编: ___________) 作者,李宗吉, 王健, 王惠成, 葛立军 【摘要】 目的 了解宁夏回族人CYP3A4 第9 外显子的分布特点,为宁夏回族患者使用CYP3A4底物药物提供参考依据。方法 收集到180例回族人群血样,应用聚合酶链反应(PCR)特异性扩增人CYP3A4 第9 外显子基因序列,对其进行测序;同时扩增产物用限制性内切酶Hinf?酶切,琼脂糖凝胶电泳后,观察酶切位点的限制性片段长度多态性(RFLP)图谱。结果 运用PCR-RFLP 法分析了150例正常回族人、30例高脂血症回族志愿者基因的突变情况,发现有2例第17776位点有A插入引起移码突变,使2例杂合子CYP3A4基因第9 外显子提前出现终止密码子。其中野生型纯合子频率为98.9 %,杂合子频率为1.1 %,突变型纯合子频率为0,突变等位基因频率为0.005。结论 本研究得到了CYP3A4第9 外显子基因多态性在宁夏回族人群中的分布情况,为研究CYP3A4 第9 外显子基因多态性与临床药物效应的相互关系奠定了基础。 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 【关键词】 回族人群;CYP3A4;等位基因;多态性 细胞色素P450 3A4(CYP3A4),又称硫酸异喹胍羟化酶,是近年来被广泛研究的一种肝微粒体药物氧化代谢多态性酶。该酶基因有很大的种族差异[1],而我国不同民族间该基因多态性的研究资料较少。虽有报道研究了不同地区中国人的CYP3A4 的基因多态性[2-3],但尚无全面研究CYP3A4 二倍体的报道。我们以宁夏回族人群为研究对象,采用限制性片段长度多态性技术(RFLP),对近年来人群中新发现的一种存在于CYP3A4第9外显子上的单个碱基A插入导致的该基因移码突变型进行研究,以期为我国回族该基因的多态性研究提供资料并为宁夏回族患者使用CYP3A4底物药物提供参考依据。 1 对象和方法 1.1 对象 利用2007年1,7月间收集的150例宁夏回族自治区人民医院体检的正常回族人和30例回族病人的外周血为研究标本;全血总DNA提取试剂盒、DNA Tag酶ET-500、DNA Marker B均购自北京赛百盛生物公司。 1.2 方法 1.2.1 DNA样品制备 血样采用北京赛百盛生物公司的硅胶膜基因组提取试剂盒提取基因组DNA,定量后稀释成100μg?μL-1,储存于-20?备用。 1.2.2 引物设计 引物根据GenBank,AF209389序列设计,扩增序列位于CYP3A4全基因序列的第17646bp至17935bp之间,引物序列如下,P1,5’GAGCCATATTCTCAGAAGGGAGATCAAG3’, DOC格式论文,方便您的复制修改删减 P2,5’CAAACATGTGTCGTTCTGCTATGTGG3’合成由大连宝生物工程有限公司完成。 1.2.3 PCR扩增目的基因片段 用前述的1对引物P1,P2扩增包括第9外显子多态位点的DNA片段。PCR反应体系为50μL,含有0.2 mmol?L-1 dNTP,1.0mmol?L-1引物,1.25 mmol?L-1 MgCl2,0.5 U Taq DNA聚合酶,10×PCR反应缓冲液。反应条件如下,94?4m,94?45s,69?45s,72?1m,35cycle;72?,7m。 1.2.4 PCR扩增产物的HinfI酶切鉴定 将扩增出的包含第9外显子多态位点的目的片段用限制性内切酶Hinf?进行酶切鉴定,在37?水浴锅中孵育2h。 1.3 电泳及结果的统计分析 取PCR扩增产物及HinfI酶切产物用3% 琼脂糖凝胶进行电泳,在BioRad的Quantity One 凝胶成像分析系统仪上进行观察和分析。确定CYP3A4第9外显子基因型,进行基因频率的计算分析。 2 结果 2.1 DNA提取质量 经紫外分光光度计检测,180名受试者外周血白细胞中提得的DNA A260/A280均在1.8,2.0之间,DNA纯度符合要求[4]。 2.2 PCR及酶切电泳结果 见图1。用引物P1,P2扩增得到290bp含有第9外显子多态位点的CYP3A4基因片段即CYP3A4*6,以限制性内切酶Hinf?酶切扩增的目的片段,野生型基因片段经酶切 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 消化可产生153 bp,137 bp片段,突变型基因片段经酶切消化可产生137 bp 、129 bp、 24 bp片段。 2.3 180例宁夏回族人群CYP3A4第9外显子基因及基因频率 见表1。表1 180例宁夏回族人群CYP3A4第9外显子基因及基因型频率 3 讨论 CYP3A4在表达水平上呈现出显著的个体差异性,这些差异可能是由遗传、环境、病理、激素和饮食因素引起,遗传多态性是个体药物代谢差异最通常的来源,CYP3A4遗传多态性近年来才为人所了解[5]。到目前为止,多种CYP3A4等位基因已经被发现。CYP3A4 的这种个体差异在其代谢的底物间可达20,40 倍。研究表明[6],人体内约有50 %以上的药物有CYP3A4 参与催化代谢,CYP3A4 基因表达上的差别则与药物作用强度和持续时间、急性毒性密切相关。众所周知,CYP3A4 酶的生成受遗传基因的调控,因此一旦基因发生变异,它调控生成的CYP3A4 酶和酶所催化的药物代谢即发生变化。因此,CYP3A4 基因的多态性是构成药物代谢个体差异和种族差异的基础。 本文利用PCR 技术扩增了CYP3A4第9外显子片段,经HinfI消化,证实了在宁夏回族人群中CYP3A4第9外显子区域同样存在突变,其中突变等位基因频率为 0.005。本研究得到了CYP3A4第9 外显子基因多态性在宁夏回族人群中的分布情况,也为今后研究CYP3A4 第9 外显子基因多态性与疾病间的相互关系奠定了基础。 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 【参考文献】 [1] Sata F,Sapone A,Elizondo G,et al.CYP3A4 allelic variants with amino acid substitution in exons 7 and 12,evidence for an allelic variant with altered catalytic activity[J].Clin pharmacol Ther,2000(7),48-56. [2] 黄敏,汪晖,平洁,等.中国大陆汉族人群CYP3A4基 因变异分析[J].中国临床药理学与治疗学,20O5,11(3),300-304. [3] Lamba JK,Lin YS,Thummel K,et al.Common allelic variants of cytochrome P4503A4 and their prevalence in different populations[J].Pharmacogenetics,2002,12,121-32. [4] J萨姆布鲁克,DW 拉寒尔.分子克隆实验指南[M],2 卷.上册.黄培堂,译.北京科学出版社,2002. [5] Eiselt R,Domanski TL,Zibat A,et al.Identification and functional characterizations of eight CYP3A4 protein variants[J].Pharmagenetics,2001,11,447-458. [6] Henry J Mann,Pharm D.Drug-Associated Disease, Cytochrome P450 Interactions[J].Crit Care Clin,2006,22,329-345. DOC格式论文,方便您的复制修改删减